2016, Vol. 37
2. 中国市政工程中南市政设计研究院, 武汉 430010
2. Central and Southern China Municipal Engineering Design and Research Institute, Wuhan 430010, China
饮用水中真菌导致的嗅味问题[1, 2]和真菌的致病性[3~5]引起了世界范围内对真菌问题的关注. 20世纪90年代，在芬兰和瑞典的自来水中暴发了嗅味问题，并发现真菌是导致水中嗅味(2,4,6-三氯苯甲醚)的主要原因[3, 6]，Aslund[7]报道在瑞典Rabacka 市暴发了大量的皮肤感染，这主要是由于自来水中真菌含量高达77~3 100 CFU·(100 mL)-1，引发这种感染的真菌是瓶霉. 另外，Hageskal等[8]发现在挪威的自来水中存在一种绿色木霉能引发哮喘.
氯用于饮用水消毒已有近百年历史，仍是主流消毒方法. 氯起消毒作用的是氯与水反应生成的次氯酸，反应式如下:
|
(1) |
|
(2) |
|
(3) |
次氯酸是很小的中性分子，它可以自由扩散到带负电的细胞表面，并穿透细胞壁到达细胞内部进行氧化作用，一旦细胞内部的酶系统被破坏，细胞很快死亡[9]. 此外，次氯酸性质不稳定，易释放具有极强氧化性的新生态氧，使得细胞膜表面蛋白质变性，细胞屏障被破坏，从而致死微生物[10].
Pereira等[11]报道了氯对枝孢霉、 茎点霉、 曲霉和青霉等共7种霉菌的灭活效果，并考察了消毒剂浓度、 温度和pH对消毒过程的影响，研究结果发现霉菌比普通细菌更加抗氯，达到80%失活效果需要的Ct值为60 min·mg·L-1. 近年来关于饮用水中真菌灭活的研究逐渐增多，但大多数研究停留在宏观效果研究阶段，微观机制研究较少.
本文以地下水中3种优势真菌木霉属、 青霉属、 枝孢属为研究对象，对氯灭活3种真菌孢子的差异性进行了分析，通过解析真菌孢子疏水性、 胞内物质泄漏、 胞外三磷酸腺苷(ATP)、 脱氧核糖核酸(DNA)和蛋白质增加及孢子形态变化对氯灭活真菌孢子的微观机制进行了探讨.
1 材料与方法 1.1 真菌孢子悬液与大肠杆菌菌液制备将存于斜面的真菌接种至氯硝铵孟加拉红琼脂培养基(DRBC)上[12]，培养成熟后(5~7 d)，用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)将菌落表面孢子与部分菌丝洗脱. 随后将孢子悬液在10℃，50 kHz超声10 min(KQ-500DE，昆山市超声仪器有限公司，中国)使得真菌孢子分散，然后用PBS溶液清洗3次(3 600 r·min-1，离心10 min)[13]，在光学显微镜(BX51，Olympus，日本)下用血球计数板计数孢子[11]，将孢子悬液控制在106~108 CFU·mL-1，待用.
将大肠杆菌斜面菌种(ATCC25922)接种至100 mL营养肉汤培养基，37℃，120 r·min-1摇床培养24 h，随后6 000 r·min-1离心10 min，弃去上清液，用PBS冲洗2次，得到菌悬液[14]. 用PBS稀释大肠杆菌浓度为106~108 CFU·mL-1，待用.
1.2 氯灭活3种真菌孢子与大肠杆菌将孢子悬液(106 CFU·mL-1)1 mL 加入到盛有99 mL PBS 的锥形瓶中，加入消毒剂使其初始浓度为2.0 mg·L-1，置于恒温振荡培养箱中(T=25℃，n=120 r·min-1)，在预定反应时间取出 1 mL水样加入到 9 mL 带有终止剂(0.1 mol·L-1 Na2S2O3)的无菌生理盐水中，取100μL涂布于DRBC培养基上，25℃恒温培养箱中避光培养7 d后计数[15].
大肠杆菌悬液灭活方法同上，营养琼脂培养基37℃避光培养1 d后计数.
1.3 孢子灭活机制研究 1.3.1 疏水性测定本实验采用微生物粘着碳烃化合物法测定细胞表面疏水性[16, 17]. 向10 mL磨口圆底玻璃比色管(d=10 mm，实验前用盐酸浸泡，用超纯水洗净，高压锅121℃灭菌15 min)内加入4 mL孢子悬液(约108CFU·mL-1)，再加入1.5 mL正己烷作为有机相. 用玻璃塞封口，室温下剧烈振荡60 s，静置15 min分层. 用无菌注射针头快速吸取水相溶液3 mL，以PBS为空白对照，在750 nm波长下测定吸光度值. 每个样品重复测定3次. 同时以不加有机相作为对照组.
细胞表面疏水率:
|
(4) |
将真菌孢子悬液(108 CFU·mL-1)加入到20 mL试管中，加氯使初始浓度为2.0 mg·L-1，作用30 min，使用0.1 mol·L-1 Na2S2O3终止反应后取出10mL菌液离心(10 000 r·min-1，15 min)，测定孢子液及其上清液总氮的浓度. 同时测定未加氯孢子液及其上清液的总氮浓度. 上清液中总氮代表胞外总氮，孢子液总氮减去上清液总氮即为胞内总氮. 总氮采用碱式过硫酸钾法测定[18].
1.3.3 三磷酸腺苷(ATP)、 脱氧核糖核酸(DNA)与蛋白质(1) ATP测定
ATP测定采用BacTiter-Glo试剂(G8231，Promega，美国)，检测仪器为生物化学发光仪(Glomax-20/20，Promega Biosystems，美国)，将样品在38℃金属浴中预热10 min，ATP试剂预热2 min，然后将500μL样品与50μL ATP试剂混合，20 s后测定化学发光强度(RLU)，结果为总ATP含量. 将孢子悬浮液通过0.1μm滤膜过滤测得结果为胞外ATP含量. 总ATP减去胞外ATP即为胞内ATP含量[19].
(2) DNA与蛋白质的测定
孢子悬液离心(10 000 r·min-1，15min)，取上清液0.1μL使用微量分光光度计(ND-2000,NanoDrop,美国)在波长260 nm与280 nm处测定. 其中DNA浓度由仪器直接测定，蛋白质浓度根据公式(5)计算:
|
(5) |
取孢子悬液(108 CFU·mL-1)进行离心(10 000 r·min-1，15 min)，弃上清液，沿管壁缓慢加入20倍体积的3%的戊二醛，4℃静置固定过夜[20].依次使用PBS和不同浓度酒精(20%~100%)进行漂洗，以洗去多余的固定液，最后加入乙酸异戊酯，自然干燥后待用. 将带有真菌孢子的管壁切开，粘在导电胶上，喷金后使用扫描电镜(JSM-6510，JEOL，日本)拍照.
1.4 灭活效果评价 1.4.1 灭活率氯灭活真菌孢子的效果依据灭活不同时间水样中真菌的灭活率S进行判断，计算公式如下:
|
(6) |
式中，Nt为实验t时真菌菌落数[CFU·(100 mL)-1]； N0为实验初始真菌菌落数[CFU·(100 mL)-1]； S为真菌灭活率(%).
1.4.2 动力学模型Chick模型用一级动力学反应来表达微生物的灭活速率[21]:
|
(7) |
式中，Nt为实验t时真菌菌落数[CFU·(100 mL)-1]； N0为实验初始真菌菌落数[CFU·(100 mL)-1]； k为速率常数 (min-1)； C为消毒剂浓度(mg·L-1)； t为接触时间(s).
2 结果与讨论 2.1 氯灭活3种真菌的效能氯灭活作用主要表现在次氯酸的强氧化作用[22, 23]. 由图 1可知，在氯初始浓度2mg·L-1时，随着反应时间的延长，真菌的灭活率均呈现升高的趋势. 在相同条件下，氯灭活3种真菌孢子效果存在差异，木霉全部灭活需要60 min，较难灭活，青霉其次，枝孢最易灭活，三者耐氯性为: 木霉属>青霉属>枝孢属. 值得注意的是大肠杆菌在30 s时几乎全部灭活，由此可见真菌耐氯性远远强于细菌.
|
pH=7、T=25℃ 图 1 氯灭活3种真菌及大肠杆菌的效果 Fig. 1 Inactivation of three species of fungal spores and E. coli by chlorine |
氯灭活真菌孢子符合一级动力学，由Chick模型计算所得速率常数见表 1，相关系数均大于0.90，其计算结果与灭活结果一致，真菌灭活速率常数顺序为: 枝孢属 (0.079 min-1)>青霉属 (0.045 min-1)>木霉属 (0.037 min-1)，大肠杆菌的灭活速率远大于3种真菌孢子.
|
表 1 氯灭活速率方程 Table 1 Disinfection rate equation of chlorine for fungi and E. coli |
Pereira等[11]研究指出真菌比细菌和病毒表现出更高的耐氯性. 灭活几种真菌所需Ct99%值为71~1 404 min·mg·L-1(25℃，pH=7，C=1mg·L-1)，而灭活大肠杆菌仅需0.04 min·mg·L-1(5℃，pH=6)或0.6 min·mg·L-1(23℃，pH=10).
真菌较大肠杆菌难以灭活有两个方面的原因: 一方面，细胞组成不同. 首先，真菌具有被核膜包裹的完整细胞核，这增加了氯进入细胞后破坏真菌遗传物质的难度； 其次，细菌细胞壁的主要成分是肽聚糖，而真菌是几丁质，几丁质对真菌细胞具有保护功能[24]，使其耐氯性更强； 最后，两者细胞器组成不同，细菌只有核糖体一种细胞器，而真菌除核糖体外，还有内质网、 高尔基体等多种细胞器，真菌较大肠杆菌细胞结构复杂的多，故其耐氯性也更高.
另一方面，细胞尺寸不同. 大肠杆菌大小一般为1~3μm，而真菌一般大小为10~100μm，真菌体积是大肠杆菌的数倍，灭活时需氯量更大.
2.2 氯灭活后胞内含氮有机物泄漏细胞中含氮有机大分子包括蛋白质和核酸等，细胞膜受到破坏后会造成细胞内含氮有机物的流失，此项指标可表征细胞的破坏程度及内部分子的外泄程度. 图 2为灭活前后真菌孢子悬液胞内外总氮的变化，经过30 min灭活后，胞外含氮有机物浓度均呈现大幅上升的趋势，说明氯对真菌孢子细胞膜产生了氧化破坏作用，从而造成了细胞内含氮有机物的泄漏. 灭活30 min后，枝孢属上清液总氮增加最大，青霉属次之，木霉属变化最小. 其原因一方面是由于枝孢属孢子体积较大，胞内含氮有机物的量也较大，另一方面是因为枝孢细胞破坏程度最大(100%灭活)，而木霉属经过30 min灭活后，仍有12%的可培养未被灭活的孢子.
|
图 2 真菌孢子灭活前后总氮浓度变化 Fig. 2 Total nitrogen change of fungal spores before and after inactivation by chlorine |
ATP是微生物生命活动的重要能量物质，ATP浓度的高低可间接表示真菌浓度的高低，氯灭活后细胞释放出的游离ATP在一定程度上反映了细胞的破坏程度. 游离ATP是指能够通过0.1μm滤膜的ATP分子，游离ATP占总ATP的比例可以表示真菌的活性状态，结合真菌数，还可计算出每个细胞的ATP含量，其高低可表征微生物细胞的尺寸与活性[19].
图 3(a)中，氯灭活前后木霉和青霉孢子的总ATP浓度变化不大，枝孢属孢子的总ATP仅轻微降低(降低10.9%). 而从图 3(b)中可明显看出，灭活前胞外游离ATP量很少，灭活后大幅增长. 这表示灭活后细胞破坏，胞内ATP被释放，且释放量与孢子大小、 破坏程度成正相关，ATP释放量为: 枝孢属>青霉属>木霉属. 经计算，单个木霉孢子ATP含量约为1.65×10-7 nmol，青霉孢子为3.65×10-7 nmol，枝孢孢子为6.51×10-7 nmol，而自然水体中的每个细菌ATP含量约为1.75×10-10 nmol[19]. 真菌孢子大小个体差异性较大，故其ATP含量也有差异，如枝孢属最大，其单个孢子ATP含量也较高，而细菌体积小于真菌，故其ATP含量也较小.
|
图 3 氯灭活3种孢子前后总 ATP浓度及胞外ATP变化 Fig. 3 Change of total ATP and extracellular ATP in fungal spores before and after inactivation by chlorine |
DNA与蛋白质是细胞重要的组成部分，DNA引导细胞发育与机能运作，控制蛋白质合成，蛋白质则是生物细胞中含量最高的组分. 要了解真菌孢子的存活情况，宏观上可采用平板计数法，微观上则可通过检测其DNA与蛋白质泄漏量来确定细胞的破裂死亡.
由图 4可明显看出，氯灭活后孢子上清液中的DNA与蛋白质浓度显著增大，表明氯灭活后细胞膜被破坏，细胞内大量DNA与蛋白质泄露，造成细胞死亡. 3种真菌DNA、 蛋白质浓度差值: 枝孢属>青霉属>木霉属，与图 1中灭活难易程度对应.
|
图 4 氯灭活3种孢子DNA、 蛋白质浓度变化 Fig. 4 Variation of DNA and protein concentrations in fungal spores before and after inactivation by chlorine |
由图 5可知，灭活前的真菌孢子，表面圆滑，几乎没有褶皱. 木霉孢子为球形，大小在1~2μm之间； 青霉孢子形状与木霉相似，呈光滑球形，尺寸略大于木霉，在2~3μm之间； 枝孢属孢子为椭球体，尺寸最大，长度在4~5μm，宽度在2~3μm之间. 氯作用30 min后，3种孢子均有不同程度的破坏，由于细胞膜被破坏，渗透压改变以及胞内物质的释放，细胞出现褶皱、 凹陷，形态被破坏. 木霉相对破坏较轻，形态较完整，细胞壁仅褶皱凹陷，这与孢子悬液总氮浓度的变化一致； 青霉破坏较重，细胞壁凹陷较重，形态较不完整； 枝孢属破坏最重，细胞壁大量褶皱凹陷，形态完全被破坏. 这与真菌灭活效果一致(图 1).
|
图 5 氯灭活前后真菌孢子扫描电镜照片 Fig. 5 SEM photos of fungal spores before and after chlorine inactivation |
(1) 3种真菌的疏水性差异
疏水蛋白最早是由Rosenberg等[25]在研究细菌与寄主吸附机制时提出的，指覆盖在微生物表面的疏水物质，在许多丝状真菌中已经发现疏水蛋白的存在，孢子的疏水性可防止真菌孢子丧失水分，同时在消毒中抵抗消毒剂进入孢子内部发挥作用[26].
表 2中差值为由公式(4)计算所得疏水率(CSH)，3种真菌疏水性大小为: 木霉属>青霉属>枝孢属. 而氯灭活真菌的速率常数为: 枝孢属 (0.079 min-1)>青霉属 (0.045 min-1)>木霉属 (0.037 min-1)，可见真菌灭活难易程度与疏水性成负相关，即真菌疏水性越大(木霉)，灭活效果越差，这主要是由于消毒剂难接近木霉孢子与之进行反应.
|
|
表 2 3种真菌孢子的疏水性 Table 2 Hydrophobicity of three species of fungal spores |
(2) 3种真菌的尺寸差异
地下水中的3种优势真菌，木霉和青霉呈球状，木霉孢子大小在1~2μm之间，青霉孢子尺寸略大于木霉，在2~3μm之间； 枝孢属孢子为椭球体，长度在4~5μm，宽度在2~3μm之间. 分别采用球体和椭球体的公式计算孢子的表面积和体积，结果如表 3所示.
|
|
表 3 3种真菌孢子的尺寸 Table 3 Size of three species of fungal spores |
3种真菌孢子的表面积和体积大小顺序为: 枝孢属>青霉属>木霉属，这与3种真菌的氯灭活速率常数完全一致[枝孢属 (0.079 min-1)>青霉属 (0.045 min-1)>木霉属 (0.037 min-1)]. 可见真菌孢子的灭活难易程度与孢子尺寸(表面积和体积)成正相关，即真菌孢子越大(枝孢)，灭活效果越好，灭活速率常数越大. 这主要是由于孢子尺寸越大，单个孢子的表面积越大，氯可作用的位点越多，越易被破坏.
2.5.2 真菌孢子灭活机制通过孢子的可培养性、 胞外总氮浓度、 胞外特征物质(ATP、 DNA、 蛋白质)和扫描电镜等方法探究了氯灭活真菌的主要机制.
对图 1和图 3重新进行分析，结果见表 4所示，经过30 min 氯灭活后，青霉和枝孢基本被灭活，无可培养的孢子，而还有10%的木霉可用DRBC培养基培养. 然而，经过相同时间灭活，剩余胞内ATP比例的大小顺序为: 木霉>青霉>枝孢，这与剩余可培养的孢子比例的规律一致，也可以反映孢子的活性[19]，但是胞内ATP比例明显高于可培养孢子的比例. 这可能主要是存在有活性但不能培养的孢子(NBVC)，即处于休眠状态[27, 28]，然而在适当的条件下，还可培养形成真菌菌体.
|
|
表 4 3种真菌孢子的灭活率 (30 min)/% Table 4 Disinfection efficiency of three species of fungal spores/% |
用[22]，次氯酸是中性小分子，容易扩散到孢子表面，首先作用于细胞表面，降低孢子的可培养性，部分孢子处于休眠，不能被培养； 然后次氯酸进一步破坏细胞膜，增加细胞的通透性，导致菌体内外渗透压遭到破坏，胞内物质释放，细胞活性完全降低. 所以，为了保障真菌孢子的完全灭活，不仅要降低真菌的可培养性，还需降低真菌孢子的活性(特别是胞内ATP的比例).
3 结论(1) 氯灭活真菌孢子符合一级动力学，满足Chick模型，3种真菌的耐氯性为: 木霉属>青霉属>枝孢属，真菌耐氯性远强于细菌.
(2) 消毒效果与疏水性成负相关，疏水性越大，消毒剂越难以进入细胞内部发挥作用. 孢子尺寸越大，单个孢子的表面积越大，氯可作用的位点越多，越易被破坏.
(3) 氯对细胞膜产生了破坏作用，造成了胞内含氮有机物泄漏，胞外特征物质(ATP、 DNA、 蛋白质)浓度显著增长，孢子细胞凹陷、 表面褶皱、 形态有不同程度的破坏.
(4) 氯先作用于细胞表面，降低孢子的可培养性，然后进一步破坏细胞膜，增加细胞的通透性，导致菌体胞内物质释放，细胞活性完全降低.
| [1] | Doggett M S. Characterization of fungal biofilms within a municipal water distribution system[J]. Applied and Environmental Microbiology , 2000, 66 (3) : 1249–1251. DOI:10.1128/AEM.66.3.1249-1251.2000 |
| [2] | Bucheli T D, Wettstein F E, Hartmann N, et al. Fusarium mycotoxins: overlooked aquatic micropollutants?[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry , 2008, 56 (3) : 1029–1034. DOI:10.1021/jf073082k |
| [3] | Hageskal G, Lima N, Skaar I. The study of fungi in drinking water[J]. Mycological Research , 2009, 113 (2) : 165–172. DOI:10.1016/j.mycres.2008.10.002 |
| [4] | Anaissie E J, Kuchar R T, Rex J H, et al. Fusariosis associated with pathogenic Fusarium species colonization of a hospital water system: a new paradigm for the epidemiology of opportunistic mold infections[J]. Clinical Infectious Diseases , 2001, 33 (11) : 1871–1878. DOI:10.1086/cid.2001.33.issue-11 |
| [5] | Ma X, Baron J L, Vikram A, et al. Fungal diversity and presence of potentially pathogenic fungi in a hospital hot water system treated with on-site monochloramine[J]. Water Research , 2015, 71 : 197–206. DOI:10.1016/j.watres.2014.12.052 |
| [6] | Muittari A, Kuusisto P, Virtanen P, et al. An epidemic of extrinsic allergic alveolitis caused by tap water[J]. Clinical & Experimental Allergy , 1980, 10 (1) : 77–90. |
| [7] | Aslund P. Skin irritations cause by moulds (in Swedish)[J]. Var F da , 1984, 36 : 327–336. |
| [8] | Hageskal G, Gaustad P, Heier B T, et al. Occurrence of moulds in drinking water[J]. Journal of Applied Microbiology , 2007, 102 (3) : 774–780. DOI:10.1111/jam.2007.102.issue-3 |
| [9] | Dukan S, Touati D. Hypochlorous acid stress in Escherichia coli: resistance, DNA damage, and comparison with hydrogen peroxide stress[J]. Journal of Bacteriology , 1996, 178 (21) : 6145–6150. |
| [10] | Zhang J Z. Study on the change and control of disinfection byproducts in drinking water supply system in Xi'an city[D]. Xi'an: Xi'an University of Architecture and Technology, 2007. 张晋珠. 西安市供水系统中消毒副产物变化及控制研究[D]. 西安: 西安建筑科技大学, 2007. |
| [11] | Pereira V J, Marques R, Marques M, et al. Free chlorine inactivation of fungi in drinking water sources[J]. Water Research , 2013, 47 (2) : 517–523. DOI:10.1016/j.watres.2012.09.052 |
| [12] | Pereira V J, Basílio M C, Fernandes D, et al. Occurrence of filamentous fungi and yeasts in three different drinking water sources[J]. Water Research , 2009, 43 (15) : 3813–3819. DOI:10.1016/j.watres.2009.05.024 |
| [13] | Jung Y J, Oh B S, Kang J W. Synergistic effect of sequential or combined use of ozone and UV radiation for the disinfection of Bacillus subtilis spores[J]. Water Research , 2008, 42 (6-7) : 1613–1621. DOI:10.1016/j.watres.2007.10.008 |
| [14] | 王云, 鲁巍, 张晓健. 氯及氯胺灭活大肠杆菌的消毒动力学模型[J]. 环境科学 , 2005, 26 (5) : 100–104. Wang Y, Lu W, Zhang X J. Modeling of inactivation kinetics of E. coli with free chlorine and monochloramine[J]. Environmental Science , 2005, 26 (5) : 100–104. |
| [15] | Zhang Y J, Zhang Y Q, Zhou L I, et al. Factors affecting UV/H2O2 inactivation of Bacillus atrophaeus spores in drinking water[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology , 2014, 134 : 9–15. DOI:10.1016/j.jphotobiol.2014.03.022 |
| [16] | Rosenberg M. Microbial adhesion to hydrocarbons: twenty-five years of doing MATH[J]. FEMS Microbiology Letters , 2006, 262 (2) : 129–134. DOI:10.1111/fml.2006.262.issue-2 |
| [17] | 孙晓莹, 施汉昌, 全向春, 等. 细菌细胞表面疏水性及在活性污泥中粘附率影响因素研究[J]. 环境科学 , 2008, 29 (10) : 2809–2814. Sun X Y, Shi H C, Quan X C, et al. Factors influencing bacterial cell-surface hydrophobicity and bacterial adhesion ratio to activated sludge flocs[J]. Environmental Science , 2008, 29 (10) : 2809–2814. |
| [18] | HJ 636-2012, 水质总氮的测定碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法[S]. |
| [19] | Hammes F, Goldschmidt F, Vital M, et al. Measurement and interpretation of microbial adenosine tri-phosphate (ATP) in aquatic environments[J]. Water Research , 2010, 44 (13) : 3915–3923. DOI:10.1016/j.watres.2010.04.015 |
| [20] | Kang M H, Pengkit A, Choi K, et al. Differential inactivation of fungal spores in water and on seeds by ozone and arc discharge plasma[J]. PLoS One , 2015, 10 (9) : e0139263. DOI:10.1371/journal.pone.0139263 |
| [21] | Dalrymple O K, Stefanakos E, Trotz M A, et al. A review of the mechanisms and modeling of photocatalytic disinfection[J]. Applied Catalysis B: Environmental , 2010, 98 (1-2) : 27–38. DOI:10.1016/j.apcatb.2010.05.001 |
| [22] | Chen Y Q. Study on the inactivation characteristics and mechanism of the chlorine-resistant bacteria in drinking water system[D]. Beijing: Tsinghua University, 2011. 陈雨乔. 饮用水系统中耐氯性细菌消毒特性及机理研究[D]. 北京: 清华大学, 2011. |
| [23] | GB 5749-2006, 生活饮用水卫生标准[S]. |
| [24] | Dai J H, Qu H, Yu Z S, et al. Computational analysis of AnmK-like kinase: new insights into the cell wall metabolism of fungi[J]. Journal of Theoretical Biology , 2015, 379 : 59–65. DOI:10.1016/j.jtbi.2015.05.004 |
| [25] | Rosenberg M, Kjelleberg S. Hydrophobic interactions: role in bacterial adhesion[A]. In: Marshall K C (Ed.). Advances in Microbial Ecology[M]. New York: Springer, 1986. 353-393. |
| [26] | 林福呈. 真菌疏水蛋白的研究进展[J]. 微生物学报 , 2001, 41 (4) : 518–521. Lin F C. Recent researches on fungal hydrophobins[J]. Acta Microbiologica Sinica , 2001, 41 (4) : 518–521. |
| [27] | 丁林贤, 苏晓梅, 横田明. 活的但非可培养(VBNC)状态菌的研究进展[J]. 微生物学报 , 2011, 51 (7) : 858–862. Ding L X, Su X M, Heng T M. Research progress of VBNC bacteria-a review[J]. Acta Microbiologica Sinica , 2011, 51 (7) : 858–862. |
| [28] | Colwell R R, Brayton P R, Grimes D J, et al. Viable but non-culturable Vibrio cholerae and related pathogens in the Environment: implications for release of genetically engineered microorganisms[J]. Nature Biotechnology , 1985, 3 (9) : 817–820. DOI:10.1038/nbt0985-817 |