2016, Vol. 37
挥发性甲基硅氧烷(volatile methyl siloxanes, VMSs)是以Si—O键作为骨架、以连接在Si原子上的甲基作为侧链的低聚物，具有无色无味、稳定性好、挥发性高、润滑性强等优点，因作为有机聚硅氧烷类产品的合成中间体、副产物或降解产物而广泛地存在于个人护理品、化妆品和家居用品中[1].世界经合组织(OECD)和美国EPA已将环状VMSs中的D4~D6列为高产量物质；而在我国，D3~D6的表观消费量亦高达330 000 t(2007年)，自2000年以来增长了近5倍[2].环境调查表明，VMSs在全球范围的各种环境介质中均被广泛检出，包括空气、水、沉积物和土壤等，甚至在两极地带也有检出[3~5].毒理学研究发现，环状VMSs能导致大鼠繁殖能力损伤和肺血管矿物化，并具有雌激素效应[6]. VMSs的高产量、环境广泛存在性和毒性使其成为备受关注的新型环境污染物.
VMSs在生物体内有着较高的生物富集性(生物浓缩系数BCF为1 010~13 300 L ·kg-1 [6])，但是不同的VMSs单体之间存在着较大差异，而导致该差异的具体因素尚不清晰.有研究利用动力学模型解析了VMSs在生物中的富集过程，发现VMSs的生物富集性对于代谢速率非常敏感，并提出生物富集评价不能完全依靠lgKow，应该重点考虑其代谢行为[7].但是，VMSs在水生生物中的代谢研究还非常匮乏，现有的研究仅仅关注D4、 D5和D6. Woodburn等[8]通过鱼体暴露观察到D4和D5在虹鳟鱼中有代谢现象，Varaprath等[9, 10]的暴露实验也发现D4和D5可在大鼠体内代谢成一系列羟基含量不同的短链硅醇.而城市污水的调查表明，VMSs在城市污水中被检出的种类高达16种，其中链状VMSs占出水VMSs总量的40%[11]，说明这些物质都可能通过水环境富集于水生生物.因此，有必要对VMSs的代谢速率进行全面测试来评估其生物富集性.
本研究采用一级代谢动力学的测试方法，结合肝微粒体的体外代谢体系[12]，选择了16种常见VMSs(D3~D6、 L3~L14)，来测定其在鱼和鸟中的代谢速率，探究影响物质之间代谢差异的因素及代谢速率和生物富集性的关系.
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器八甲基环四硅氧烷(D4)购自Fluka(St.Louis, MO, USA)，十甲基环五硅氧烷(D5)和十二甲基环六硅氧烷(D6)购自TRC(Toronto, Canada)，六甲基环三硅氧烷(D3)、八甲基三硅氧烷(L3)和十甲基四硅氧烷(L4)购自CNW(Düsseldorf, Germany)，十二甲基五硅氧烷(L5)、四(三甲基硅氧基)硅烷(M4Q)和硅酮油(黏度为5×10-6 m2 ·s-1，含L6~L14)购自Aldrich(St.Louis, MO, USA)，苯并[a]芘(B[a]P)和氘代二萘嵌苯(perylene-d12)购自o2si(Charleston, SC, USA)，它们的结构式见图 1. Bradford试剂盒购自Sigma-Aldrich(St.Louis, MO, USA)，NADPH重生系统购自Promega(Madison, WI, USA)，二硫苏糖醇(DTT)购自Merck(Kenilworth, NJ, USA)，丙酮(农残级)购自J. T. Baker(Center Valley, PA, USA)，正己烷(农残级)购自Fisher(Pittsburgh, PA, USA)，正壬烷(99%)购自Alfa Aesar(Ward Hill, MA, USA). KH2PO4、 K2HPO4 ·3H2O、 MgCl2 ·6H2O、 EDTA、甘油和蔗糖均为分析纯.
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图 1 各标准品的结构式 Fig. 1 Molecular structures of standards |
实验中的仪器有Beckman Coulter L-80XP高速离心机、 Thermo Scientific Multiskan FC酶标仪和Agilent 5975C气相色谱-质谱联用仪.
1.2 肝微粒体的制备实验所用鲈鱼购自山东青岛的渔场，质量约为2 kg.肝微粒体的制备基于Dyer等[13]的研究方法.取约5 g新鲜肝组织(每次取样，混合5~6个个体的肝组织)，加入15 mL 25 mmol ·L-1 PBS提取缓冲液(pH=7.4，含1.25 mmol ·L-1 EDTA、 10%甘油、 1mmol ·L-1 DTT)，研磨均匀，在4℃下10 000 r ·min-1离心15 min.取其上清液(S9)，在4℃下100 000 r ·min-1离心60 min.最后取出下层颗粒物(微粒体)，用50 mmol ·L-1 PBS保存缓冲液(pH=7.4，含1 mmol ·L-1 EDTA、 20%甘油)稀释至约15 mL，冻存于液氮中.
本实验所用鹌鹑购自山东日照的农场，质量约为0.35 kg.肝微粒体的制备基于Diaz等[14]的研究方法.取约5 g新鲜肝组织(每次取样，混合5~6个个体的肝组织)，加入15 mL 20 mmol ·L-1 PBS提取缓冲液(pH=7.4，含1 mmol ·L-1 EDTA、 250 mmol ·L-1蔗糖)，研磨均匀，在4℃下10 000 r ·min-1离心30 min.取其上清液(S9)，在4℃下98 000 r ·min-1离心90 min.最后取出下层颗粒物(微粒体)，用20 mmol ·L-1 PBS保存缓冲液(pH=7.4，含1 mmol ·L-1 EDTA、 250 mmol ·L-1蔗糖、 20%甘油)稀释至约15 mL，冻存于液氮中.
实验操作均在冰面进行.微粒体的蛋白含量采用Bradford试剂盒-酶标仪法进行测试.
1.3 VMSs的体外代谢鲈鱼肝微粒体的体外代谢体系中，依次加入39 μL 50 mmol ·L-1 PBS暴露缓冲液(pH=7.4，含1 mmol ·L-1 EDTA、 20%甘油、 1 mmol ·L-1 DTT)、 50 μL NADPH重生系统A液和10 μL B液，再用进样针取1 μL标准样品的丙酮溶液加至液面下方，最后加入100 μL鲈鱼肝微粒体启动反应[体系初始浓度： D3~D6和L3~L5为4 μmol ·L-1，硅酮油为4 μmol ·L-1(分析浓度较高的L6~L9)和15 μmol ·L-1(分析浓度较低的L10~L14)，B［a]P为0.5 μmol ·L-1］，涡旋混匀后置于恒温箱中，在25℃下培养，摇床速度为120 r ·min-1.暴露的时间梯度为0、 1、 3、 5、 8 h，每个时间点做3次平行样品.
鹌鹑肝微粒体的体外代谢体系中，依次加入39 μL 50 mmol ·L-1 PBS暴露缓冲液(pH=7.4，含0.5 mmol ·L-1 EDTA、 5 mmol ·L-1 MgCl2)、 50 μL NADPH重生系统A液和10 μL B液，再用进样针取1 μL标准样品的丙酮溶液加至液面下方，最后加入100 μL鹌鹑肝微粒体启动反应[体系初始浓度： D3~D6和L3~L5为4 μmol ·L-1，硅酮油为4 μmol ·L-1(分析浓度较高的L6~L9)和15 μmol ·L-1(分析浓度较低的L10~L14)，B［a]P为2 μmol ·L-1］，涡旋混匀后置于恒温箱中，在39℃下培养，摇床速度为120 r ·min-1.暴露的时间梯度为0、 10、 30、 50、 80 min，每个时间点做3次平行样品.
培养结束时，加入200 μL冰冻丙酮终止反应.涡旋混匀后，分别加入20 μL 250 μg ·L-1的M4Q与perylene-d12作为内标，用1.5 mL正己烷萃取3次.合并有机相后，加入50 μL正壬烷作为溶剂保持剂，用N2气浓缩至约50 μL.最后封装保存于-20℃.
1.4 GC-MS分析使用Agilent HB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm).进样量为1 μL，进样口温度为200℃，不分流进样.以高纯He为载气，流速1.0 mL ·min-1.程序升温设置：起始温度为40℃，保持2 min；以5℃ ·min-1的速率升温至90℃；接着以10℃ ·min-1的速率升温至150℃；最后以30℃ ·min-1的速率升温至300℃，保持5 min.
采用电子轰击(EI)离子源，温度为200℃，四级杆温度为150℃.以选择离子模式(SIM)进行数据采集.各分析物的选择离子见表 1，VMSs的特征峰为[M-CH3]+或[L3-CH3]+(对于长链VMSs)，PAHs的特征峰为其分子离子峰.
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表 1 各分析物的选择离子 Table 1 Selective ions of each analyte |
1.5 数据处理
VMSs在肝微粒体体系的代谢符合一级反应动力学，即：
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(1) |
式中，c为底物浓度，单位为μg ·L-1；t为培养时间，单位为h；k为一级动力学速率常数，单位为h-1.式(1)积分后可得：
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(2) |
式中，c0与ct分别为底物的初始浓度和在t时刻的浓度，单位为μg ·L-1；回归曲线的斜率为k.
化学物质在体外代谢实验中的固有清除率为：
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(3) |
式中，CL为固有清除率，单位为mL ·(h ·mg)-1；c蛋白为体系中蛋白的质量浓度，单位为mg ·mL-1.代谢体系中加入的B[a]P用于校准不同批次样品的代谢速率差异，从而获得相对固有清除率，如下：
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(4) |
VMSs的分子结构优化采用Fujitsu的Scigress Explorer Ultra V7.7.0.47在半经验量子化学方法PM3下、水溶液状态中进行，计算的分子参数包括最高已占分子轨道的能量εHOMO、最低未占分子轨道的能量εLUMO、 εHOMO与εLUMO的能级差Δε、偶极矩大小μ、分子两端2个Si原子(环状VMSs所有Si原子)所带电荷量的平均值QSi、分子两端2个O原子(环状VMSs所有O原子)所带电荷量的平均值QO、分子两端6个C原子(环状VMSs所有C原子)所带电荷量的平均值QC.
D4~D6和L3~L4的辛醇-水分配系数lgKow为实测值[15]，其余VMSs的lgKow值采用美国EPA的EPI suite V4.11计算所得.
回归分析由SPSS PASW Statistics V18.0.0完成.
2 结果与讨论 2.1 鲈鱼体外代谢速率VMSs和B[a]P在鲈鱼肝微粒体中的代谢符合一级动力学，一级动力学的线性拟合关系如图 2(a)所示. VMSs的固有清除率为0~0.031 mL ·(h ·mg)-1(表 2).其中，大部分VMSs(D3~D5和L4~L14)在鲈鱼肝微粒体中难以代谢，与POPs物质(如大部分PCBs、 BDE-47、 BDE-154等)在鱼肝微粒体中难以代谢的行为相似[16]. D6和L3被观测到有稳定代谢的现象，固有清除率为0.018~0.031 mL ·(h ·mg)-1，该代谢速率与代谢较慢的个人护理品(香水成分)的固有清除率相近[异长叶烷酮、甲基柏木酮等，0.10~0.19 mL ·(h ·mg)-1][17].结果说明VMSs在鱼体中难以代谢或代谢缓慢，该结果与利用药代动力学在鱼体中拟合计算出的低代谢速率相一致(4.5×10-5~1.14×10-4 h-1)[7].
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图 2 VMSs和B[a]P在鲈鱼和鹌鹑肝微粒体中的代谢 Fig. 2 VMSs and B[a]P metabolized in liver microsomes of weever and quail |
肝脏体外代谢体系的再现性具有不稳定性，容易造成不同批次之间物质代谢速率的偏差较大，难以被直接比较.例如，Fay等[18]的肝细胞代谢研究中，同种物质在同一实验室获得的固有清除率偏差系数达4.1%~30%；而不同实验室之间的差异甚至高达27%~61%.因此，本实验引入可稳定代谢、常用于体外代谢测试的B[a]P作为基准物质，校准不同批次肝脏样品的酶活性水平和代谢能力，能极大降低肝脏体外代谢体系的实验偏差，便于比较各VMSs的代谢速率. B[a]P在鲈鱼肝微粒体中的固有清除率为(0.040±0.011) mL ·(h ·mg)-1，与以往研究报道的0.032~0.088 mL ·(h ·mg)-1(虹鳟鱼肝脏S9和微粒体)[19]、 (0.37±0.12) mL ·(h ·mg)-1(虹鳟鱼肝脏S9)[20]相当.经B[a]P校正后，D3~D5和L4~L14的相对固有清除率为0；D6和L3的相对固有清除率为0.27~0.66(表 2).
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表 2 VMSs的体外代谢固有清除率/mL ·(h ·mg)-1 Table 2 In vitro intrinsic clearance rates of VMSs/mL ·(h ·mg)-1 |
2.2 鹌鹑体外代谢速率
为了验证鹌鹑代替水生鸟类研究化学物质代谢行为的合理性，本文测试了鹌鹑肝微粒体的代谢酶活性.结果表明鹌鹑肝微粒体中EROD酶、 PROD酶、 MROD酶和BROD酶的活性分别为(6.8±0.1)、 (1.7±0.8)、 (10.5±2.2)和(10.7±0.3) pmol ·(min ·mg)-1.该数值与已报道的海鸥、海燕、鹧鸪、鸡等鸟类的酶活性水平相当[4种CYP酶的活性分别为2.2~23、 0.9~2.6、 1.7~33和11 pmol ·(min ·mg)-1][21~23].因此，鹌鹑适合作为模式动物研究化学物质在水生鸟类中的体外代谢行为.本研究中，B[a]P在鹌鹑肝微粒体中代谢的固有清除率为(1.4±0.2) mL ·(h ·mg)-1，是在鲈鱼肝微粒体中的35倍.鉴于鸟类对于化学物质的代谢速率远高于鱼类，本研究将鹌鹑的体外代谢的培养时间缩短为0~90 min，而B[a]P的初始浓度则需提高至2 μmol ·L-1.
本研究首次测定了VMSs在鸟中的代谢速率. 16种VMSs在鹌鹑肝微粒体中均能稳定代谢并符合一级动力学规律[图 2(b)]，固有清除率为0.25~1.7 mL ·(h ·mg)-1(表 2). VMSs在鲈鱼肝微粒体中的固有清除率只有其在鹌鹑肝微粒体中的0%~4.7%，说明VMSs在鹌鹑中的代谢速率显著高于鲈鱼，这与文献报道的鸟类肝脏酶活性高于鱼类(约为2~21倍)相符[24].
利用B[a]P校正后的相对固有清除率比较不同VMSs的代谢速率差异，发现D3~D4和L6~L14代谢较慢，相对固有清除率为0.18~0.50；D5~D6和L3~L5代谢较快，相对固有清除率为0.83~1.1.值得注意的是，环状VMSs的相对固有清除率随Si原子数的增加而上升，链状VMSs则随Si原子数的增加而有下降趋势(图 3).
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图 3 VMSs在鹌鹑肝微粒体中的相对固有清除率 Fig. 3 Relative intrinsic clearance rates of VMSs in liver microsomes of quail |
为了解析影响VMSs代谢速率的主要因素，进一步研究了VMSs代谢速率与其理化性质指标的关系.选出VMSs的理化性质指标包括：能量参数(εHOMO、 εLUMO和Δε)、几何参数(μ)、电性参数(QSi、 QO和QC)和疏水参数(lgKow).经结构优化与量子化学计算，VMSs各分子的理化性质如表 3所示.以VMSs相对固有清除率为因变量，VMSs各理化参数为自变量，进行逐步多元线性回归后，留下显著性的自变量为lgKow和QC，可获得如下回归关系：
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(5) |
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表 3 VMSs的理化性质 Table 3 Physicochemical properties of VMSs |
一般认为，有机物的代谢速率随lgKow的增加而下降[25]，即亲脂性越高，可被生物利用、转化的难度越大.然而lgKow并不是决定代谢速率的唯一因素，分子体积、形成氢键的能力[26]、电荷分布、刚体的转动惯量[27]等也会对有机物在生物体内的代谢造成较大影响，如PBDEs在大鼠肝微粒体中的代谢降解速率与分子体积呈负相关，与εHOMO、 μ等呈正相关[28].本研究的计算结果表明，VMSs的lgKow与相对固有清除率呈负相关，这与传统研究的结果相符[24]，但是不能忽略物质电性参数(QC)对其代谢的影响.电性参数对代谢的影响可能解释为：在分子电中性的条件下，C原子所带负电荷越多，使得与其相连的Si原子所带正电荷越多，越容易接受O的进攻从而被氧化.这与经典的Fleming-Tamao氧化反应机理类似： Si原子的正电荷越多，越有利于过氧基团或其他氧化物种对Si原子的进攻，形成Si—O键；同时C原子的负电荷越多，越有利于烷基向过氧基团的亲电性O上迁移，该过程最终使得Si—C键被氧化为Si—O键[29].
2.3 对生物富集性的指示意义化学物质的生物富集性，是其在生物体内的同化作用和代谢过程共同决定的[12].其中，亲脂性指标(lgKow)已经被世界各国政府和组织用来评估化学物质的生物富集性；而代谢速率由于测试问题往往被忽略，容易导致生物富集性预测的不确定性.生物蓄积性模型的模拟结果表明，代谢能够显著影响超疏水性物质的生物蓄积性[30].比如：多环芳烃虽然亲脂性较高，但由于在生物体内极易代谢[31]，在食物网中呈现营养层次稀释现象[32].活体动物实验能准确评估化学物质的生物蓄积性，因为活体暴露综合考虑了污染物的吸收、分布、代谢和排泄关键环节，但是对于众多化学物质不可能一一进行动物暴露测试.相比之下，体外测试体系快速便捷并且更为经济，适用于化学物质的快速评估.本研究开发的肝微粒体体外代谢方法能够评估污染物的代谢速率，另外污染物在生物体内的吸收、分布和排泄均由其lgKow决定.因此，对体外代谢速率及亲脂性的分析测试有助于快速而准确地评估化学物质的生物富集性.
在本研究中，VMSs的lgKow为5~23，具有高亲脂性；而鲈鱼肝微粒体的代谢速率测试表明，D3~D5难以代谢，D6可缓慢代谢，说明D3~D5应该具较高的生物富集性.这与McGoldrick等[33]的研究结果相符：加拿大伊利湖底栖水生食物网中，D4和D5呈生物放大性，D6在食物网中呈现生物不放大.同样的，Jia等[2]和Borgå等[34]的研究发现，D5在中国大连湾和挪威淡水湖泊食物网呈现显著的生物放大.另外，现有报道仅以鱼类作为最高营养级生物.本研究发现D3~D6均能在鹌鹑肝微粒体代谢体系中稳定代谢，该结果表明D3~D6在以鸟类为最高营养级生物的食物网中可能不存在明显的生物放大现象.
针对链状VMSs，本研究发现鲈鱼肝微粒体代谢体系中，L4~L14难以代谢，而L3可缓慢代谢；鹌鹑肝微粒体代谢体系中，L3~L14均能稳定代谢.结果表明，L4~L14可能在以鱼类为终点的食物链中存在显著的生物放大现象.但是，目前未有关于链状VMSs生物富集性的报道，L4~L14在鱼类中的富集行为值得进一步探究.
3 结论(1)鲈鱼肝微粒体代谢体系中，D3~D5和L4~L14难以代谢；D6和L3的固有清除率为0.018~0.031 mL ·(h ·mg)-1，相对于B[a]P的固有清除率为0.27~0.66. D5在鲈鱼肝微粒体中难以代谢，与其在水生食物网中呈现显著生物放大性相一致；L4~L14均难以代谢，表明链状VMSs类物质可能具有较高的生物富集性，需要进一步探究.
(2)鹌鹑肝微粒体代谢体系中，VMSs固有清除率为0.25~1.7 mL ·(h ·mg)-1，相对于B[a]P的固有清除率为0.18~1.1 mL ·(h ·mg)-1. VMSs在鹌鹑中的代谢速率显著高于鲈鱼.量子化学计算表明，VMSs相对固有清除率的大小主要取决于lgKow和QC，电性参数对代谢的影响与Fleming-Tamao氧化反应机制相似.代谢速率结合lgKow表明D3~D6和L3~L14在鸟类中可能不存在明显的生物放大现象.
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