2016, Vol. 37
2. 苏州科技大学环境生物技术研究所, 苏州 215009
2. Institute of Environmental Biotechnology, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China
厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation,ANAMMOX)技术因具有无需有机碳源及氧的供给等优势得到了人们的一致认可，并且被认为是最经济高效的脱氮工艺[1, 2]. ANAMMOX反应需要NO2--N作为电子受体，因此绝大部分联合工艺均采用短程硝化(partial nitrification，PN)作为ANAMMOX的前置工艺[3, 4]. 目前，PN-ANAMMOX工艺已成功运用于半导体废水[5]、 养猪废水[6]、 污泥消化液[7]等含氨废水的脱氮处理.
亚硝化菌(ammonia oxidizing bacteria，AOB)和ANAMMOX菌的最适宜温度在30~35℃之间[8, 9]. 为了保证PN-ANAMMOX联合工艺高效稳定的运行，一般采用加热的方式保证反应器内的最适温度. 因此，温度不仅是PN和ANAMMOX过程的重要控制参数，也是联合工艺运行过程中耗能最大的因素之一[10]. 为了降低能耗，使得PN-ANAMMOX联合工艺能够运用于气候比较低的寒冷地区，一些研究者也在常温甚至低温的环境下成功地驯化出PN、 ANAMMOX功能微生物，实现PN-ANAMMOX工艺联合脱氮[11, 12].
然而，中常温变化对PN-ANAMMOX联合工艺到底有多大影响，主要对哪个过程产生影响，对微生物群落的影响如何，目前鲜见报道. 同时，针对我国南北气候的差异，在选取PN-ANAMMOX联合处理含氨废水时，常温乃至低温运行是否可取，如何解决低温对联合工艺的影响是需要解决问题. 为此，本文选取中温(32℃)和常温(22℃)，研究了2个温度变化对PN-ANAMMOX联合工艺脱氮能力及微生物群落的影响，并进一步分析了其对氮素转化过程主要影响，旨在为联合工艺运用于不同区域时提供理论参考.
1 材料与方法 1.1 试验装置试验装置由有机玻璃制成(图 1)，总有效体积12.95 L，包括好氧区、 厌氧区和沉淀区，体积分别为9.25、 2.1、 1.6 L. 运行过程中，初始HRT设定为4.52 h； 将沉淀区出水回流至好氧区，回流比设定为8； 连续流进水，流量由蠕动泵控制； 通过微孔曝气盘提供溶解氧，曝气量由转子气体流量计控制； 温度由水浴箱调控. 好氧区的ORP值控制在120~150 mV，厌氧区ORP值在(-150±50) mV区间波动，由WTW在线监控.
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图 1 PN-ANAMMOX联合工艺流程示意 Fig. 1 Schematic of the PN-ANAMMOX process |
好氧区接种的PN生物膜取自本实验室中温中试亚硝化反应器，亚硝化速率(ammonia conversion rate，ACR)0.2 kg·(m3·d)-1左右，亚硝化率60%左右. 经过半个月的快速启动，出水NO2--N/NH4+-N达到1左右. 满足ANAMMOX菌对基质利用要求，ACR稳定在1 kg·(m3·d)-1左右，亚硝氮积累率95%以上. 厌氧区接种ANAMMOX颗粒污泥取自本实验室长期运行的中温ANAMMOX反应器，主要细菌种类为Candidatus Brocadia sinica(KP721346-KP721365)，污泥呈现砖红色，VSS/SS: 0.22，氮负荷(nitrogen loading rate,NLR)5 kg·(m3·d)-1左右，TN去除率稳定维持在80%以上.
1.3 试验用水本试验采用人工配水，其中NH4+-N由NH4HCO3提供，无机碳源由NaHCO3提供. 矿物质元素组成[13]为: MgSO4·7H2O 0.3 g·L-1、 KH2PO4 0.027 g·L-1、 CaCl2 0.136 g·L-1、 NaHCO3按需投加. 微量元素Ⅰ、 Ⅱ浓度分别为: 1.0 mL·L-1、 1.25 mL·L-1. 微量元素Ⅰ成分(g·L-1)为: FeSO4 5、 EDTA 5； 微量元素Ⅱ成分(g·L-1)为: EDTA 5、 CuSO4·5H2O 0.25、 ZnSO4·7H2O 0.043、 MnCl2·4H2O 0.99、 CoCl2·6H2O 0.24、 H3BO4 0.014、 NaMoO4·2H2O 0.22、 NaSeO4·10H2O 0.2. 进水pH值为7.8~8.2，1 mol·L-1 HCl或投加NaHCO3调节.
1.4 分析项目与测定方法 1.4.1 常规项目指标测定方法均按照文献[14]. NH4+-N: 钠氏试剂分光光度法； NO2--N、 NO3--N: 离子色谱法； pH、 ORP和T: WTW在线监测仪； 悬浮质SS、 挥发性悬浮质VSS: 重量法.
1.4.2 实时荧光定量PCR分析本研究采用基于SYBR Green Ⅱ法的实时荧光定量PCR对反应器启动前后功能微生物群落进行了定量分析，主要功能菌包括AOB、 亚硝酸盐氧化菌(nitrite oxidizing bacteria，NOB)及ANAMMOX菌. 定量PCR所采用的引物如表 1所示. 采用Eppendorf扩增仪对上述功能菌群进行定量扩增. 扩增体系为10 μL，包括5 μL 2xSYBR Green ExTaq Mix，0.25 μL正反向引物(20 mmol·L-1)、 1 μL DNA模板、 3.5 μL ddH2O. 试验步骤及操作均参照文献[15, 16]. 为了确保数据的可靠性，每个污泥样品设置3组平行. 目标菌种的定量标准曲线R2均大于0.99，扩增效率处于90%~110%.
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表 1 AOB、 NOB、 ANAMMOX菌和全菌PCR 扩增中采用的引物 Table 1 PCR primers targeting at AOB，NOB，ANAMMOX and the total bacteria |
1.5 试验方法
采用模拟高氨废水，在稳定运行的PN基础上接种ANAMMOX颗粒污泥，实现联合脱氮. 试验主要分为2个阶段. 阶段1温度控制在22℃左右，阶段2控制在32℃左右. 考察PN的稳定情况以及ANAMMOX的氮素去除情况.
本研究所涉及到的氮素转化计算公式如下，进水氨氮负荷、 去除速率均以容积负荷表示.
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FA浓度(以N计)按如下公式计算[17]:
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(5) |
式中，ΔN为进出水TN差值，单位mg·L-1； [NH4+-N]inf、 [NH4+-N]eff表示进出水NH4+-N浓度ACRa表示亚硝化速率、 NRRana表示ANAMMOX区氮素去除速率、 NRRT表示整体的氮素去除速率，单位均为kg·(m3·d)-1； HRTa、 HRTana、 HRTT表示好氧区、 ANAMMOX区以及整体的水力停留时间，单位d； T为温度，单位℃.
2 结果与讨论 2.1 中常温变化对PN-ANAMMOX联合工艺的影响由于直接接种相应的功能微生物，所以试验初期PN-ANAMMOX联合工艺就实现了高效的脱氮. 由图 2可知，阶段1，运行至第2 d，TN去除率上升较为明显，出水NH4+-N浓度降低到18.96 mg·L-1. 随后进水NH4+-N浓度经历了2次提升，当浓度提高至330 mg·L-1左右，出水NH4+-N浓度升高至50 mg·L-1左右，TN去除率呈现下降趋势； 当浓度提高至380 mg·L-1左右，出水NH4+-N浓度高达140 mg·L-1左右，TN去除率降低至55%左右. 为了避免FA浓度过高对ANAMMOX菌产生影响[18]，随后将HRT由4.52 h延长至5.43 h，出水NH4+-N浓度仍然较高，从第19 d开始降低进水NH4+-N浓度至280 mg·L-1左右，出水NH4+-N浓度有所下降，但是仍然达到80 mg·L-1左右. 继续降低进水NH4+-N浓度至200 mg·L-1左右，出水NH4+-N浓度稳定在50 mg·L-1左右，TN去除率维持在65%左右. 此阶段联合工艺的NRR由初期的1 kg·(m3·d)-1逐渐下降，最终稳定在0.5 kg·(m3·d)-1左右. Vázquez-Padín等[19]在20℃的条件下启动PN-ANAMMOX联合工艺，最大脱氮速率0.7 kg·(m3·d)-1. Lotti等[11]在15℃下启动PN-ANAMMOX联合工艺，最大脱氮速率仅0.4 kg·(m3·d)-1. 因此，常温虽然能够实现PN-ANAMMOX工艺的联合脱氮，但是脱氮速率均比较低，还易导致出水水质恶化.
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图 2 PN-ANAMMOX联合工艺氮素去除 Fig. 2 Nitrogen removal performance of the PN-ANAMMOX process |
阶段2，从41~65 d，将温度提高至32℃左右，PN-ANAMMOX脱氮能力增强，第41 d出水NH4+-N浓度下降至6.05 mg·L-1，随后不断提高进水NH4+-N浓度. 运行至第50 d，当进水NH4+-N浓度提升至450 mg·L-1左右，出水NH4+-N浓度仍处于10 mg·L-1以下，TN去除率上升趋势较为明显，高达87.98%，运行较为良好. 随后进水NH4+-N浓度维持在500mg·L-1左右，运行较为稳定，TN去除率达到80%以上. 整体NRR得到了恢复，并超过初期水平，达到1.75 kg·(m3·d)-1左右，是常温下稳定运行时最低脱氮速率的3.5倍. Qiao等[20]在35℃下启动PN-ANAMMOX联合工艺，其最大脱氮速率达到1.69 kg·(m3·d)-1. Sliekers等[21]在32℃下启的单一的部分PN-ANAMMOX联合工艺，其最大脱氮速率达到1.42 kg·(m3·d)-1. 说明在中温的条件下，AOB和ANAMMOX菌的活性比较高，更有利于PN-ANAMMOX脱氮速率的发挥.
2.2 中常温度变化对亚硝化区的影响及控制温度对亚硝化区的影响主要表现在影响AOB、 NOB比生长速率. 温度高于15℃，AOB的生长速率大于NOB，一般建议PN过程温度控制在25℃以上[22].
在阶段1，由于温度维持在22℃时，AOB活性出现明显下降，出水NH4+-N浓度升高，NO2--N/NH4+-N比例下降，最终稳定在0.8左右(图 3). ACR由启动初期的1 kg·(m3·d)-1左右逐渐下降，最终维持在0.5 kg·(m3·d)-1左右，下降幅度达到50%. 但NO2--N积累率一直维持在99%以上，说明NOB未获得富集，PN过程较为稳定. 阶段2将温度控制在32℃左右，是AOB较为适宜的温度范围. 亚硝化能力快速增强，与此同时采用提高进水NH4+-N浓度的方式进行氮负荷提升，ACR上升较为明显. 当进水NH4+-N浓度提高到500mg·L-1左右ACR达到1.75 kg·(m3·d)-1左右. 与此同时出水NO2--N/NH4+-N在1.3左右，满足ANAMMOX反应配比.
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图 3 氮素浓度、 负荷、 去除速率以及亚硝氮积累率的变化 Fig. 3 Variations of nitrogen compounds concentration,NLR,NRR and nitrite accumulation rate |
当反应器温度调到32℃后，虽然ACR能力获得快速提升，但发现出水NO3--N浓度出现了急剧升高的现象. 亚硝氮积累率下降，低至81.85%，根据PN-ANAMMOX反应化学计量关系，产生的NO3--N与NH4+-N去除比的理论值为11%. 由图 4可知，从43 d开始，NO3--N的占比升高，高达30%，PN出现了失稳现象. 分析其原因主要有两方面: 一是在负荷提升过程中随着ACR能力增强，曝气量不断加大，同时出水NH4+-N浓度降低，FA对NOB的抑制能力减弱，因此NOB有充足的氧和NO2--N作为营养基质； 另一方面，温度的上升，也有利于NOB的快速的生长. 从第45 d开始，通过加大回流量来抑制NOB的活性. 本研究采用的联合工艺加大回流量具有以下作用: 回流量加快有利于PN过程中产生的NO2--N及时被输送至厌氧区被ANAMMOX菌消耗，从而避免好氧区出现的NO2--N积累，NOB因缺乏基质而被抑制； 好氧区PN过程pH下降，厌氧区ANAMMOX反应pH上升，加大回流量可以加速厌氧区与好氧区的pH调节，维持好氧区pH,维持一定的FA浓度来抑制NOB[23]. 与此同时，通过提高进水NH4+-N浓度进行氮负荷提升，Yusof等[24]报道提高进水NH4+-N负荷，AOB将有更多的底物利用，其生长速率加快. 在此阶段，出水NH4+-N浓度升高更有利于短程硝化的稳定[25].
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图 4 pH、 ORP以及出水硝氮与氨氮去除占比的变化 Fig. 4 Changes of pH,ORP and NO3--Nproduced/NH4+-Nconsumed ratio |
在PN失稳过程中，由于硝化作用的发生，碱度出现过度消耗，不足以维持厌氧区的酸碱环境，好氧区pH值也出现了波动，下降至7.5以下. 本研究采用ORP作为好氧区DO的控制参数. 在PN失稳期间，由于硝化过程耗氧量增大，出水NO3--N升高，ORP从200 mV急剧下降至50 mV以下. 与Kocamemi等[26]的研究结果一致. 实践表明，在运行过程中关注ORP的变化，可以直观地反映PN过程的运行情况. 在运行过程中维持其稳定即可，避免大幅波动.
2.3 中常温度变化对ANAMMOX反应的影响厌氧区脱氮速率的变化如图 5所示. 在阶段1，温度22℃左右，AOB活性较PN启动阶段相比有所下降，ACRa的降低导致NO2--N的供给不足使得ANMMOX菌处于饥饿状态，ANAMMOX菌脱氮能力下降，最终稳定在3.5 kg·(m3·d)-1左右. 据报道ANAMMOX反应最为适宜的温度在中温条件，最佳控制在35℃左右[18]. 阶段2，将温度提高至32℃左右，亚硝化能力恢复，ANAMMOX菌的NRR也随之上升，NRRana最高达到11 kg·(m3·d)-1左右.
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图 5 厌氧区氮素负荷和去除速率的变化 Fig. 5 Variations of NLRana and NRRana |
另外从图 2可知，在阶段1出水NO2--N并未出现积累的现象，说明在短期内ANAMMOX菌NRR的降低主要是因为基质供给不足所导致的. PN作为ANAMMOX反应的限制性步骤，PN过程亚硝化能力大小对整体的脱氮速率起到决定性作用. 温度作为PN过程重要控制因子，温度的变化容易对其稳定性以及转化速率产生影响，进而影响整个联合工艺的脱氮速率.
在实际运行过程中，低温虽然能够实现PN-ANAMMOX联合脱氮，但是并不能使得PN-ANAMMOX工艺的微生物充分发挥氮素转化能力. 在气候比较低的地区，采用联合工艺进行废水脱氮时应尽可能地保证适宜的温度. 在无法满足最适宜温度的地区，为了保证ANAMMOX微生物的脱氮速率，在好氧区与厌氧区的体积配比上应尽可能地扩大，以保证厌氧区有充足的基质供应.
2.4 各区域功能微生物的定量分析取PN-ANAMMOX联合运行第1、 40和56 d的污泥样品，污泥均取自反应器中部区域，对其中的AOB、 NOB和ANAMMOX菌进行定量分析，结果图 6所示.
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图 6 各区域功能菌的定量结果 Fig. 6 Quantification of the functional bacteria in each area |
由于接种的污泥为成熟的PN和ANAMMOX污泥，所以不同污泥中的主要微生物基本是相应的功能微生物. 亚硝化区的微生物基本以AOB为主，同时含有部分NOB和ANAMMOX菌. ANAMMOX污泥中的微生物基本为ANAMMOX菌，同时也含有部分AOB和NOB，说明所接种的污泥为混培物，只是相应的功能菌占主导地位，因此后续运行条件控制不好可能会引起非功能菌的快速生长，从而导致反应器脱氮速率失稳.
在常温的条件下，运行至40 d，联合工艺的脱氮速率下降了50%，由QPCR分析发现，此时好氧区的所有微生物也出现了大量的死亡，其中功能菌AOB菌的基因拷贝数由接种初期的6.03×108 copies·g-1下降到3.03×106 copies·g-1，而厌氧区的ANAMMOX菌基因拷贝数也由1.76×109 copies·g-1下降到1.26×107 copies·g-1，进一步说明接种的PN和ANAMMOX污泥中的微生物在常温下不适应环境，出现死亡.
将反应器运行至中温时，好氧区的主导功能菌AOB出现快速生长，增长量达到接种时的3倍，基因拷贝数达到109数量级，占据主导地位. 虽然NOB也出现一定量的增长，但是与AOB相比基因拷贝数仍然相差4个数量级，说明在运行过程中仍受到较好的抑制. 由于本研究PN采用的是生物膜法，膜内部厌氧环境有利于ANAMMOX菌的增殖，同时在好氧区污泥中ANAMMOX菌基因拷贝数也达到了108数量级. 较厌氧区ANAMMOX菌基因拷贝数109数量级仍相差10倍之多. 即在好氧区主导功能菌仍然是AOB. 厌氧区颗粒污泥系统中，ANAMMOX菌的基因拷贝数恢复到109数量级，仍占据主导功能菌的地位. 但是AOB的数量增长了2个数量级，出现此现象可能是因为: 一方面好氧区的生物膜脱落随水流入厌氧区，从而包裹在ANAMMOX颗粒污泥表面，使得AOB数量上升； 另一方面好氧区的微氧环境，会带入部分DO进入厌氧区，导致厌氧区部分AOB增殖. 但是在厌氧区仍然以ANAMMOX菌占据主导功能菌的地位.
3 结论(1) 在常温(22℃)的条件下能够实现PN-ANAMMOX工艺联合脱氮，但是因温度未达到AOB和ANAMMOX菌的最适需求，联合工艺的脱氮速率由1 kg·(m3·d)-1下降到0.5 kg·(m3·d)-1； 当温度恢复到中温(32℃)后，联合工艺的脱氮速率迅速升高到1.75 kg·(m3·d)-1.
(2) 由QPCR分析控制，常温(22℃)的条件下不利于AOB和ANAMMOX微生物生长，中温环境的功能微生物在常温条件下会出现大量死亡. 中温条件下，AOB和ANAMMOX微生物的基因拷贝数在好氧和厌氧环境分别出现快速增多，说明微生物出现快速增长.
(3) 温度升高后，NOB的活性会迅速提高，导致PN过程失稳. 通过提高出水回流量的方式可以有效地控制NOB的增殖.
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