2016, Vol. 37
2. 中国科学院南京土壤研究所土壤与农业可持续发展国家重点实验室, 南京 210008
2. State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China
土壤反硝化是土壤氮素循环的重要环节，其基本过程是： NO3-→NO2-→NO→N2O→N2，反硝化作用能够把土壤固定的氮和人为活化氮以N2的形态返回到大气氮库中，因而反硝化过程是土壤氮素损失的主要途径之一.反硝化过程是复杂的微生物化学过程，凡是对生物活动如活性、数量、种类等有影响的因素对土壤反硝化作用均有影响，主要的影响因素可能包括:土壤含水量(通气状况)、土壤有机质、土壤质地、C/N比、氮源的供应(NH4+-N、NO3--N、总氮的含量)、土壤pH和温度等土壤理化性质[1~3].
近年来，由于生物炭固碳技术的兴起，引起了科学家们的高度重视.生物炭施入土壤后对土壤各性质的影响，也受到越来越多研究者的关注[4~6].生物炭是一种由生物质材料(包括作物秸秆、木屑、动物粪便等)在无氧或缺氧条件下经低温裂解炭化形成的性质稳定、结构复杂、富含碳的有机物质[7, 8]，生物炭中一般含有60%以上的C元素，含有的其它元素主要有H、O、N等，其次是灰分[9]，溶于水中呈碱性，故生物炭往往呈碱性，生物炭的阳离子交换量也因此有所增加[10~12].相比其他土壤改良剂，含碳率高、比表面积更大、孔隙结构丰富、理化性质稳定是生物炭固有的特点，也是生物炭能够还田改土的重要结构基础.由于生物炭自身的特性，施入土壤后与土壤颗粒之间产生交互作用，改变了土壤的环境条件，从而影响N2O的排放和反硝化过程.近年来蔬菜田用水在农业用水中的比重日趋增大，蔬菜的生产灌溉频繁，灌水量大，灌溉不仅影响土壤的含水量和孔隙度，改变土壤的氧化还原状态，而且影响氮在土壤剖面积累和分布[13, 14]，也会影响反硝化过程.
目前国内外生物炭和灌溉对土壤反硝化过程的单独作用的研究已有很多，如Singh等[15]发现，添加生物炭能够增加土壤的通气性，从而抑制反硝化作用产生的N2O排放；Lehmann等[7]的研究结果表明生物质炭的高C/N比，限制了氮素的微生物转化和反硝化作用；Klemedtsson等[16]指出土壤水分是影响土壤的硝化作用和反硝化作用等生物化学过程的重要因子.但是直到现在，很少有人研究生物炭添加和灌溉量两者共同作用下对土壤反硝化过程的影响.本文选择连续两年施用生物炭和采用不同的灌水量的番茄地土壤为试验对象，研究生物炭和灌水量对番茄地土壤的反硝化损失的影响，有助于了解生物炭和灌水量对土壤反硝化损失影响的综合作用，以期为该地区农田土壤改良提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 采集土壤的试验地基本情况田间试验于2014年4月14日到8月24日和2015年4月19日到8月18日在河海大学南方地区高效灌排与农业水土环境教育部重点实验室节水与农业生态试验场(N31°86′，E118°60′，海拔144 m)进行.试验区属亚热带湿润气候，冬冷夏热、四季分明，年平均降雨量为1 021.3 mm，年平均蒸发量为900 mm，年平均气温为15.7℃，最热月平均温度为28.1℃，年无霜期为237 d，年均日照时数为2 212.8 h.气象资料由试验站的自动气象站提供.试验区内土壤类型为黄棕壤，土壤容重为1.20～1.35 g ·cm-3.土壤砂粒(0.02~2 mm)、粉粒(0.002~0.02 mm)、黏粒(0~0.002 mm)的体积分数分别为29.7%、41.4%、28.9%.
1.2 生物质炭基本性质本试验所用生物质炭是由河南三利新能源公司提供，其炭化原料为小麦秸秆，350~550℃下限氧热裂解炭化制得.施入大田前将生物质炭磨碎并通过2 mm筛，使其混合均匀.生物质炭的基本性质[17]为： pH(H2O)： 10.4，有机碳： 467g ·kg-1，全氮： 5.9g ·kg-1，并因收集时带有土粒粘附而含有20.8%的灰分，全磷： 14.43g ·kg-1，全钾： 11.5g ·kg-1.
1.3 试验设计种植试验采用完全随机区组设计，灌溉量作为主区，施生物炭量为副区，灌溉量的3个水平分别为估算作物生育期需水量ET0的50%、75%、100%，代表符号分别为W50%、W75%、W100%，3个添加生物炭水平分别为B0(折合纯碳，0)、B25(折合纯碳，25 t ·hm-2)、B50(折合纯碳，50 t ·hm-2)，共有9个处理(3个灌溉水平×3个添加生物炭水平)，3次重复，27个小区，共90 m2.灌溉作为主区随机排列，在每个主区中随机布置3个添加生物炭水平.试验点是设置在凸起的田床上，各田床中心距离0.9 m，田床宽度0.7 m，每个田床长3 m，高0.25 m.每个处理都有一个单独的滴管系统.
布置如图 1所示，生物质炭在2014年4月番茄移栽前与氮肥一起翻埋于土壤耕层10 cm左右，其中氮肥NPK(15 :15 :15)施用量为1 400 kg ·hm-2，尿素CO(NH2)2为42.86kg ·hm-2. 2015年番茄季氮肥和生物质炭施用同2014年.
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小区中不含黑点代表B0，含一个黑点代表B25，含两个黑点代表B50 图 1 田间试验布置示意 Fig. 1 Plots of experiment |
在2014年和2015年番茄收获后，每个小区在滴灌管间随机选择3个点，且保证在种植田埂的左、中、右各有一个采样点，分别采取0~10 cm土层的土样，然后将这3个点的土壤混匀，用混匀的样品代表这个小区的土样，用塑料自封袋装好，共27袋土样，带回实验室一部分风干后用于测定土壤有机碳、全氮和pH，另一部分用于室内培养试验.土壤基本性质参照文献[18]测定：土壤有机碳含量采用重铬酸钾容量法-外加热法测定；土壤全氮含量采用凯氏定氮法测定；土壤pH采用蒸馏水(土水比1 :2.5)浸提，土壤酸度计测定.
1.5 培养试验设计与分析两年培养试验设计相同：将取回的袋装新鲜土样均分成6份(相当于20 g烘干土)充分混均于318 mL三角瓶中，均匀平铺在瓶底上，共162瓶(27袋(6份/袋).根据测得的土壤的含水率和土壤持水量，用移液枪向瓶中土样均匀地加入一定量的纯净水，使所有土壤样品的含水率达到土壤质量含水量为60%，用带有两根橡胶管的橡皮塞塞住瓶口后，用704胶棒塞子周围密封.将完全相同的6个培养瓶分为两组，每组3个重复，其中一组不加乙炔，用于测定N2O和CO2产生速率；另一组在培养前充入10％的乙炔处理，即用抽气针筒从培养瓶中抽取10％ (体积分数)的气体弃去，然后抽取同体积净化后的乙炔气体(纯度＞99.9％[19])通入培养瓶中，通入10％ (体积分数)的乙炔可抑制反硝化过程中N2O还原为N2以及硝化作用过程中N2O的产生，故所测定的N2O质量浓度代表反硝化速率.
将162个三角瓶放入25℃恒温培养箱下恒温培养.通过之前的预试验(预试验培养时间为158 h，分别在4、14、26、50、74、110、158 h时采集气体样品)可得，试验进行到50 h时，土壤中氮素浓度已经很低，土壤的反硝化过程基本进行完全，之后反硝化速率基本为零，因此试验培养时间定为50 h，分别在4、14、26、50 h时刻采集气体样品，每次抽完气体用保持瓶子与大气畅通0.5 h，目的是把之前反应的存留气体完全排出，然后重新密封，乙炔处理中重新注入乙炔，重复之前操作.样品在12 h内完成测定. N2O质量浓度均用Agilent7820A气相色谱仪分析测定，色谱柱为填充80/110目Porapak-Q的填充柱. ECD检测器和色谱柱的温度分别为330、55℃.亚甲烷为载气(95%氩气+5%甲烷)，流速为35 mL ·min-1，高纯氮气作为反吹气. CO2质量浓度也由Agilent7820A气相色谱仪同步分析测定；试验结束后土壤样品立即用2mol ·L-1 KCl提取，用连续流动分析仪(Skalar San++System)测定土壤中ω(NH4+-N)与ω(NO3--N)的含量.
N2O排放速率、反硝化排放速率和有机碳矿化速率计算公式如下所示：
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(1) |
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(2) |
式中，Q表示培养T2后产生的N2O排放速率、反硝化速率和有机碳矿化速率，μg ·(kg ·h)-1；T1表示培养初始时间，一般记为0 h；T2表示培养持续时间；W2表示培养T2后产生的N2O-N或CO2-C总量，μg；W1表示开始培养第一次采样时(T1)所产生的N2O-N或CO2-C总量，μg；M表示烘干土的质量，kg；c表示测定采集气样中N2O-N或CO2-C浓度，mg ·L-1；Vg表示培养瓶气体总体积，L；Vl表示培养桶内溶液体积，L；α表示Bunsen系数，25℃时为0.55.
试验所得数据采用Excel整理分析后，对数据结果采用SPSS(19.0版本)进行交互作用和多重比较的分析[20]，并利用Excel制图.
2 结果与分析 2.1 生物炭添加对土壤基本性质的影响生物炭添加和不同灌溉处理两年试验后，按照不同试验处理分别统计土壤全氮、全碳、铵态氮(以氮计)、硝态氮与亚硝态氮(以氮计)的含量，结果如表 1所示.
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表 1 不同处理土壤的基本性质1) Table 1 Physical and chemical properties of soil with different treatments |
由表 1可知，与B0处理相比，在2014年和2015年期间在番茄地中添加一年和两年生物炭后，对土壤全碳含量增加效果明显(P < 0.05)，且随着生物炭施用量的增加而增加.土壤添加生物炭后全氮的变化与土壤有机碳含量的变化相似，与B0处理相比较，2015年B25和B50处理全氮含量分别平均提高42.6%和84.8%，全氮增加的可能原因一方面是生物炭向土壤中释放的氮素引起的[21]，另一方面是碳素为土壤微生物提供了更多的能源，因此增强了土壤的固氮作用，所以两年持续添加生物炭进入番茄地土壤后显著增加了土壤的全氮含量(P＜0.05).相反的，土壤各处理在相同生物炭添加量条件下，土壤中全氮和全碳的含量随灌水量的增加而减少，不同生物炭添加量和灌溉量的交互作用对全氮和全碳含量影响不显著.
土壤各处理在同一灌溉水平下土壤中硝态氮的含量随生物炭添加量的增加而减少，与B0处理相比较，B25和B50处理硝态氮含量分别平均减少20.9%和47.0%；铵态氮的含量变化亦是如此，与B0处理相比较，B25和B50处理铵态氮含量减小幅度分别在27.5%和38.6%左右.土壤各处理在相同生物炭添加量条件下土壤中硝态氮的含量随灌水量的增加而减少，与W50%处理相比较，W75%和W100%处理硝态氮含量分别平均减少11.2%和28.7%；铵态氮的含量变化亦是随灌水量的增加而减少；而土壤pH随着生物炭的添加而显著增加(P < 0.05).不同生物炭添加量和灌溉量的交互作用对无机氮含量的影响达到显著水平(P < 0.05)，而对pH的影响不显著.
由图 2可知土壤基本性质的变化及其与反硝化损失的关系，其中分别为番茄地土壤中硝态氮含量与反硝化损失量(培养50 h累积排放量)、土壤铵态氮含量与N2O排放总量(培养50 h累积排放量)间的关系.
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图 2 番茄地土壤中无机氮含量与反硝化损失量、N2O排放总量间的关系 Fig. 2 Relationship between inorganic nitrogen content in the soil and denitrification loss/N2O emission |
由图 3可以看出，相同灌水量条件下添加一年和两年不同量生物炭后番茄地土壤反硝化损失总量(DN)(培养50 h累积排放量)估算(以每千克土壤的排放量计算)的试验结果.两年试验土壤中，与B0相比，B25和B50处理的反硝化损失量变化相似，添加生物质炭均显著减小了反硝化损失量(P＜0.05)，减小幅度第一年为14.1%~29.4%，次年是15.0%~38.4%，生物炭加入土壤时间越长，减小反硝化损失量的效果越明显. B25和B50处理的反硝化损失量之间除2014年W50%条件下，其余处理均为差异不显著(P>0.05).
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图 3 相同灌水量条件下添加不同量生物炭后土壤反硝化损失总量 Fig. 3 Denitrification loss under different biochar amendments with the same irrigation |
由图 4可以看出相同生物炭施用量条件下不同灌水量番茄地土壤反硝化损失总量(DN)(培养50 h累积排放量)估算(以每千克土壤的排放量计算)的试验结果.反硝化损失量两年变化相似，田间灌溉量增加的处理明显减小了两年试验结束后番茄地土壤的反硝化损失量(P＜0.05)，与W50%处理相比，W75%和W100%处理的土壤反硝化损失量减小幅度两年相似，分别是21.8%~35.1%和19.2%~52.2%，而反硝化损失量在两年中都表现为随灌溉量增加而降低，特别是高灌溉量条件下.
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图 4 相同生物炭施用量条件下不同灌水量土壤反硝化损失量 Fig. 4 Denitrification loss under different irrigation with the same biochar amendments |
经方差分析结果可知，两年试验结果中不同生物炭添加量和灌溉量的交互作用对反硝化损失的影响均达到显著水平(P < 0.05)，表明两因素处理组合对番茄产量的影响不是单因素效应的简单相加，生物炭添加量和灌溉量的耦合效应共同影响番茄地土壤的反硝化损失. 表 2为生物炭施用量和灌水量交互作用方差分析结果.
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表 2 生物炭施用量和灌水量交互作用方差分析结果1) Table 2 Variance analysis of the interaction between biochar and irrigation |
2.5 生物炭添加对N2O/DN的影响
试验中不加乙炔的处理用于测定N2O的排放速率，一般说来，不加乙炔的处理测出的N2O既包括硝化作用(NH4+ NH2OH N2O NO2- NO3-)产生的N2O，也包括反硝化作用产生的N2O，农田土壤N2O排放量等于硝化和反硝化过程排放的N2O之和[22, 23].
由表 3可得，不同量生物炭的添加明显影响了N2O排放总量/反硝化损失量(DN)(P＜0.05)，随着生物炭添加量的增加N2O/DN比值逐渐减小，随着灌溉量的增加N2O/DN也随之减小.
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表 3 培养结束时添加不同处理的土壤氮素气体累积排放量 Table 3 Nitrogenous gas accumulation in different treatments in the end of incubation |
2.6 土壤有机碳(CO2-C)矿化量与反硝化损失量的关系
培养试验中各时间点采集的气体亦对各处理下番茄地土壤有机碳(CO2-C)矿化量(以每千克土壤的排放量计算)进行了测定，结果表明生物炭加入土壤后减少了土壤的有机碳(CO2-C)矿化量，这与文献[24, 25]的研究结果一致；灌水量与土壤的有机碳(CO2-C)矿化量无显著相关关系.土壤中硝化和反硝化过程主要是微生物化学过程，而土壤微生物的活动需要从有机质中获得基质和能量，而有机碳(CO2-C)矿化可以为微生物活动提供这些基质和能量.
如图 5为番茄地土壤反硝化损失量、N2O排放总量与CO2排放总量之间的关系.可以看出有机碳矿化量与反硝化损失量成正相关关系(n=27)，说明了番茄地土壤微生物发生有机碳(CO2-C)的矿化作用的同时也促进了硝化反硝作用.
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图 5 番茄地N2O排放总量/土壤反硝化损失量与CO2排放总量间的关系 Fig. 5 Relationship between denitrification loss/N2O emission and CO2 mineralization |
生物炭添加和灌溉能影响番茄地土壤N2O排放及反硝化过程，在整个室内培养过程中，反硝化损失量(DN)和N2O排放量随着生物炭添加量和灌溉量的增大而显著降低.田间试验下，河南地区的玉米地施用40t ·hm-2的生物炭后N2O排放量减少[26]、太湖流域的稻田N2O排放量下降51%[17]等均与本研究结果一致，这也可以从侧面解释土壤中全氮储量增加的原因.这可能是由于生物炭具有多孔和低密度的特性，施用后使得土壤容重降低[27]，且能改善土壤通气状况，降低厌氧程度[28]，加上生物炭的高C/N比，抑制了氮素微生物的反硝化作用从而减少NOx的形成和排放[7].
生物炭添加和灌水量减少N2O排放和反硝化损失的机理可能与其影响土壤氮素在土壤中的再分布有关，如高量生物炭的添加，可明显降低土壤无机氮含量.这一是由于生物炭的输入提高了土壤的阳离子交换量, 加上其具有较大的比表面积，因而可吸附更多土壤中容易导致N2O排放的NH4+-N[29]和NO3--N[30]；另一方面是生物炭刺激了土壤硝化作用[31]，从而降低了土壤中NH4+-N含量，从而减少N2O的排放.另外，高灌溉条件下，很多氮会淋洗掉，因而降低了土壤剖面中的氮浓度，从而降低反硝化速率.
由图 2中可知，N2O排放量、DN与土壤无机氮含量之间均呈显著正相关关系.可以得到，生物炭的添加和灌溉量的增大减少了番茄地土壤中无机氮的含量，这与文献[32, 33]等指出的生物炭施用后土壤无机氮浓度降低的研究结果一致，故而减少了土壤氮素的反硝化损失和N2O排放量，从这点来讲番茄菜地中添加生物炭对节能减排有一定的意义.此外，有研究表明，生物炭施用后NH4+-N和NO3--N的淋洗量显著下降[34, 35]，这可能针对高灌溉量下引起的土壤氮素淋溶问题有一定的作用.
由表 1和表 2可得，生物炭添加量、灌溉量以及两者的交互作用对土壤无机氮含量和反硝化损失的影响均达到了显著水平(P < 0.05)，对硝态氮的影响表现为灌溉量＞生物炭添加量＞两者交互作用，对铵态氮的影响表现为生物炭添加量＞灌溉量＞两者交互作用，这可能是由于加入土壤中的生物炭以吸附NH4+-N为主[29]，而灌溉引起的土壤氮素淋溶又以NO3--N为主要形式[36]，因此灌溉量大于生物炭添加量对硝态氮的影响，而生物炭添加量大于灌溉量对铵态氮的影响；对反硝化损失的影响表现为灌溉量＞生物炭添加量＞两者交互作用.
本研究中不同量生物炭添加明显影响了N2O/DN，随着生物炭添加量的增加N2O/DN比值反而逐渐减小，这与之前学者研究的结果一致.如Bauhus等[37]指出有机物可以降低土壤中O2的浓度，刺激土壤微生物活性，同时提供更多的电子供体，最终可以降低反硝化产物中N2O/DN比值[38].
4 结论(1) 本研究表明，生物炭和灌溉量显著改变了土壤的理化性质，从生物炭的添加效果来看，与B0相比，生物炭的添加能够提高土壤全碳、全氮、pH值含量，降低铵态氮、硝态氮含量，相反的，土壤各处理在相同生物炭添加量条件下土壤中全氮和全碳的含量随灌水量的增加而减少，与B0/W50%相比，B25/W75%和B50/W100%处理显著减少了反硝化损失量(P < 0.05).
(2) 生物炭添加量和灌溉量的交互作用对土壤无机氮含量和反硝化损失的影响均达到显著水平(P < 0.05)，且对硝态氮的影响表现为灌溉量＞生物炭添加量＞两者交互作用，对铵态氮的影响表现为生物炭添加量＞灌溉量＞两者交互作用，对反硝化损失的影响表现为灌溉量＞生物炭添加量＞两者交互作用.
(3) 反硝化损失量与土壤中硝态氮含量、N2O排放量与土壤铵态氮含量间均呈正相关关系；DN、N2O排放量与土壤有机碳(CO2-C)矿化量也成正相关关系.
(4) 不同生物炭添加量和灌溉量处理后明显影响了N2O/DN(P < 0.05)，培养结束时，各处理下的N2O累积排放量/DN累积排放量差异较大，介于0.31 %~1.88 %.
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