2016, Vol. 37
生物气溶胶是来源于陆地或水生环境中各类生物活动所产生的各种大气颗粒物，包括真菌、 细菌、 病毒、 花粉、 植物和动物裂解碎片，以及各种带有生命活性的物质[1]. 全球范围内生物气溶胶粒子的年排放量为56~1 000 Tg[2]. Matthias-Maser等[3]发现在受城市和农村共同影响的地区，生物气溶胶的数浓度平均值高达30%的比例. 而在一些偏远地区，生物气溶胶体积比可达到28%[4].
微生物是生物气溶胶的一个重要组分，其浓度因时间和地理位置的不同而存在时空差异[5~7]. 活性是微生物的一个重要指标，表征微生物进行新陈代谢或正常生理活动的能力，其能力取决于各种物理、 化学和生物因素，以及环境中的营养状况[8]. Kourtev等[9]于2005年与2008年研究发现在美国中西部大气云水样品中有76% 的细菌具有生理活性，代谢活跃的细胞可以通过转变有机碳种类组成[10, 11]或氮的组成[12]而改变云的化学组成，因而微生物活性可能会间接对云的形成造成影响，进而影响全球气候变化. 此外，在复杂的微生物群落中，存活细胞的比例会限制微生物新陈代谢作用、 繁殖能力以及存在潜在的环境健康风险，因此对微生物的活性进行研究是很有必要的.
由于大气不是微生物的良好生境，生物气溶胶中的微生物活性测定存在很大困难. Qi等[13]提出一种测定生物气溶胶中微生物活性的荧光素二乙酸酯(fluorescein diacetate,FDA)水解法，该法可成功应用于微生物活性的分析，测得2012年5~12月青岛地区大气环境中微生物活性水平(以荧光素钠计，下同)在10.7~85.8 ng·m-3. 对于生物气溶胶中微生物活性的研究极其有限，其时空分布特征及变化规律尚未被揭示，粒径分布尚未被报道，而影响微生物活性的环境因素也需要进行进一步探索. 沿海地区生物气溶胶组成及浓度受海陆相互作用的影响[14, 15]，具有相对独特的地理环境和气候条件，空气中有些海洋细菌经远距离传输可保持存活状态[16]. 因此，在沿海地区进行研究有助于了解全球生物气溶胶信息，了解海洋对气溶胶中微生物活性的影响. 本文以青岛作为研究区域，于2015年11月至2016年1月连续采集了生物气溶胶样品，运用FDA法测定了样品中微生物的活性，分析了生物气溶胶中微生物活性的水平和粒径分布特征，初步探讨了特殊天气、 环境因子和气团来源对微生物活性的影响.
1 材料与方法 1.1 采样地点概况生物气溶胶样品采集于青岛市崂山区中国海洋大学教学区六区楼顶(36°16′N，120°50′E)，离地面高度9.0 m左右，四周绿地面积可达50%(图 1).
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图 1 生物气溶胶采样点示意 Fig. 1 Location of the sampling site for bioaerosols |
生物气溶胶采样仪器为辽阳康洁仪器研究所生产的FA-1型六级筛孔撞击式空气微生物采样器. 其采样流量为28.3 L·min-1，按空气动力学直径大小划分为6个粒径范围: 0.65~1.1 μm、 1.1~2.1 μm、 2.1~3.3 μm、 3.3~4.7 μm、 4.7~7.0 μm和>7.0 μm. 为了方便讨论，本文中将＞2.1 μm的粒子称为粗粒子.
采样时使用三脚架，距离基础地面1.5 m； 两个采集平行样品的采样器相距约1.5 m. 常规采样开始于早上08:00，微生物活性样品采样持续时间为40 min，将生物气溶胶收集在已灭菌涂有40%聚乙二醇溶液的聚碳酸酯滤膜(孔径为0.22 μm，直径为80 mm)上； 总微生物浓度样品采样持续时间为30 min，将生物气溶胶收集在已灭菌的聚碳酸酯滤膜(孔径为0.22 μm，直径为80 mm)上. 常规样品每5 d采集一次，遇到特殊天气加采生物气溶胶样品.
1.3 样品处理过程生物气溶胶中微生物活性测定采用已有报道方法[13, 17]: 采样之前将实验需要的所有材料器具进行高压蒸汽灭菌处理(120℃，20 min). 用75%酒精擦拭超净台和采样器，之后在超净台中进行实验操作. 将聚碳酸酯膜置于采样器平板上，并均匀涂上150 μL聚乙二醇溶液，组装好采样器. 样品采集结束后，将聚碳酸酯膜取出并剪碎，置于盛有20 mL生理盐水(8.5%~9.0% NaCl溶液)的锥形瓶中，接着使用恒温振荡培养箱在37℃，150 r·min-1下振荡30 min. 之后往锥形瓶中加入200 μL 100μg·mL-1 FDA溶液，在30℃下避光静置反应150 min. 待反应结束后，将样品放入离心机以5 000 r·min-1转速离心5 min，使用分子荧光光度计(Hitachi，日立荧光光谱仪F-4600，日本)，设定激发波长为488 nm，发射波长为530 nm，测定样品溶液中的荧光强度. 同时以空白滤膜代替样品，进行上述操作. 因为荧光素钠能释放出一种黄色荧光物质，这种物质和FDA水解反应的终产物所释放出的荧光物质相同，所以本实验选择荧光素钠作为微生物活性测定的标准物质. 实验时配置一定浓度梯度(0~10 ng·mL-1)的荧光素钠标准溶液，在30℃下避光放置150 min后测定荧光强度值，得到标准曲线F=6.578c+0.344，R2=0.997(式中，c表示荧光素钠浓度，F表示荧光强度). 扣除空白后的样品荧光强度值，通过荧光素钠标准曲线，换算为单位体积测定液中的荧光素钠浓度，之后按下式将其换算为单位体积空气里生物气溶胶中的微生物活性水平:
Ma(空气)=1 000·V·Ma(溶液)/Q·t
式中，Ma(空气)为单位体积空气中生物气溶胶微生物活性水平(ng·m-3)； Ma(溶液)为单位体积溶液中生物气溶胶微生物活性水平(ng·mL-1)； V为样品溶液体积(mL)； Q为采样流量( L·min-1)； t为采样时间(min).
生物气溶胶中总微生物浓度测定采用已有报道的方法[18]: 将采集的生物气溶胶样品迅速转移到盛有25 mL生理盐水和250 μL吐温-80的250 mL锥形瓶中，制成菌悬液，然后放入恒温振荡培养箱中，以120 r·min-1的转速，振荡培养30 min. 随后，将菌悬液抽滤到0.2 μm的核孔滤膜上，用10μg·mL-1的4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)进行染色，15 min后制片. 在荧光显微镜蓝光道油镜条件下观察，随机选取10个视野，记录每个视野中蓝色的细胞个数. 参照文献[10]中提供的公式将其换算为单位体积空气里生物气溶胶中总微生物浓度水平.
1.4 数据统计分析方法本文中涉及的气象数据(气温、 相对湿度、 风速、 气压等)来源于青岛气象局在线数据(http://qdqx.qingdao.gov.cn/zdz/ystj.aspx). 根据中国气象局MICAPS地面填图资料，对天气类型(晴、 雨、 雾、 霾、 沙尘等)进行划分和统计.
运用统计软件对实验所得到的数据进行分析. 通过相关性分析探究各类环境因素对微生物活性的影响程度，其相关性程度以Spearman相关性系数进行表示. P≤0.05说明显著相关，P＞0.05说明相关不显著. 运用因子分析探究各因素对微生物活性的综合影响中的贡献程度. 选择特征根≥1的因子，且因子的累计贡献率应达到70%~85%.
后向轨迹采用美国国家海洋与大气局(NOAA)大气资源实验室的HYSPLIT4模型.
2 冬季生物气溶胶中微生物活性的分布特征 2.1 生物气溶胶中微生物活性水平运用FDA法测定了2015年11月14日至2016年1月5日青岛地区气溶胶中微生物活性，平行样品的标准偏差平均为0.145，证明该方法稳定性较好. 采样期间微生物活性水平范围为21.89~108.59 ng·m-3，平均值为59.43 ng·m-3； 总微生物浓度水平范围为8.76×104~5.68×105 cells·m-3，平均值为2.92×105 cells·m-3. 如图 2所示. 微生物活性最高值出现在2015年11月27日，在采样之前，青岛整夜大风，最高风速高达9.7 m·s-1，大风将地表颗粒物吹到空中，增加了气溶胶中微生物的浓度，使其活性相应增加. 最低值出现在2015年11月16日，分析其原因是当时降雨刚刚结束，降雨会冲刷空气中的颗粒物，起到净化空气的作用，相应导致其活性降低. Qi等[13]研究发现，青岛地区2012年11~12月期间，生物气溶胶中微生物活性范围为10.7~40.3 ng·m-3. 相比于2012年同期数据，2016年的微生物活性水平更高，这可能是由于近年来青岛生物气溶胶浓度随大气颗粒物浓度增加而增加[19]，导致空气中微生物浓度有所增加，微生物活性也相应地有所升高.
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图 2 青岛生物气溶胶微生物活性变化 Fig. 2 Variation of microbial activity of atmospheric bioaerosols |
粒径对生物气溶胶在大气中的存在状态、 大气传输过程等都会产生影响. 2015年11月14日至2016年1月5日期间青岛生物气溶胶中微生物活性与总微生物浓度的粒径分布如图 3所示. 微生物活性和总微生物浓度的粒径分布均呈现出粗粒径(>2.1 μm)高于细粒径(＜2.1 μm)的特征. 微生物活性在>7.0 μm粒径上所占据的比例最高，平均为24.06%，明显高于其他粒级. 微生物活性在0.65~1.1 μm粒径上所占比例最低，平均为12.87%(表 1). 微生物活性粒径分布呈现活性随粒径减小而降低的趋势. 微生物活性的高值主要分布在粗粒径上，这是因为生物气溶胶中微生物主要分布在粗粒子中[10].
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表 1 青岛生物气溶胶微生物各粒径上活性所占百分比平均值 Table 1 Average percentage of microbial activity on each particle size in Qingdao |
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图 3 青岛生物气溶胶微生物活性与总微生物浓度的粒径分布 Fig. 3 Size distribution of microbial activity and concentration of total microbes in Qingdao |
不同类型的微生物具有不同的粒径范围，病毒等通常小于0.2 μm； 真菌孢子大多是单独悬浮在大气中，粒径呈对数正态分布，1.0~6.0 μm的粒子约占70.0％； 空气细菌大多附着在大气颗粒上，呈偏态分布，大于2.0 μm的粒子约占总数的80.0％[20]. 通常，粗粒径颗粒物上会附着大量的细菌，粗颗粒物可以为细菌提供更好的庇护作用，减少它受紫外线环境暴露的影响，同时为它们提供生命所必须的碳源和能源，因而有利于微生物的存活，增强其活性. 而细颗粒物表面积较小，微生物难以附着，并且细颗粒物作为污染物的载体，吸附多种化学组分，具有更高的毒性作用[21]，不利于微生物存活. 徐文兵[22]研究发现青岛地区生物气溶胶中细菌、 真菌和总微生物主要分布于粗粒子中，因此粗颗粒物上微生物活性较高.
11月与12月微生物活性的月均粒径分布相似，仍然是粗粒径高于细粒径的特征. 不同之处在于12月1.1~2.1 μm比例高于11月. 分析原因是进入12月青岛地区受供暖影响，大气中PM2.5含量增多导致.
2.3 生物气溶胶中微生物活性的昼间变化为了了解生物气溶胶中微生物活性的昼间变化，于2015年11月的14日、 16日、 18日、 20日的08:00、 12:00、 15:00、 19:00分别采集生物气溶胶微生物样品，测定了其活性，结果如图 4所示.
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图 4 青岛生物气溶胶微生物活性的昼间变化 Fig. 4 Variation of microbial activity during the daytime in Qingdao |
可见，微生物活性在一天当中变化较大，不同样品并未呈现出明显的变化规律. 微生物活性受到来源、 天气条件和气象因素的影响，而一天中不同时间，这些影响微生物的主要影响因素也是存在差异的[23]. 本研究认为微生物活性昼间变化较复杂的原因，一方面是活性受到天气类型、 温度、 湿度、 风速、 紫外线等气象因素和环境污染物等诸多影响. 另一方面采集到的样品较少，气溶胶微生物活性的昼间变化规律有待进一步研究.
3 青岛气溶胶微生物活性影响因素分析 3.1 利用Spearman相关分析对微生物活性影响因素进行分析为了研究微生物活性的影响因素，将采样期间内的气象因素和环境污染因子与活性水平进行相关性分析. 表 2给出了研究过程中生物气溶胶中微生物活性与这些因子之间的Spearman相关系数.
如表 2所示，冬季采样期内青岛AQI、 PM2.5、 PM10、 CO、 NO2、 O3、 SO2这些污染指标与微生物活性无显著相关，可能与这些污染物的浓度并未达到对微生物损害的阈值有关. 温度、 湿度和紫外线强度与微生物活性也无显著相关关系，只有风速与活性存在显著负相关关系.
采样期间内，相关性分析显示微生物活性与温度之间不存在显著相关关系. 采样期间内温度变化幅度较大，由11月20日的11.5℃降低至11月27日的-5.2℃，一周内降温幅度达到16.7℃，又于12月2日升至6.6℃，5日内升温幅度为11.8℃. 通常低温会导致细胞膜流动性降低，微生物的酶促反应活动减缓，而高于微生物承受的临界温度值则会导致生物蛋白质变性和失活[24]. 类似大幅度的温差变化在整个实验过程中出现多次，强烈的温差变化影响着微生物活性对于温度的响应，Qi等[13]的研究也没有发现气温与微生物活性之间存在明显的相关性，与本研究的结果相同. 为更好地了解温度对微生物活性的影响，仍然需要积累大量数据，对生物气溶胶的影响因素进行进一步研究.
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表 2 采样期间生物气溶胶中微生物活性与气象因素和环境质量因子之间的Spearman相关系数1) Table 2 Spearman correlation coefficient between meteorological factors,air quality factors and microbial activity during the sampling period |
微生物活性与相对湿度之间同样不存在显著相关关系，但除去特殊天气下的样品，微生物活性与相对湿度之间呈现出显著负相关关系，Spearman相关系数为-0.560(n=24,**P＜0.01). 有研究表明青岛地区相对湿度在31%~89%范围内，生物气溶胶中微生物活性水平与相对湿度存在显著相关关系[17]，与本研究得到的结果相同. 同时有研究发现雾天、 霾天等特殊天气对微生物浓度和活性具有很大影响[18, 25]，笔者认为特殊天可能会影响微生物活性与相对湿度之间的相关性.
本研究结果显示，采样期间微生物活性与风速之间存在显著正相关关系，Spearman相关性系数为0.445(n=33,**P＜0.01). 风对生物气溶胶的影响比较复杂. 一方面，高风速通过吹动会加速微生物的释放过程，加速土壤及植物的表面活动[26]增加空气中的微生物浓度； 另一方面，高风速会促进局地生物气溶胶的扩散与输送，从而减少空气中微生物的浓度. 风速对生物气溶胶影响的主导作用随研究区域、 研究期间的环境条件不同而不同. 有研究指出，风速与孢子的释放和扩散显著相关[23]，胡庆轩等[27]研究发现，大风能增加大气细菌气溶胶浓度，且与风速呈明显的正相关关系，同时大风使大气细菌粒子的浓度增加45.8倍. 在本研究期间，风速与微生物活性亦呈现显著正相关，因此在本研究期间风速主要促进了微生物的释放，从而使微生物活性升高.
3.2 利用因子分析对微生物活性影响因素进行分析为了研究微生物活性影响因素之间的综合作用，将采样期间内的气象因素和环境污染因子进行因子分析. 经过分析，提取出3个主成分. 表 3给出所有因子得分系数.
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表 3 采样期间气象因素和环境质量因子得分系数 Table 3 Component score coefficient between meteorological factors,and air quality factors during the sampling period |
3个成分的方差贡献率分别为39.19%、 28.42%和15.89%，累积方差贡献率为83.50%. 从表 3中可以看出在成分1中相对湿度、 风速、 AQI、 PM2.5、 PM10、 CO、 NO2的影响较大； 成分2中UV254、 UV297、 UV365、 UV420的影响较大； 成分3中温度、 相对湿度、 风速、 O3和SO2的影响较大.
可见，生物气溶胶中微生物活性水平的影响因素比较复杂，活性的变化可能是多种气象因素和环境污染因子综合作用的结果. 因此对气象因素和环境污染因子对生物气溶胶中微生物活性水平影响的研究，还有待于积累不同天气、 不同区域的大量数据，通过对长期、 大量样品的分析，同时借助于一定的模型预测，得出不同气象因素和环境污染因子对生物气溶胶中微生物活性影响的结论.
4 青岛气溶胶中气团来源对微生物活性的影响为了研究气团来源对微生物活性的影响，对所有样品做了大气后向轨迹分析，如图 5所示.
从图 5中可以看出采样期间青岛地区气溶胶来源大多来源于陆地，根据陆地来源差异，将气团来源分为来自北方、 南方和海洋这3类. 来自北方的气团主要来自俄罗斯或蒙古，经京津等北方地区经山东半岛西北部到达青岛； 来自南方的气团主要从长江中下游平原传输到青岛； 另有部分气团来自海上，从不同方向到达青岛. 将这3类来源的微生物活性和浓度进行了对比，如表 4.
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图 5 采样期间青岛地区后向轨迹图 Fig. 5 Back trajectory during sampling period in Qingdao |
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表 4 青岛不同气团来源生物气溶胶中微生物活性、 浓度和PM浓度 Table 4 Microbial activity,concentration and PM data of bioaerosols from different sources in Qingdao |
可以看出不同气团来源的微生物活性、 总微生物浓度、 PM2.5和PM10存在明显差异，均呈现来自北方＞来自南方＞来自海洋的趋势. 海洋源生物气溶胶活性和浓度低于陆地源生物气溶胶，尤其是活性只有陆地源的33.8%. 分析其原因可能是海洋受人类活动影响较小，污染水平较低，海洋上空空气相对于陆地较为洁净，因此来源于海洋的生物气溶胶微生物活性和总微生物浓度较低. 由于青岛地处胶东半岛南部，南面靠海，因此来自南方的大部分生物气溶胶会经过海洋上空洁净空气的稀释，相对于来自北方的气溶胶活性和浓度有所降低. 而来自北方的气团传输距离较长，传输过程中，下风向区域环境中微生物的汇入使得微生物浓度和活性较高.
由于本研究数据量较少且对于海洋上空气溶胶的相关研究极其有限，今后仍需进行大量研究以探究不同来源生物气溶胶对于微生物活性的影响.
5 青岛气溶胶中微生物活性在特殊天气下的变化 5.1 特殊天气下生物气溶胶中微生物活性水平在采样期间出现了雪天、 霾天等特殊天气，采集了此类特殊天气下的生物气溶胶样品，测定了其活性，将非特殊天所测得微生物活性水平作为参照，初步分析了冬季降水和霾对微生物活性的影响，如图 6所示.
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图 6 青岛生物气溶胶微生物活性在特殊天和正常天状况下的对比 Fig. 6 Comparison of microbial activity between special days and normal days in Qingdao |
于11月25日15时测得雪前微生物活性为80.25 ng·m-3，总微生物浓度为2.21×105 cells·m-3； 11月26日16：00降雪过后测得微生物活性为151.91 ng·m-3，总微生物浓度为2.39×105 cells·m-3. 由于雪后风速高于雪前，根据前述相关性分析可知，高风速有利于空气中微生物浓度增加，因此出现了雪后微生物活性升高现象. 当然，采集到的样品较少，降水对微生物活性的影响还有待于进一步研究.
相对于雪天，霾天出现次数较多，因此将霾天和相邻晴天多组微生物活性水平取平均进行对比分析. 晴天微生物活性平均水平为100.33 ng·m-3，霾天微生物活性平均水平降为56.53 ng·m-3，相对于晴天降低了43.7%； 晴天总微生物浓度平均水平为2.52×105 cells·m-3，霾天总微生物浓度平均水平为2.96×105 cells·m-3，相对于晴天升高17.4%. 可见霾天活性低于晴天，霾天浓度高于晴天，初步分析其原因可能是由于霾天AQI升高，空气中颗粒物的含量增多相应导致总微生物浓度升高，但空气中所含污染物质累积抑制了微生物活性，使微生物活性水平降低.
5.2 生物气溶胶微生物活性在连续雾-霾天下的变化青岛地区于2015年12月21~26日出现连续雾-霾天气，本课题组进行了连续观测，得到了生物气溶胶中微生物活性在连续雾-霾天下的变化. 连续7d的微生物活性、 总微生物浓度、 温度、 相对湿度、 风速AQI和PM2.5的变化对比见图 7.
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图 7 青岛生物气溶胶微生物活性在连续雾-霾天下的变化 Fig. 7 Variation of microbial activityin consecutive hazy days mixed with fog in Qingdao |
这连续观测的7 d内，不仅出现霾，还出现多次雾-霾混合和转化，相对湿度范围在70%~97%，变化较小，没有出现典型霾天时的低湿度. 2015年12月21日青岛出现了重度雾、 霾混合天气，风速较低，相对湿度较高，PM2.5和AQI很高，总微生物浓度微生物为3.21×105 cells·m-3，微生物活性为77.36 ng·m-3荧光素钠，比晴天时微生物活性降低22.9%. 在随后两天，风速一直很低，温度升高，霾天消散得很慢，AQI和PM2.5逐步降低，总微生物浓度有所降低，活性也随之降低至37.81 ng·m-3荧光素钠. 到了12月23日08:00，出现雾天，相对湿度增加，PM2.5和AQI略有增加，总微生物浓度跃升至4.84×105 cells·m-3，活性略微增加至41.84 ng·m-3. 12月24日，风速很低，又出现霾天. AQI和PM2.5显著增加，但活性变化不大，为41.65 ng·m-3，总微生物浓度有所降低. 12月25日霾天又转化为雾天，AQI和PM2.5略有降低，活性略有升高，但是总微生物浓度显著降低. 12月26日08:00，AQI依然高达236，但雾-霾逐渐消散，天空逐渐放晴，雾-霾消散会使得空气中有毒物质含量减少，但此时空气中仍然悬浮着大量颗粒物，总微生物浓度略有升高，微生物活性逐渐升至72.15 ng·m-3. 12月27日出现大风降温天气，温度、 湿度显著降低，风速增加至6.2 m·s-1,雾-霾彻底消散，AQI和PM2.5迅速降低至35和14，微生物活性也降低到31.37 ng·m-3，比晴天时微生物活性降低68.7%，为整个连续雾-霾过程中最低值，然而此时总微生物浓度升高到了整个过程中的最高值. 大风降温天气对生物气溶胶浓度有着双重影响. 一方面，风速增大使地面的尘埃和泥沙在风的动力作用下进入空气中增加了气溶胶中总微生物浓度，同时又可以使生物气溶胶颗粒在风的扰动下随气流在垂直和水平方向上扩散，使气溶胶中总微生物浓度降低. 分析其原因可能是由于在采样期间内大风降温的综合作用体现为增加总微生物浓度并且对空气中细颗粒物有显著的净化作用. 虽然反映微生物数量的总微生物浓度增加了，但是在大风强降温天气中温度降低幅度很大，限制了微生物的生长繁殖，因此微生物活性显著降低[28]. 可见，从12月21~26日雾-霾天结束，随着雾、 霾的出现和持续，微生物活性逐渐降低，和风速的变化相似，随着风速增加，霾天缓慢消散，微生物活性又有增加的趋势，这与之前的微生物活性与风速存在正相关一致. 霾天初现时，微生物活性较晴天低，降低了22.9%，但随着雾-霾天持续出现，可能由于环境中污染物的持续积累，不利于微生物存活，活性迅速降低了68.7%. 可见，持续雾-霾天对微生物活性的影响更大更复杂.
6 结论冬季青岛地区气溶胶中微生物活性水平在21.89~108.59 ng·m-3，较2012年有所升高，微生物活性日变化较大，并未呈现出明显的变化规律. 微生物活性的粒径分布呈现活性随粒径增大而增大，粗粒径高于细粒径的特征. 霾天对微生物活性有很大影响，活性显著降低，且持续雾-霾天对微生物活性影响更加复杂. 本研究期间微生物活性与风速存在显著正相关关系，与其他气象和空气污染因子无显著相关性. 不同气团来源的微生物活性存在明显差异. 要全面了解影响微生物活性的主要环境因素，有待于在不同地区不同时间收集更多样品，进行深入研究.
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