自养微生物在农田土壤中广泛分布，它们具有同化CO₂并将其转化为土壤有机碳的能力，对调节大气中CO₂浓度和提高农田土壤的碳固定有着重要意义^{[1, 2]}.卡尔文循环(Calvi-Bussham cycle)是自养微生物同化CO₂的主要途径，其中核酮糖-1，5-二磷酸梭化酶/加氧酶(RubisCO)是卡尔文循环中的关键酶，由cbbL基因编码^[3].近年来，利用cbbL基因对农田土壤自养微生物及其碳同化过程的研究已取得较大进展.结合碳同位素示踪实验，研究者发现参与农田土壤碳同化的主要是兼性自养微生物，且农田土壤自养微生物多样性、群落结构及其碳同化量受土壤类型^{[2, 4, 5]}、施肥措施^{[6, 7]}、土壤深度^[8]、根际效应^[9]和耕作制度^[10]等多种因素的影响.这些因素通过改变土壤的物理化学性质而影响土壤自养微生物多样性和群落结构，进而对土壤自养固碳微生物介导的碳同化过程产生影响.

土壤质地是土壤较为重要的物理特性之一，一方面，土壤质地可直接影响土壤的孔隙状况，进而影响土壤的透光率和通气性^[11]；另一方面，土壤质地还会影响土壤的养分状况和水分含量，从而影响微生物的生存环境及其代谢活性^{[12, 13]}.土壤通气透水以及土壤肥力水平是影响自养微生物碳同化过程的重要生态因子^{[1, 6, 14]}，不同质地土壤中这些生态因子的差异可能对自养微生物群落结构及其碳同化过程产生重要影响，然而，目前有关土壤质地对自养微生物多样性、群落结构及其碳同化量影响的研究还鲜见报道.因此，本研究选取亚热带地区同一母质发育而成的两种质地水稻土壤(壤质黏土和砂质黏壤土)，采用¹⁴ C-CO₂连续标记技术结合室内模拟实验，量化不同质地土壤自养微生物同化碳(¹⁴ C-SOC)、自养微生物截留碳(¹⁴ C-MBC)和自养微生物可溶性碳(¹⁴ C-DOC)的差异；同时采用分子生物学技术，基于细菌cbbL基因对土壤自养微生物群落结构和多样性进行分析，通过揭示不同质地稻田土壤自养微生物碳同化的机制，以期为更深入全面了解稻田土壤微生物固碳机制及其影响机制提供理论和数据支持.

供试土壤于2010年10月采自湖南省长沙县干杉镇水稻田，共采集壤质黏土和砂质黏壤土2种质地土壤，均为河流冲积物发育的水稻土.采用直径为5 cm的不锈钢土钻采集0~20 cm耕作层土壤，去除石块和根系后运回实验室风干.风干土壤过0.25 mm筛，混匀后分为两部分，一部分用于测定土壤基本理化性质(用于SOC测定的土壤过0.149 mm筛)；剩余土壤用蒸馏水调节含水量至饱和田间持水量，分装于直径为10 cm、高为20 cm的PVC盆钵，每钵装入量为1.00 kg(以烘干后的质量计)，装入高度为17 cm，每种土壤设置4个重复，在25℃预培养14 d.两种供试土壤的基本理化性质见表 1.

表 1 (Table 1)

表 1 供试土壤基本理化性质 Table 1 Physical and chemical characteristics of the investigated soils 土壤质地 机械组成 理化性质 砂粒含量 /% 粉砂粒含量 /% 黏粒含量 /% pH SOC /g·kg-1 TN /g·kg-1 TP /g·kg-1 CEC /cmol·kg-1 壤质黏土 39.04 21.20 39.76 6.15 21.89 2.64 1.05 11.79 砂质黏壤土 59.65 22.06 18.29 5.09 17.03 2.52 0.58 5.6

表 1 供试土壤基本理化性质 Table 1 Physical and chemical characteristics of the investigated soils

将预培养后的装盆土壤转移至¹⁴ C-CO₂标记箱进行连续标记培养，培养装置和方法参考Ge等^[15]建立的方法，连续标记培养时间为110 d. ¹⁴ C-CO₂由¹⁴ C-NaHCO₃(1 mol ·L^-1，16.5×10³ Bq ·mL^-1)和HCl(1 mol ·L^-1)反应生成，通过调节¹⁴ C-NaHCO₃和HCl溶液的加入量和加入次数使标记箱内CO₂浓度维持在350 μmol ·mol^-1.标记箱内温度白天为31℃±1℃，夜间为24℃±1℃，光照时间为08:00~20:00(时间形式修改正确)，相对湿度为80%~90%，光照强度约为500 mmol ·(m² ·s)^-1 PAR.标记培养过程中，及时补充去离子水维持土壤水层深度1~2 cm.

110 d连续标记培养结束后，采集PVC盆钵内供试土壤样品并充分混匀.一部分立即处理，用于含水率、¹⁴ C-MBC和¹⁴ C-DOC的测定；一部分室内自然风干后过0.149 mm筛，用于¹⁴ C-SOC含量的测定；一部分(约100 g)用液氮速冻后转移至-80℃冰箱，用于固碳自养微生物群落组成分析.

以水为浸提剂，采用水土比2.5 :1测定土壤pH；土壤阳离子交换量采用EDTA-铵盐快速滴定法测定；土壤机械组成采用吸管法测定；土壤有机碳(SOC)和全氮(TN)采用碳氮元素分析仪(VARIO MAX，Germany)测定；土壤全磷采用碱熔-钼锑抗分光光度计法(UV-2450，Japan)测定.

土壤总有机碳中¹⁴ C放射性强度采用Wu等^[17]方法：称取1.5 g土壤样品至双颈烧瓶中，向烧瓶加入20 mL重铬酸钾(0.2 mol ·L^-1)溶液和体积比为5 :1的浓硫酸-浓磷酸混合液(30 mL)作为氧化剂，165℃回流消化8 min，随后持续向双颈烧瓶中通入O₂，继续消化10 min，消化过程中产生的CO₂经分离纯化后用40 mL NaOH溶液充分吸收(0.4 mol ·L^-1).吸收液中¹⁴ C放射性强度(¹⁴ C-SOC)采用液体闪烁仪(LS-6500，Beckman)测定. ¹⁴ C-SOC含量计算方法参见文献[18].

¹⁴ C-MBC和¹⁴ C-DOC含量测定参考Wu等^[19]建立的氯仿熏蒸提取-碳自动分析仪法进行：称取4份10.00 g新鲜土壤，其中两份按1 :4的土水比加入K₂SO₄浸提液(0.5 mol ·L^-1)，另两份在真空干燥器内用氯仿熏蒸24 h，去除氯仿后立即浸提.浸提液中¹⁴ C放射性强度采用液体闪烁仪(LS-6500，Beckman)测定，根据不熏蒸土样浸提液中¹⁴ C放射性强度计算¹⁴ C-DOC含量，根据熏蒸土样与不熏蒸土样浸提液¹⁴ C放射性强度之差计算¹⁴ C-MBC含量，计算方法参见文献[2, 18].

采用FastDNA土壤试剂盒(Mpbio，USA)分别提取壤土和砂土DNA，并利用紫外分光光度计(Nanodrop, Germany)测定DNA的浓度和纯度.采用引物K_2f(5′-ACCA[C/T]CAAGCC[G/C]AAGCT[C/G]GG-3′)和V_2r(5′-GCCTTC[C/G]AGCTTGCC [C/G]ACC[G/A]C-3′)分别扩增细菌cbbL基因片段^[20]. PCR扩增反应体系配置如下： 12.5 μL 2×PCR MasterMix(天根，中国)，DNA模板约50 ng，上下游引物各0.1 μmol ·L^-1，无菌水补至25 μL.扩增程序采用梯度降落PCR程序，反应条件如下： 95℃预变性3 min，5个循环为95℃变性30 s，66~62℃退火50 s, 72℃延伸90 s，每次循环退火温度降低1℃；后30个循环为95℃变性45 s，62℃退火50 s，72℃延伸90 s；72℃最终延伸10 min. PCR扩增产物用1.2 %琼脂糖电泳检测，采用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根，中国)回收目标片段，方法按说明书进行.将PCR回收产物与pGEM-Teasy(Promega，德国)载体连接后，转入E.coil DH5α 感受态细胞，构建重组质粒，通过蓝白斑筛选，随机挑选白色菌落，采用载体通用引物SP6和T7鉴定阳性克隆，筛选含目标片段的克隆送至华大基因公司测序，分别建立壤土和砂土细菌cbbL基因文库.利用Mothur软件对所获得的cbbL基因序列进行分析，将相似性大于95%的序列归为同一个操作单元(OTUs).将OTU的代表性核苷酸序列翻译为氨基酸序列，在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blastx)中进行同源性比对，挑选相似度较高的同源氨基酸序列，并利用MEGA 6.0中的邻接法(Neighbor-joining)构建系统发育树.本研究所得序列在EMBL中的登录号为LT559266-LT559471.

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 16.0对数据进行处理和统计分析，不同质地土壤差异显著性采用独立样本t检验.采用Mothur软件分析细菌cbbL克隆文库覆盖度(Coverage)、物种丰富度指数(Richness、ACE和Chao)和物种多样性指数(Simpson和Shannon).利用Mothur软件中的Libshuff命令检验不同质地土壤自养微生物群落组成的差异显著性(P < 0.05).

连续标记培养110 d后，不同质地土壤中均检测到了¹⁴ C-SOC.壤质黏土¹⁴ C-SOC含量范围为129.83~141.66 mg ·kg^-1，砂质黏壤土¹⁴ C-SOC含量范围为95.80~112.91 mg ·kg^-1.两种质地土壤¹⁴ C-SOC平均含量差异达显著水平，表现为壤质黏土高于砂质黏壤土(表 2)，说明土壤微生物同化碳含量受土壤质地的影响.壤质黏土¹⁴ C-MBC和¹⁴ C-DOC含量分别为37.82~59.35 mg ·kg^-1和7.68~9.02 mg ·kg^-1，砂质黏壤土¹⁴ C-MBC和¹⁴ C-DOC含量分别为29.47~37.50 mg ·kg^-1和3.60~4.79 mg ·kg^-1，壤质黏土¹⁴ C-MBC和¹⁴ C-DOC平均含量均显著高于砂质黏壤土(表 2)，表明土壤质地影响了自养微生物同化碳在土壤中的转化过程.

表 2 (Table 2)

表 2 不同质地土壤14 C-SOC、 14 C-MBC和14 C-DOC含量1)/mg ·kg-1 Table 2 Contents of 14 C-SOC, 14 C-MBC and 14 C-DOC in soils with different texture/mg ·kg-1 土壤质地 14C-SOC含量 14C-MBC含量 14C-DOC含量 壤质黏土 133.81±2.72a 49.16±4.81a 8.10±0.32a 砂质黏壤土 104.95±4.15b 33.26±1.69b 4.18±0.34b 1)不同小写字母表示不同质地土壤之间差异显著(P < 0.05)

表 2 不同质地土壤14 C-SOC、 14 C-MBC和14 C-DOC含量1)/mg ·kg-1 Table 2 Contents of 14 C-SOC, 14 C-MBC and 14 C-DOC in soils with different texture/mg ·kg-1

构建的两种质地土壤样品微生物的cbbL基因文库中共获得335条有效细菌cbbL基因序列.从表 3可以看出，以95%序列相似度作为OTUs划分标准，从壤质黏土和砂质黏壤土中分别获得106和100个OTUs.两种质地土壤细菌cbbL基因克隆文库的覆盖度为50%~57.8%.稀疏曲线结果显示各个文库的稀疏曲线趋于平缓，进一步说明本研究建立的克隆文库具有一定的代表性，能较好地反映土壤中自养微生物多样性(图 1).通过对Richness、ACE和Shannon等多样性指数进行分析，发现壤质黏土自养微生物多样性高于砂质黏壤土(表 3). Libshuff分析结果显示，壤质黏土和砂质黏壤土细菌cbbL基因克隆文库存在显著性差异(P < 0.05)，说明土壤质地对含cbbL基因的自养微生物群落结构造成了显著影响.

图 1

Fig. 1

图 1 不同质地土壤细菌cbbL克隆文库的稀疏曲线 Fig. 1 Rarefaction curves of bacterial cbbL genes in clone libraries from different texture soils

表 3 (Table 3)

表 3 不同质地土壤细菌cbbL基因多样性 Table 3 Diversity of cbbL-containing bacteria in soils with different texture 土壤质地 克隆子数 覆盖度[8]/% Richness ACE Chao Simpson指数 Shannon指数 壤质黏土 162 50 106 636 278 0.011 6 4.425 砂质黏壤土 173 57.8 100 501 289 0.011 7 4.348

表 3 不同质地土壤细菌cbbL基因多样性 Table 3 Diversity of cbbL-containing bacteria in soils with different texture

系统发育分析结果显示，本研究获得的206个cbbL基因型以兼性自养菌(FormIC)为主.两种质地土壤cbbL基因型在第Ⅹ cbbL基因簇分布较均匀，表明不同质地土壤严格自养菌组成差异不大(图 2).壤质黏土中分别有23%和16%的cbbL基因型分布在第Ⅰ和第Ⅱ cbbL基因簇，与嗜酸柏拉红菌Rhodoblastus acidophilus、绿色绿芽菌Blastochloris viridis、腐殖质还原陶厄氏菌Thauera humireducens、高效降解菌Mehylibium sp.、贪噬菌Variovorax sp.、伯克氏菌Burkholderiales bacterium等具有一定的同源性.壤质黏土中有28%的cbbL基因型为尚未被发现的新cbbL基因型，主要分布在第Ⅲ和第Ⅶ cbbL基因簇，说明壤质黏土中可能存在较多的新的自养固碳微生物.砂质黏壤土cbbL基因型主要分布在第Ⅴ、第Ⅷ和第Ⅸ cbbL基因簇，分别占砂黏壤土cbbL基因型总数的11%、13%和24%，与Bradyhizobium、Mesorhizobium和Nitrobacter等根瘤菌以及Mycobacterium sp.、Thermomonospora curvata、Actinobacteria、Nocardia brasiliensis等放线菌同源.这些结果表明壤质黏土和砂质黏壤土中含细菌cbbL基因的兼性自养微生物群落组成差异很大.

图 2

Fig. 2

图 2 基于cbbL基因164个氨基酸序列片段构建的自养固碳微生物系统进化树 Fig. 2 Phylogenetic tree of cbbL-containing bacteria based on partial cbbL sequences (164 amino acids)

自养微生物在农田土壤中广泛存在，可以通过卡尔文循环固定大气中的CO₂，对提高农田生态系统的碳吸收和碳储存有着重要意义^{[1, 2]}.本研究对不同质地稻田土壤进行碳同位素连续标记培养实验，110 d培养结束后，两种质地土壤中均检测出了较高的¹⁴ C-SOC含量，其含量介于95.80~141.66 mg ·kg^-1，高于Yuan等^[1]报道的稻田土壤自养微生物碳同化量(46.41~64.61 mg ·kg^-1)，这说明土壤微生物确实发挥了CO₂同化能力.以往的研究结果显示仅在光照培养土壤中检测到¹⁴ C标记碳，而在黑暗培养土壤中几乎检测不到¹⁴ C^[1]，说明在本实验条件(光照培养)下，两种质地土壤中的¹⁴ C主要由自养微生物固定.但不同质地土壤¹⁴ C含量存在差异，壤质黏土¹⁴ C-SOC含量均显著高于砂质黏壤土，表明土壤质地显著影响自养微生物碳同化量，壤质黏土自养微生物具有更高的固碳潜力，这可能与自养固碳微生物的多样性和群落结构有关.与植物根际沉积碳相似^[21]，土壤自养微生物同化碳(新碳)进入土壤后也向土壤微生物量碳库(MBC)和土壤可溶性碳库(DOC)活性碳库转化，但壤质黏土自养微生物同化碳向MBC和DOC转化的量(¹⁴ C-MBC和¹⁴ C-DOC)高于砂质黏壤土，这表明土壤质地影响了自养微生物同化碳在土壤中的转化和稳定性.与砂质黏壤土相比，壤质黏土养分含量较高，因而有利于维持更高的土壤微生物数量、代谢活性以及功能多样性，促进微生物对土壤新碳的转化利用^{[2, 8]}，使得壤质黏土¹⁴ C-MBC和¹⁴ C-DOC高于砂质黏壤.

质地不同的土壤其物理化学性质也不同，而土壤的理化性质又是影响自养固碳微生物数量、活性和群落结构的重要生态因子^{[1, 7, 9]}.因此，土壤质地差异可能会引起自养固碳微生物群落结构及其多样性的变化，从而最终导致不同质地土壤自养固碳微生物碳同化量的差异.本研究通过构建cbbL基因克隆文库和系统发育分析发现本研究土壤中自养固碳微生物以兼性自养菌为主，且土壤质地对自养固碳微生物群落结构和多样性产生了显著影响，壤质黏土比砂质黏壤土具有更高的自养固碳微生物多样性.这可能与两种质地土壤理化性质不同有关. Xiao等^[9]通过冗余分析发现土壤自养微生物群落结构是土壤环境因子综合作用的结果，土壤自养固碳微生物多样性受土壤黏粒含量、阳离子交换量和土壤有机质含量的显著影响.黏粒含量和阳离子交换量越高，土壤中可溶性营养物质的积累越多，土壤养分越不容易流失^{[22, 23]}，越有利于自养固碳微生物(兼性自养微生物)的生长繁殖和活性的增强^{[1, 7, 9]}.本研究中，两种质地土壤环境和养分含量差异较大，与砂质黏壤土相比，壤质黏土黏粒含量、土壤有机质、全氮含量和阳离子含量更高.因此，壤质黏土可为土壤兼性自养微生物的生长提供更丰富的基质和能源物质，维持更高的自养固碳微生物的多样性，促进兼性自养菌的生长和代谢活性，因而壤质黏土自养微生物同化碳量较高；而砂质黏壤土黏粒组分含量低，营养物质和养分积累少，能为兼性自养菌提供的碳源和能源有限，自养固碳微生物多样性相对较低，生长代谢活动较弱，因而砂质黏壤土自养微生物同化碳量较低.此外，运用Libshuff命令分析结果显示壤质黏土和砂质黏壤土的细菌cbbL基因文库存在显著性差异(P < 0.05)，说明土壤质地影响了细菌cbbL的群落结构.壤质黏土cbbL基因序列与Rhodoblastus acidophilus、 Blastochloris viridis、 Thauera humireducens、Mehylibium sp.和Variovorax sp.等具有较高的同源性，而砂质黏壤土cbbL基因序列则与一些根瘤菌和放线菌同源.稳定同位素核酸探针(DNA-SIP)分析结果表明，Rhodoblastus acidophilus (原Rhodopseudomonas)、Mehylibium sp.、Variovorax sp.和Bradyhizobium等具有较强的CO₂同化能力，是参与稻田土壤CO₂固定的主要自养微生物类群^[24].目前对放线菌CO₂同化能力的研究较少，尽管许多放线菌全基因组序列中含有cbbL基因，不过，已证实的能通过卡尔文循环固定CO₂的放线菌菌群还非常少^[25~27].因此，不同质地土壤自养固碳微生物群落组成的差异可能是导致其碳同化量差异的另一重要原因，因为不同类型固碳细菌同化CO₂的能力不同.

(1) ¹⁴ C-CO₂连续标记培养110 d后，壤质黏土¹⁴ C-SOC含量范围为129.83~141.66 mg ·kg^-1，而砂质黏壤土¹⁴ C-SOC含量范围为95.80~112.91 mg ·kg^-1，壤质黏土¹⁴ C-SOC平均含量显著高于砂质黏壤土，说明壤质黏土有更高的固碳潜力.

(2) 土壤质地影响了土壤自养微生物同化碳在土壤中的转化，¹⁴ C-CO₂连续标记培养110d后，壤质黏土¹⁴ C-MBC和壤质黏土¹⁴ C-DOC平均含量分别为49.16 mg ·kg^-1和8.10 mg ·kg^-1，显著高于砂质黏壤土¹⁴ C-MBC和¹⁴ C-DOC平均含量(33.21 mg ·kg^-1和4.18 mg ·kg^-1).

(3) 土壤质地改变了土壤自养固碳微生物群落结构(P < 0.05)和多样性，壤质黏土具有更高的自养固碳微生物多样性.