人工湿地将污水借助于基质、 植物以及微生物等协同作用，将污染物去除^[1]. 表流湿地总氮(TN)去除率较高，且费用低、 去污能力强，运营简便，得到了极大的推广与利用^[2]. 其中，湿地细菌参与了污染物的分解与转化，是人工湿地去污机制中的重要一环. 有报道称有细菌参与的硝化反硝化去氮量占氮去除总量的60%～86%^[3]，在氮去除方面占有举足轻重的地位. 因而研究人工湿地细菌群落结构，了解人工湿地，尤其是表流湿地的优势细菌群落及分布特征，对从微观角度认识湿地污染物去除机制有着重要的作用. Ligi等^[4]运用高通量测序技术，发现γ-Proteobacteria、 δ-Proteobacteria和β-Proteobacteria是人工湿地最丰富的细菌类群. 也有学者研究发现，α-Proteobacteria、 Actinobacteria和Bacteroidetes为最为丰富的细菌类群^[5]. 此外，还有研究发现湿地细菌虽对营养元素循环具有重要作用，却也对外部环境敏感度较高^{[6, 7]}. 近年来，对于人工湿地空气细菌群落、 植物根际细菌群落以及自然河流、 滨海湿地细菌群落多样性研究较多^[8~11]，但主要集中于利用DGGE等传统方法，探究细菌群落结构或对各种类型废水净化效率的影响. 对湿地细菌群落的空间分布及其与外部环境间的关系的研究比较少.

本研究区位于北京市顺义区的北京市野生动物救护与繁育中心的复合流人工湿地中表流处理单元，由于野生动物救护与繁育中心属未向游客开放单位，减少了人为要素对细菌环境的影响，采用了Miseq高通量测序的方法进行了沿水流方向的不同处理单元的细菌群落结构分析，利用冗余分析(redundancy analysis，RDA)对其与环境因子的关系进行了探究，以期能为表流湿地细菌群落结构的空间分布以及细菌环境影响因子的研究提供重要依据，并对湿地中的微生物研究提供了部分基础的数据，以期为深入探讨人工湿地净化水质的微生物机制提供一定的理论依据.

1 材料与方法 1.1 样点位置和样品采集

研究区位于北京市顺义区的北京市野生动物救护与繁育中心，在人工湿地表流处理单元共布设10个样点(A1~J1). 各处理单元的优势物种分别为: 香蒲(Typha orientalis)、 凤眼莲(Eichhornia crassipes)、 菖蒲(Acorus calamus)、 慈姑(Sagittaria sagittifolia)、 针蔺(Eleocharis congesta)、 荇菜(Nymphoides peltatum)、 水芹(Oenanthe javanica)、 雨久花(Monochoria korsakowii)、 黑三棱(Sparganium stoloniferum)、 鸢尾(Iris tectorum). 于2015年5月，采用S型5点取样法进行剥离表层沉积物的底泥采集，取样深度为0~10 cm. 上覆水在上述底泥采集点周围采集3个重复，将底泥保鲜带回实验室-80℃冷冻保存，用于后续分子生物学分析； 上覆水样带回实验室4℃保存，作为环境因子分析.

1.2 16S rDNA的提取与PCR扩增检查

DNA的提取主要利用Omega试剂盒(OMEGA Soil DNA Kit)进行并提取后，用引物^[12]27F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R: 5′-TACCTTGTTACGACTT-3′，扩增提取宏基因组DNA的16SrDNA. PCR试验采用TransGen AP221-02: TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20 μL反应体系: 5×FastPfu Buffer(4 μL)，2.5 mmol·L^-1 dNTPs(2 μL)，Forward Primer(5 μmol·L^-1,0.8 μL)，Reverse Primer(5 μmol·L^-1,0.8 μL)，FastPfu Polymerase(0.4 μL)，Template DNA (10 ng)，补ddH₂O至20 μL.

PCR仪为ABI GeneAmp^®9700型，PCR反应参数: 95℃ 3 min； 95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，27个循环； 72℃ 10 min. 全部样本使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱； 2%琼脂糖电泳检测.

1.3 Miseq文库构建与测序

用QuantiFluor-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)检测定量PCR产物，之后进行相应比例的混合. 连接“Y”字形接头后，利用磁珠对接头自连片段进行去除，利用PCR扩增进行文库模板的富集，氢氧化钠变性后，产生单链DNA片段. 利用桥式PCR和可逆性末端终结技术^[13]，依照Illumina MiSeq平台的标准测试方法进行高通量测序，统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列.

1.4 细菌多样性数据分析

应用Usearch软件将所有优化序列Map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格. 利用Mothur软件分析^[14]ACE指数(估计群落中OTU数目)，香农-威纳指数 (H′)(Shannon-Weiner，估算样品中细菌多样性指数之一，值越大说明群落多样性越高)，用于指数评估的OTU相似水平为97%.

1.5 细菌分类学分析

使用Qiime平台与RDP Classifier^[15]贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，对比SILVA数据库^[16]，统计每个样品的群落组成. 如若分类学数据库中出现一些分类学谱系中的中间等级没有科学名称，以norank作为标记. 分类学比对后根据置信度阈值的筛选，有某些分类谱系在某一分类级别分值较低，在统计时以Unclassified标记.

1.6 水体理化指标测定

温度(Temp)、 氧化还原电位(ORP)、 pH等指标采用YSI-EXO(YSI，USA)便携式多参数水质分析仪现场同步测定. 总氮(TN)、 氨氮(NH₄⁺-N)、 硝氮(NO₃^--N)、 亚硝氮(NO₂^--N)等指标测定方法按照文献^[17]测定，所使用仪器为SMARTCHEM200(WestCo，USA)全自动化学分析仪.

1.7 统计分析

利用SPSS 20.0分析水体中指标参数与细菌群落结构的关系. 采用主成分分析(PCA)方法对环境因子进行筛选，冗余分析(RDA)研究水体细菌群落和水体环境因子之间的关系，所用软件为R语言与Canoco 5.

2 结果与分析 2.1 水体理化性质

表流湿地沿水流方向不同处理单元水体环境理化因子由表 1所示. 总体pH都处于7以上，但均未超过8； 电导率(SpCond)、 总溶解固体(TDS)、 盐度(Salinity)、 氧化还原电位(ORP)均呈现先升高后降低的趋势，前三者波动性较小，后者波动性较大； 温度(Temp)的变化幅度不大，均在22~25℃ 之间波动； 浊度(Turbidity)则与其他指标相反，呈现了先降低后升高的变化.

表流湿地各种形态氮含量变化如图 2所示，从中可以看出各采样点总氮(TN)含量基本处于国家Ⅱ 类与Ⅲ 类水标准之间，随流动方向有降低的趋势. 其中氨氮(NH₄⁺-N)与亚硝氮(NO₂^--N)含量相对硝氮(NO₃^--N)较高. 除硝氮呈现了明显降低趋势外，其他指标均出现了先升高后降低的趋势. 总体看来，表流湿地具备一定的去除氮的能力.

2.2 细菌多样性和丰度

如图 3所示，10个样品按相似度97%进行聚类分析得到的OTU数量平均为3 044个，利用香农-威纳指数(Shannon-Weiner index,H′)比较分析10个样点中的细菌多样性，结果平均H′达6.57，总体呈现先升高后降低的趋势，其中最高值6.94出现在F1处理单元，菌群丰度ACE指数均值达到了3 704，与多样性的变化趋势十分接近，也在F1处理单元出现了最高值4 070.

2.3 细菌群落结构

提取97%相似水平的OTU代表序列，应用RDP classifier^[15]贝叶斯算法进行分类学分析，得出门、 属两个水平的各个样品细菌群落结构组成. 统计其在门类别上的构成形成柱状图(图 4)，同时分析在各个水平上的菌群结构. 结果显示检测所得OTU主要属于18个门类，分别是Proteobacterice(38.97%)、 Bacteroidetes(15.63%)、 Chloroflexi(8.1%)、 Acidobacteria(8%)、 Firmicutes(7.2%)、 Planctomycetes(5.55%)、 Chlorobi(3.23%)、 Actinobacteria(2.37%)、 Spirochaetae (1.38%)、 Cyanobacteria(1.23%)、 Nitrospirae(1.04%)，剩余门类归为待定菌群(Candidate_division_WS3、 Candidate_division_OP8、 Bacteria_unclassified，3.16%)和稀有细菌类别 (Lentisphaerae、 Gemmatimonadetes、 Fibrobacteres，1.27%). 各采样点的优势菌均为Proteobacterice.

对不同处理单元的不同门类细菌所占比重进行均值分析，如图 5所示. 其中Proteobacterice的比重均值为0.39，此外均值较高的门类为Bacteroidetes、 Chloroflexi、 Acidobacteria、 Firmicutes、 Planctomycetes. 对不同处理单元的不同门类细菌所占比重进行方差分析，发现菌群变化主要集中在Firmicutes、 Proteobacteria、 Acidobacteria、 Bacteroidetes、 Chloroflexi、 Planctomycetes. 比重所占较高的门类细菌方差也较高，说明不同处理单元的细菌结构变化主要发生在了所占比重较高的细菌门类上.

此外，菌群丰度大于1%的共有22个属，为Comamonadaceae_unclassified (4.54%)、 Anaerolineaceae_uncultured (4.53%)、 Lactococcus (3.6%)、 Subgroup_6_norank(3.46%)、 vadinHA17_norank (2.81%)、 WCHB1-69_norank (2.43%)和Nitrosomonadaceae_uncultured(1.88%)、 Thiobacillus(1.78%)、 Saprospiraceae_uncultured(1.43%)、 Polaromonas(1.37%)、 Rhodocyclaceae_unclassified(1.38%)、 Comamonas(1.33%)、 Hydrogenophaga(1.27%)、 Xanthomonadales_norank(1.32%)、 Flavobacterium (1.21%)、 SC-I-84_norank (1.17%)、 Xanthomonadales_uncultured (1.13%)、 Candidate_division_OP8_norank(1.05%)、 Caldilineaceae_uncultured(1.03%)、 Candidate_division_WS3_norank(1.03%)、 Pirellula(1%)、 BSV26_norank(1%).

应用Bray-Curtis距离算法和complete聚类方法，将高丰度和低丰度的物种分块聚集，通过颜色梯度及相似程度来反映多个样本在各分类水平上群落组成的相似性和差异性，如图 6所示，蓝色相似度最差，红色相似度最高. 结果表明，最高相似度为25.2%，整体相似度较低. 采样点A1、 C1、 I1、 J1与B1、 D1、 E1、 F1、 G1、 H1菌群群落组成相差较大，其中A1与C1，I1与J1菌群群落组成较为相近，这与水体理化性质的变化较为相似，可能是水体环境因素影响了细菌群落组成. 各采样点样本Anaerolineaceae_uncultured、 Comamonadaceae_unclassified、 WCHB1-69_norank、 vadinHA17_norank、 Lactococcus、 Subgroup_6_norank相对丰度都较高，A1与J1有明显差异.

2.4 细菌与环境因子的关系

以水体理化因子为主要环境因子，对其以主成分分析法(PAC)进行主成分提取，方差最大化正交旋转后(P=0.05)，提取了3个主成分，贡献率分别为0.508、 0.249、 0.129. 第一主成分主要反映了TDS、 SpCond、 Salinity的影响，因子载荷系数分别为-0.471、-0.470、-0.459； 第二主成分主要反映了ORP、 pH、 Turbidity的影响，因子载荷系数分别为-0.654、-0.449、 0.418； 第三主成分主要反映了Temp的影响，因子载荷系数分别为-0.563. 不同环境因子的载荷分布特征表明该表流湿地的主要环境因子包括SpCond、 TDS、 pH和ORP(图 7).

通过OTU数量、 ACE指数以及H′与不同外部环境因子的皮尔逊相关性分析(表 2)，发现细菌丰度与ORP、 pH、 TN、 NO₃^--N、 NH₄⁺-N、 NO₂^--N均有一定相关性，其中与ORP、 NO₂^--N的相关性最大.

对水体理化环境因子与细菌主要菌落(属)所占比重进行中心标准化，并进行校正(蒙特卡洛置换检验)，提取第一与第二坐标轴信息，对方差总解释率为61.03%，从而形成冗余分析(RDA)，图 8中直接看出物种群落分布与环境因子之间的关系，结果表明Hydrogenophaga、 Pirellula、 Polaromonas、 WCHB1-69_norank、 Anaerolineaceae_uncultured、 Flavobacterium、 Thiobacillus与水中氮相关指标呈正相关关系，而SC-I-84_norank、 Nitrosomonadaceae_uncultured、 Subgroup_6_norank、 Xanthomonadales_norank与其则呈负相关关系. ORP、 pH等理化指标与上述关系相反. Comamonadaceae_unclassified、 Saprospiraceae_uncultured、 Comamonas、 Rhodocyclaceae_unclassified、 Xanthomonadales_uncultured与TDS、 SpCond呈正相关关系，而BSV26_norank、 vadinHA17_norank、 Caldilineaceae_uncultured、 Lactococcus 、 Candidate_division_OP8_norank、 Candidate_division_WS3_norank则与其呈负相关关系.

3 讨论

本研究中，氨氮的去除率较低，仅为1.6%，但总氮去除率却达到了31.01%，从进水到出水，氨氮含量变化不明显，氮元素的去除，主要集中在了硝氮、 亚硝氮与其他形态氮(多数为有机氮)上. 此外，氨氮、 硝氮与亚硝氮的总和在各处理单元均只占总氮含量的较少一部分. 说明表流湿地入水的无机氮较少，绝大部分还处于有机氮形态，继而在沿程各处理单元，氮处理的环节首先集中在了氨化作用. 由于氨化过程快于硝化过程^[4]，使得水体、 沉积物的有机氮不断释放，加之C1处理单元面积较小，性状狭窄，不利于水体存留，使得水体流动速度大，水力停留时间短，没有给水体充分处理时间. 因而出现随水体流动方向，总氮含量先升高后降低，但总体呈现降低的趋势.

细菌多样性在流动水体与静止水体分别受制于不同影响要素，流动性较大的表流湿地会受到以细菌群落间相互影响为主的内部环境与细菌生存的外部环境相互作用^[18]. 有学者研究发现，在水平潜流人工湿地中，细菌群落数量随深度和排污口距离的增加而减少^{[19, 20]}. 因而污染物浓度越大，可以促使细菌多样性越丰富，研究中的总氮含量呈现了波动性变化，进而使得细菌多样性也呈现了先升高后降低的波动性变化，但总体呈现了多样性指数降低的趋势，且A1与C1，I1与J1菌群群落组成较为相近，与上述研究得出的结果相似. 进一步探究外部环境因子与OTU数量、 Ace以及H′间的相关性发现，细菌多样性、 丰度均与TN、 NO₃^--N、 NH₄⁺-N、 NO₂-N均处于正相关关系，证实了上述结果.

通过进一步分析细菌群落结构组成，发现沿程各处理单元细菌群落优势门Proteobacterice主要是由以下纲组成: α-Proteobacteria(4.63%)、 β-Proteobacteria(19.42%)、 γ-Proteobacteria(6.71%)、 δ-Proteobacteria(7.8%). β-Proteobacteria作为优势门中的优势纲，有研究表明其在淡水环境中常见^[22]，丰度受到营养元素浓度以及pH影响^[23]. 此外，优势门Bacteroidetes(15.63%)下的Flavobacteria(1.63%)、 Cytophagia(1.57%)，在湿地中较为常见，有报道称具有硝化作用^[24]. 硝化作用依赖于废水中氨氮浓度的大小^[25]，同时较高浓度的硝酸盐会促进反硝化作用^[26]. 因而沿程不断补充的氨氮，使得表流湿地沿程细菌多样性均处于较高水平，随后硝化作用产生的硝氮、 亚硝氮促进了反硝化作用，进而发生了群落结构的变化. 另外，在本研究中发现Thiobacillus与总氮的浓度存在极强的正相关关系，虽然该属为硫杆菌属，与硫元素相关极强，但该属下存在Thiobacillus denitrificans，即脱氮硫杆菌，是一种反硝化细菌，导致这种较强的关联. 该属与氨氮、 硝氮、 亚硝氮也存在着正相关关系. 与之相反的是Nitrosomonadaceae_uncultured，硝化杆菌科内的一属，其与与氮元素相关的指标，尤其是总氮存在着负相关关系. 这种关系说明细菌的硝化与反硝化作用，对水中氮去除有着很大关联.

细菌多样性除受到上覆水营养元素的影响，主要还受到了其他环境因子的影响. 水体的导电率反映了水体的含盐量，其中细菌群落比重最大的属Comamonadaceae_unclassified与导电率产生了较强的正相关作用，但导电率却对整体细菌丰度并未产生极强的影响，这说明该表流湿地水体导电率中的水体含盐种类可能仅对部分微生物产生了影响，如上文对含氮盐类与个别细菌属间的相关性，而对其他细菌影响较弱. 氧化还原电位表现了水体的氧化性与还原性，其中与其呈正相关作用的细菌属则适宜生存在氧化性较强的环境中，如具有硝化功能的Nitrosomonadaceae_uncultured等. 此外，该表流湿地的pH虽变化较小，但由于一些细菌因其对pH的较高敏感性，而使得pH对有其参与的净化过程影响较大，例如硝化作用的最适pH值是7.0～8.0^[25].有学者研究发现表流湿地TN进水浓度与出水浓度存在显著线性相关关系^[27].表流湿地pH值沿水流方向变化不大，总体都呈现弱碱性，其中氨氮浓度呈现沿水流方向逐渐降低的趋势^[28]. 本研究发现由于表流湿地水中的pH受到初始入水pH影响较大，但沿程氨氮的浓度始终变化不大，使得表流湿地沿程pH值一直处于弱碱性，这种弱碱性较酸性条件更有利于细菌异养活动^[29]. 因而与水中的pH以及N元素含量相关^[24]. 在本研究RDA分析中，β-Proteobacteria下的Nitrosomonadaceae_uncultured与水中氮相关指标呈负相关关系，与pH呈正相关关系但Flavobacteria下的Flavobacterium与水中氮相关指标呈正相关关系，与pH呈负相关关系，与已有研究得出的结果一致^[24].

4 结论

(1) 随水体流动方向，总氮含量先升高后降低，但总体呈现降低的趋势，而细菌多样性也呈现了先升高后降低的波动性变化，但总体呈现了多样性指数降低的趋势.

(2) 细菌群落多样性指数(香农-威纳指数)平均值为6.57，细菌群落主要属于Proteobacterice (38.97%)、 Bacteroidetes(15.63%)等18个门类，丰度大于1%的共有22个属.

(3) 细菌丰度与pH、 ORP、 NH₄⁺-N、 NO₂^--N、 TN均有相关性，但不同细菌受到的环境因子影响差异较大，其中受不同含氮元素影响的细菌较为类似.