2016, Vol. 37
氮是生物所必需的营养元素之一，也是限制生物生产力的一种重要元素[1~4]. 它的潜在来源可分为天然来源和人为来源两种. 随着经济的发展和人口的膨胀，全球每年通过人类活动新增的 “活性” 氮量急速上升[4~8]，导致氮循环严重失衡[4, 9]，并且引发了广泛的环境问题: 大气污染[10, 11]、 N2O等温室气体排放增加[10]、 土壤酸化[12]、 水体富营养化[13~17]和生物多样性减少[18]等，对生态环境和人类健康造成了极大影响. 尤其进入 20 世纪以来，地表水体在世界范围内都出现了氮素浓度增加的趋势，带来了饮水安全等问题. 因此，对于地表水体氮循环变化的研究变得尤为重要.
在地表水体氮素变化过程中，氮素的消耗去除能够改善氮污染、 解决人为固氮量增加所导致的氮循环严重失衡问题，成为氮循环研究的焦点[4, 7, 19]. 水体去除氮素主要包括生物脱氮、 化学脱氮及颗粒物吸附沉降等过程[20, 21]. 其中，生物脱氮方式主要有反硝化作用、厌氧氨氧化作用和甲烷厌氧氧化作用[11, 22, 23]. 但目前关于厌氧氨氧化和甲烷厌氧氧化过程的研究[23, 24]较少. 并且有研究表明，反硝化过程是调节局部区域甚至全球尺度上氮循环的关键过程[25]，是被证明了的全球氮循环重要且必不可少的过程[26]. 马培等[20]指出反硝化是公认的去除河流氮素、 解决河流氮污染的最佳途径. 李飞跃[27]对句容水库的反硝化作用进行了研究，指出反硝化对氮的去除作用.
周村水库作为我国温带季节性分层水库[28]，水库从4~11月处于热分层期，从12月到翌年3月处于混合期. 目前针对于水库热分层初期氮素降低的驱动因子的研究很少. 鉴于此，本文选取了周村水库为研究对象，对水库热分层前期的氮素变化及其影响因子进行了分析，并且通过实验室模拟评估水体与沉积物的反硝化作用对氮素的影响，以期为水库水质改善、 污染防治以及运行管理提供科学依据和理论指导.
1 材料与方法 1.1 采样地点和时间周村水库位于山东省枣庄市市中区，水库流域面积121 km2，总库容8 404万m3，水面面积8.54 km2，全年水位波动不大. 水库建成于1960年，主要的入库河流包括西伽河、 下十河和徐洼河，目前是枣庄市主要的城市供水水源地，兼具防洪、 发电、 灌溉等功能. 周村水库处于中纬度暖温带大陆性季风气候区，夏季高温多雨，冬季寒冷干燥. 参照曾明正等[28]的研究，该水库在4~11月形成稳定的热分层，因此本实验于2016年2~4月水库热分层初期进行采样，该时期主库区平均水深10 m(图 1). 选取了周村水库主库区的1个采样点，每月进行两次定期的水质指标和好氧反硝化菌数的测定. 每月一次测定水库上游的入库流量和入库口TN浓度.采用GPS进行站点定位，取样点坐标分别为D1(34°56′46″N、 117°40′54″E). 具体位置见图 1.
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图 1 周村水库水深及采样点位置示意 Fig. 1 Water depth of Zhoucun Reservoir and location of the sampling site |
3月初采集了取样点D1的新鲜水样、 沉积物样品，用以实验室测定水库中水体和表层沉积物反硝化除氮的贡献量. 实验室内取4个2 L的玻璃瓶分为两组，考察光照对反硝化脱氮的影响. 其中一组的一个瓶子加入取样点1 cm厚的表层沉积物，然后通过虹吸作用用导管将水样缓慢转移到反应器至2 L，为了模拟水库状况，对泥的部分遮光处理； 另一个瓶子同样倒入沉积物和水样，全部遮光处理排除藻类影响. 另外一组的一个瓶子加入取样点的水样2 L，另一个瓶子加入水库水样后全部遮光处理排除藻类影响. 依次编号为1-1、 1-2、 2-1、 2-2(图 2). 将玻璃瓶全部放入光照培养箱，调节光照时间、 温度、 溶解氧与水库同步. 由于水样的氮浓度不高，实验装备的局限性，反应器体积仅2 L，好氧反硝化释放的氮气较少，难以收集，因此只定期测定4个瓶子的TN、 硝氮、 亚硝氮和氨氮浓度值.
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图 2 模拟实验示意 Fig. 2 Schematic diagram of simulation experiment |
水质指标的测定参照文献[29]. 总氮含量的测定采用碱式过硫酸钾消解-紫外分光光度法，硝氮含量的测定采用紫外分光光度法，亚硝氮含量的测定采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法，氨氮含量的测定采用纳氏试剂比色法. 有机物分子量测定中膜过滤采用平行法，即水样用0.45μm微滤膜过滤后，分别通过截留相对分子质量为50×103、 10×103、 5×103、 3×103的超滤膜. 测定滤后液的TOC，各分子量区间的有机物用差减法得到[30]. 好氧反硝化细菌数量的测定采用平板计数，每个样品做 10-2~10-4稀释度，每一稀释度做3个平行样.
1.4 数据处理与分析采用 Microsoft office 2003 软件导出和处理数据； 采用Origin 8.0软件作图.
2 结果与讨论 2.1 水库主库区环境因子变化伴随着2~4月气温的季节性回升，水库表层水温不断升高，底层水温则上升较小，造成了表层与底层水体间温差的不断扩大[图 3(a)]； 表层水体的DO浓度略有升高，底层水体的DO浓度不断下降，进而形成缺氧环境[图 3(b)]； 随着表层水体藻类光合作用增强，消耗水中的 CO2，使表层水体pH值略有上升. 随着水深增加DO浓度不断降低，兼性厌氧菌逐渐变得活跃，它们在自身的新陈代谢及对水中有机质矿化降解的过程中，不断产生并积累CO2，致使底部水体pH值降低[图 3(c)]； 随着光照作用的增强，藻类繁殖，使得表层水体中的叶绿素浓度逐渐增多，并大于底层[图 3(d)]. 温度、 DO、 pH和叶绿素的变化均说明水库逐渐向热分层状态过渡.
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图 3 水库环境因子变化 Fig. 3 Changes of the environmental factors in reservoir |
周村水库2~4月期间测定的氮素指标变化见图 4，水库总氮浓度由(2.28±0.09) mg·L-1降至(1.08±0.09) mg·L-1，硝氮浓度由(1.66±0.09) mg·L-1降至(0.25±0.06) mg·L-1，氨氮浓度上下波动，但总体变化不大，亚硝氮的浓度几乎不变.
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图 4 水库TN、 NO3-、 NO2-、 NH4+浓度变化 Fig. 4 Concentration changes of TN,NO3-,NO2-,NH4+ in reservoir |
利用上游监测的入库河流数据和入库口总氮浓度，估算上游来水中总N负荷值. 则根据式(1)[31]:
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(1) |
式中，W为2~4月水库的上游入库总N负荷(t)； Q1、 Q2、 Q3、 c1、 c2、 c3分别为上游西伽河、 徐洼河、 下十河的月入库量(万m3)和对应的TN浓度(mg·L-1)； 0.01为换算系数.
估算得2~4月上游来水中的总N负荷约为61 t. 大气沉降量、 生物固氮量作为水库氮素的来源，同样会增加水库的总氮量，水库的排水量大约为每天3万t，此时水库处于热分层初期，上游的氮输入后，到达水库主库区几乎完全混合，全层浓度一致，因此排水量的大小并不会削减氮的浓度，但库区内总氮浓度却持续下降. 这表明，在水库中部分氮素被去除，使得测定的水库中总氮浓度降低.
对于水库中氮素的降低，目前研究较多的影响因素有藻类利用、 反硝化作用等. 根据黄廷林等[32]的研究可知，周村水库在2~4月的藻类种类发生变化，逐渐以硅藻、 绿藻为主，但是数量没有较大变化，浮游植物丰度在6.80×106 cfu·L-1左右. 一般来说，水库的常见藻类只吸收利用无机态氮，主要有氨氮、 硝氮和亚硝氮. 由于水库中亚硝氮浓度值较低，且浓度在0.02 mg·L-1左右，几乎没有被藻类吸收利用. 近期不少研究证实[33, 34],由于藻类利用氨氮时能量消耗低，使得利用氨氮的藻类生长优于利用硝氮的藻类，因而藻类通常更倾向于吸收氨氮[35]. 而水库中氨氮的浓度(图 4)变化不大，可见藻类对氮的吸收利用量很小，其对氮素的影响可以忽略不计.
2.3 反硝化作用影响分析众所周知，好氧反硝化作用是微生物在有氧条件下进行的硝酸盐还原过程，在多种微生物的参与下，在硝酸盐还原酶(Nar)、 亚硝酸盐还原酶(Nir)、 一氧化氮还原酶(Nor)以及一氧化二氮还原酶(Nos)的作用下硝酸盐经四步还原反应，最终转化成氮气释放[36]. 根据本课题组前期对周村水库的研究[37, 38]，水库中存在具有高效反硝化作用的好氧反硝化菌. 相关研究[39]表明温度、 DO、 pH及有机物构成是影响好氧反硝化菌反硝化作用的重要因素. 其中好氧反硝化菌的适宜生长温度[40, 41]在25~35℃之间，随着温度的升高会促进反硝化的进行[42]，而水库的温度[图 3(a)]逐渐上升，利于好氧反硝化菌的生长. 有研究分析DO[41]在3~7mg·L-1之间，pH[40, 41, 43]在中性偏碱时适宜好氧反硝化菌的生长，测定的水库2~4月的DO和pH[图 3(b)和3(c)]均处于适宜生长区间. 同时根据超滤膜截留的分子量大小，将水库2~4月中溶解性有机物(DOC)划分为4个分子量区间，由水库中溶解性有机物不同分子量的浓度以及所占百分比的变化(图 5)可知，溶解性有机物浓度在增加，小分子量的有机物(<3×103)呈现先减少后增多的趋势，主要是由于好氧反硝化菌的新陈代谢产物会溶解在水中,使水中的溶解性有机物含量增加[44]； 菌的同化作用将水中亲水性小分子有机物转化成大分子细胞物质，使水中小分子有机物含量减少，大分子有机物含量有所增加[45]； 环境中营养元素逐渐减少,藻类将储存的部分胞内物质降解利用转化为小分子有机物[46]. 水中溶解性有机物分子量的变化是上述过程综合作用的结果. 小分子量有机物有利于反硝化的进行[47]，而此期间好氧反硝化菌的数量也在逐渐增多，由(1.06±0.02)×105 cfu·L-1增加到(8.33±0.03)×106 cfu·L-1. 因此可以确定，2~4月水库氮素的降低主要是由于水库好氧反硝化菌的反硝化作用.
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图 5 水库溶解性有机物分子量的浓度和百分比变化 Fig. 5 Changes of the concentration and percentages of molecular weight of dissolved organics |
实验室模拟期间的温度与DO见图 6，大体与同期水库环境同步.
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图 6 实验室模拟的温度和DO Fig. 6 Temperature and DO in the laboratory simulation |
两组实验的氮素指标变化见表 1. 可见模拟实验的氮素变化与实际水库变化大体一致. 其中1-1和1-2中氨氮、 亚硝氮值较小且变化不大，总氮和硝氮的浓度均有明显下降； 2-1和2-2中氨氮、 亚硝氮值较小且变化不大，硝氮几乎没有变化，总氮浓度下降但下降幅度不大.1-1、 2-1与对应的1-2、 2-2的TN浓度变化大体一致，可见藻类对于氮素的消耗利用较低，这与上述的结论一致. 同时，有水体和沉积物共同反硝化作用的瓶子，总氮的去除量为3.3 mg，去除率为78.98%； 仅有水体反硝化作用的瓶子内，总氮的去除量为0.7 mg，去除率为21.02%，因此反硝化作用是氮素降低的主要因素，这与上述水库氮素降低原因的分析结果一致. 水体与沉积物的反硝化去除氮量之比大体为1∶4，因此沉积物的反硝化作用是水库氮素去除的重要因素，这与李飞跃[27]研究的结论大体一致.
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表 1 模拟实验中 TN、 NO3-、 NO2-、 NH4+的浓度变化 /mg·L-1 Table 1 Concentration changes of TN,NO3-,NO2- and NH4+ in the simulation experiment/mg·L-1 |
3 结论
(1) 周村水库热分层前期(2~4月)，持续有上游入库氮量、 大气沉降量和生物固氮量进入，但库区总氮呈现减少的趋势，主要是由于2~4月期间水库温度、 DO、 pH以及有机物的组分变化均有利于好氧反硝化菌的生长繁殖，使得水库的反硝化作用增强，进而导致总氮浓度降低.
(2) 实验室模拟了水体和沉积物反硝化作用对氮素的去除量，有水体和沉积物共同反硝化作用的瓶子，总氮的去除量为3.3 mg，去除率达到78.92%； 仅有水体反硝化作用的瓶子内，总氮的去除量为0.7 mg，去除率达到21.08%. 水体与沉积物的反硝化去除氮量之比大体为1∶4，沉积物的反硝化作用是水库氮素去除的重要因素.
(3) 将来从分子生物学的角度进一步分析反硝化菌的群落结构和作用机制，同时开展相关反硝化菌剂的制备工作，为水库水质治理提供技术支持.
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