2016, Vol. 37
由于抗生素过量使用造成的细菌耐药性增强以及耐药机制多样化正对当前整个世界范围内的公共健康造成深刻影响[1, 2]. 我国部分地表水源和地下水源已受到抗生素和抗生素耐药基因的污染[3～6]，受抗生素污染水环境已成为微生物获得和传播耐药性的理想场所[7]. 水环境中的抗生素、 耐药基因和携带耐药基因的微生物能穿透传统净水工艺进入配水系统[8～12]. 人类饮水健康面临巨大风险.
有研究表明，抗生素耐药基因(antibiotic resistance genes,ARGs)可以在环境中持续性残留，并且可通过基因水平转移机制与质粒、 转座子、 整合子等可移动基因元件结合，在种间甚至属间进行迁移[13, 14]. 因此，ARGs在环境中的迁移、 转化和传播比抗生素残留本身对生态环境的危害更大[15～17]. 自2006年Pruden等[15]将ARGs作为一种新型的环境污染物提出后，国内外有关其在各种介质中传播和污染的研究与报道日益增多. Xi等[9]研究表明在饮用水中可以检测到耐药细菌(antibiotic resistant bacteria,ARB)及耐药基因的存在，可能对人类及动物健康具有潜在风险. Farkas等[10]研究表明整合子家族存在于净水工艺中，且生物膜可作为其传播媒介. Xu等[11]通过高通量q-PCR技术使用285种不同耐药基因检测浙江某净水工艺对耐药基因的影响，结果表明耐药基因在净水工艺中大量存在并受净水工艺影响. 梁惜梅等[6]研究结果表明int1相对含量和ARGs总量之间存在显著相关性(P＜0.05)，int1在ARGs的水平传播中起着非常重要的作用. 本实验室研究表明在经过生物活性炭滤池后，可培养微生物的耐药率会出现明显增强[8]. 目前，有关净水工艺过程中耐药细菌的多重耐药性研究甚少. 本研究选取氨苄青霉素(Amp)、 卡那霉素(Kan)、 利福平(Rif)、 氯霉素(Cm)以及链霉素(Str)这5种抗生素，通过分离鉴定的可培养微生物的多重耐药性，探究净水工艺对可培养微生物多重耐药能力的影响. 通过检测3种整合子(Integron)、 9种转座子(Transposon)绝对含量随工艺变化规律，探讨净水工艺对基因水平转移元件的影响和耐药基因在净水工艺过程中发生基因水平转移的可能机制.
1 材料与方法 1.1 样品的采集与处理以上海黄浦江水源某水厂供水系统为研究对象，其净水工艺包括原水、 絮凝沉淀、 臭氧生物活性炭过滤、 砂滤、 氯胺消毒. 在原水、 每个单元工艺后及用户龙头处设置采样点，使用已灭菌的容器进行取样，取样体积为10 L，样品采集时间为2015年5月.
1.2 微生物的分离、 纯化与鉴定将采集水样使用 0.22μm醋酸纤维素膜进行抽滤浓缩，然后将滤膜剪碎投入 50 mL离心管中,使用10 mL PBS缓冲液进行洗脱，涡旋振荡 15 min.
(1) 使用普通无抗生素R2A平板，接种涂布上述振荡后水样1 mL，28℃培养7 d.
(2) 根据细菌菌落是否凸起、 是否透明、 边缘是否光滑等菌落特征挑取优势菌株，多次划线后获得纯培养.
(3) 纯化后的菌株置于灭菌的R2A液体培养基中培养，28℃，200 r·min-1于恒温振荡培养箱中培养14 h. 在其处于对数生长期时，取菌液5 mL，使用天根基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，使用细菌通用引物27F和1492R扩增16S rRNA基因序列. PCR扩增体系为50μL，其中10×Taq buffer 5μL，dNTPs 4μL，引物各1.5μL(10 mmol·L-1),Taq酶 1.0μL，模版100 ng左右，超纯水补齐. 扩增长度为1 400 bp. PCR反应条件为95℃: 5 min；95℃:30 s； 56℃:30 s； 72℃: 1.5 min，共30个循环，72℃延伸10 min. PCR扩增产物送至测序公司检测，将测序结果在NCBI-Blast 数据库中进行同源比对.
1.3 饮用水净水工艺中细菌耐药性分析分别使用Amp、 Kan、 Cm、 Rif、 Str这5种抗生素配制浓度为1、 2、 5、 8、 10和15μg·mL-1的R2A培养基，倒平板，常温下过夜. 分别接种涂布饮用水中分离纯化菌株和振荡后的水样，28℃培养7d. 根据培养结果分析微生物多重耐药性及饮用水净水工艺对选择菌株耐药性随抗生素浓度变化.
1.4 环境样品中微生物基因组DNA提取将上述浓缩后的滤膜，使用SDS法提取环境样品中微生物基因组DNA，使用NanoDrop 2000(NanoDrop Technologies，Wilmington,DE) 检测DNA含量及纯度(A260/A280值在1.8～2.0之间). 使用1%琼脂糖凝胶电泳进行DNA质量检测，DNA条带单一无明显拖尾，表明用该方法提取的DNA 纯度较高.
1.5 实时荧光定量PCR对3种整合子及9种转座子进行检测采用SmartChip Real-time PCR System为高通量荧光定量反应平台. 荧光定量试剂为 FastStart Universal SYBR Green Master (Roche)，PCR反应体系为10 μL: Roche FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) 5 μL，超纯水3μL，DNA模版 0.5μL，引物各0.75μL(1 mmol·L-1). 实验所选取的引物为3种整合子基因(intI1、 int2、 int1)和9种转座子基因(tnpA-ISEcp1B、 tnpA-IS61、 tnpA-IS62、 tnpA-IS63、 tnpA-IS64、 tnpA-IS4、 tnpA-IS21、 IS613、 Tp614)，检测可移动基因元件在不同工艺单元水样中的浓度.
定量PCR反应程序为: 95℃预变性10 min，95℃变性30 s，60℃退火延伸30 s，40个循环，程序自动升温进行溶解曲线分析.
2 结果与讨论 2.1 净水工艺对饮用水中可培养微生物多样性影响本研究从净水工艺中分离纯化出 48株菌，综合分析菌落菌丝形态特征以及 16S rRNA基因测序结果，在经过比对分析后，各菌株鉴定结果如表 1.
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表 1 净水工艺中菌株分离鉴定结果 Table 1 Identification of the isolated bacteria in water treatment process |
其中在不同的净水工艺单元中可培养微生物种类如图 1所示. 经分离鉴定得到26株菌，属于16个属. 其中芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、 噬纤维菌属(Arcicella rosea sp.)、 鞘酯菌属(Sphingomonas sp.)在所有的样品中都能检测到，也反映这3个属的细菌对净水工艺过程较强的适应性. 在原水中可培养微生物最高为11种，其中共球藻属(Trebouxia aggregata sp.)、 鼠球菌属(Muricoccus sp.)、 黄杆菌属(Flavobacterium sp.)只在原水中分离得到，也说明它们受到净水工艺过程各种氧化工艺的影响显著.
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图 1 净水工艺对饮用水中可培养微生物多样性的影响 Fig. 1 Effect of water treatment process on the diversity of cultivable bacteria in drinking water |
经过絮凝沉淀之后，共分离得到6种菌，其中弯曲杆菌(Flectobacillus roses sp.)只在沉淀后能够分离到. 而经过活性炭滤池之后可培养微生物的种类又增多为9种. 当在砂滤池投加氯胺消毒剂后，可培养微生物的种类为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、 鞘酯菌属(Sphingomonas sp.)和噬纤维菌属(Arcicella rosea sp.). 在分离鉴定的可培养微生物中，鞘酯菌属(Sphingomonas sp.)被证明具有较强的抗氧化能力[18, 19]，而芽孢杆菌属的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种在自然界中广泛分布的好氧、 中温、 产芽孢的杆菌，是食品和化妆品中常见的污染菌. 在经过氯消毒之后，微生物的存活可能与某些抗氧化机制有关，如具有硫修饰的DNA可作为一种抗氧化剂保护DNA[20]. 从出厂水到用户龙头水可培养微生物的多样性增加.
2.2 饮用水中可培养微生物的耐药性分析对龙头水中可培养微生物的多重耐药性进行检测，如图 2. 结果表明，芽孢杆菌属(Bacillus sp.)的耐药能力最强. 随着5种不同抗生素浓度由1 μg·mL-1增加到15μg·mL-1，芽孢杆菌属(Bacillus sp.)对5种抗生素始终都具有抗性. 噬纤维菌属(Arcicella rosea sp.)在1~8μg·mL-1的抗生素浓度条件下可抗5种抗生素，当抗生素浓度增加到10 μg·mL-1时，对Rif不再具有耐药能力. 鞘酯菌属(Sphingomonas sp.)在1~2 μg·mL-1抗生素浓度条件下可以抗5种抗生素，在15μg·mL-1时只对Amp具有抗性. 结合图 1，可以发现，这3个种属的细菌抗氧化能力也较强. 已有研究表明抗氯能力强的微生物耐药能力也较强[21, 22]. 除了上述3种细菌，其它种类细菌的耐药能力随着抗生素浓度的增加不断减弱.
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图 2 不同耐药细菌的多重耐药能力 Fig. 2 Multidrug resistance for different antibiotic resistant bacteria |
根据图 1和图 2，选择净水工艺中普遍存在且耐药性较强的3种菌株[芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、 噬纤维菌属(Arcicella rosea sp.)、 鞘酯菌属(Sphingomonas sp.)]研究净水工艺对饮用水中耐药细菌耐药能力的影响. 由图 3所示，饮用水净水工艺对 芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、 噬纤维菌属(Arcicella rosea sp.)、 鞘酯菌属(Sphingomonas sp.)这3个属的细菌耐药能力有明显影响. 随着抗生素浓度提高，对3种耐药细菌的选择压力逐渐增强，3种细菌的多重耐药能力先后受到净水工艺的影响. 但这种影响都有一个共同特点: 每当经过原水、 预臭氧和沉淀工艺多重耐药能力受到影响后，经过生物活性炭滤池，3种细菌的多重耐药能力又得到恢复或增强. 说明生物活性炭滤池对细菌多重耐药能力具有恢复或促进作用. 分析认为，这主要是由于生物活性炭表面生长大量微生物，可能通过基因水平转移等途径对细菌的多重耐药能力产生影响. 同时，由图 3还可以发现，在高浓度抗生素水平条件下，3种微生物的多重耐药能力在龙头水中相对于其它净水工艺单元更强，说明管网输配系统对龙头水样品中耐药细菌的多重耐药能力恢复具有明显的增强作用. 分析认为，应当是管网输配系统内壁表面普遍存在的生物膜发挥了重要作用. 管网生物膜较大的微生物密度可促进耐药基因的水平转移[10]，使耐药细菌的多重耐药能力得以部分恢复.
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图 3 净水工艺对饮用水中耐药细菌耐药能力的影响 Fig. 3 Effect of water treatment process on antibiotic resistance of different ARB |
图 4为可移动基因元件(转座子和整合子基因)在净水工艺中的绝对浓度变化规律. 本研究中各工艺单元出水的转座子绝对浓度变化规律为: 生物活性炭滤池>原水>砂滤后>龙头水>水厂出水[图 4(a)]，经过生物活性炭滤池后可移动基因元件绝对浓度有明显增加，由1.29E+11 copies·L-1增加至2.14E+11 copies·L-1，其绝对浓度超过原水. 整合子绝对浓度变化规律为: 生物活性炭>原水>砂滤后>龙头水>水厂出水[图 4(b)]，经过生物活性炭滤池后可移动基因元件绝对浓度有明显增加，由4.00E+10 copies·L-1增加至7.35E+11 copies·L-1.
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(a)Absolute concentration of IS (转座子的绝对浓度)； (b)Absolute concentration of Intergron(整合子的绝对浓度) 图 4 净水工艺过程中可移动基因元件的变化规律 Fig. 4 Variation of MGEs in drinking water supply system |
已有研究证实四环素类耐药基因，如tetM、 tetW、 tetQ等经常在转座子和其它种类可移动基因元件中检测到. Sull基因也被发现位于IncN质粒中，这些IncN质粒同样在临床样品中发现，被认为与人类健康有一定的关联性[23, 24]. 这些与可移动基因元件结合起来的耐药基因可以通过基因水平转移机制在种间传播[21]，造成耐药基因的扩散和在不同环境中的持久性，同时也可能导致这些耐药基因在净水工艺过程中的行为特征变化.
整合子和转座子基因可促使耐药基因在细菌种内和种间发生水平转移. 由于生物活性炭表面微生物大量生长，将进一步加速耐药基因在生物活性炭滤池生物膜上的传播. 大量可移动基因元件的增加对增强饮用水中微生物的多重耐药能力发挥了重要作用. 由图 4(a)也可发现，在龙头水样品中，转座子水平有明显升高. 有报道指出，低浓度的氯消毒剂水平可能会促进可移动基因元件在微生物间的水平转移[25, 26]. 而在管网输配过程中，由于余氯浓度衰减，到用户末端时余氯水平常常较低，也为图 3龙头水中微生物多重耐药能力增强提供了理论支持. 无论是细菌体内的耐药基因还是可移动基因元件残留，摄入人体后均可能与人体肠道菌群相互作用，将抗性片段传播至人体肠道细菌，给人体健康带来危害[27].
3 结论(1) 在所研究供水系统中共分离鉴定得到 26株菌，分属 16个属，其中 芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、 噬纤维菌属(Arcicella rosea sp.)、 鞘酯菌属(Sphingomonas sp.)在整个供水系统中都有检出.
(2) 在相同抗生素浓度条件下，分离获得的 芽孢杆菌属(Bacillus sp.)、 噬纤维菌属(Arcicella rosea sp.)、 鞘酯菌属(Sphingomonas sp.)的多重耐药能力强于其它分离菌.在5种抗生素浓度高达15 μg·mL-1时，芽孢杆菌属(Bacillus sp.)对5种抗生素都有抗性. 除上述3种菌外，其它种类细菌的耐药能力随着抗生素浓度的增加不断减弱.
(3) 经过生物活性炭滤池和管网输配后，3种分离细菌的多重耐药能力会增强，同时，可移动基因元件的绝对浓度明显增高. 生物活性炭表面和输配管网内壁高密度的微生物对耐药基因在微生物之间进行水平转移有促进作用，对饮用水中微生物的多重耐药性有重要影响.
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