铵根是自然界中广泛存在的无机盐离子，对动植物的生存具有重要的影响.一方面铵根在土壤中对植被生长具有促进作用，而另一方面铵根在水体中会导致富营养化，从而危害水生态系统.硝酸盐异化还原为铵(dissimilatory nitrate reduction to ammonium, DNRA)主要分为两个步骤： ①硝酸盐还原为亚硝酸盐；②亚硝酸盐再进一步被还原为铵. DNRA作为生成铵根的微生物过程，对自然界中铵根离子的存在及转化具有不可忽略的影响.因此对于微生物DNRA过程及其影响因素的研究具有重要的理论和实践意义^[1~3].

目前关于DNRA过程的研究主要可以分为两类：一类是实验条件下的纯培养研究；另一类是实验条件下和自然环境中混合菌群中DNRA过程的研究.关于纯培养条件下的DNRA现象早在1938年就已经观察到.国内学者刘佳等^[4]、陈丽敏等^[5]分离纯化单一菌株并对其进行了DNRA过程研究.而近些年菌株DNRA转化机制成为了研究的热点^{[6, 7]}.随着检测技术的发展，国外学者运用同位素标记法验证了1株Clostridium菌在接种土壤中的硝酸盐异化还原为铵的过程，此后DNRA过程对于环境中的NO₃^-还原的重要性逐渐被大家所关注.而在环境中NO₃^-异化还原分为反硝化和DNRA两类，所以两者在自然条件下对于NO₃^-的竞争关系和影响因素也成为了混合菌群中DNRA过程研究的热点^[8~12].

随着对菌株DNRA过程的研究发现，很多硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria, SRB)也具有DNRA功能，即许多SRB菌株不仅具有还原SO₄^2-的能力，也具有还原NO₃^-为铵的能力^[13~17].目前关于SRB纯培养情况下的DNRA过程研究一方面是考察菌株转化NO₃^-、NO₂^-为NH₄⁺的能力，如反应速率、转化率、转化产物等.另一方面是对菌株DNRA过程影响因素的考察，如C源种类、C/N、SO₄^2-和S^2-等.氮源作为微生物生长所需的重要元素之一，对微生物的生长和代谢有很大的影响^{[18, 19]}，研究者一般选定某一种氮源进行实验，但是添加不同外加氮源对SRB的DNRA过程及产物产率的影响，以及外加氮源是否能够促进SRB的DNRA过程尚未探明；此外SRB菌株同时具有还原NO₃^-和SO₄^2-的能力，两者在体系中都是作为电子受体，当体系中两者共同存在时，SO₄^2-对于NO₃^-的DNRA过程影响也是值得探究的问题；当体系中SO₄^2-被SRB还原后，产物为硫化物^[20]，而S^2-存在于体系中对于菌株DNRA过程也会产生影响.目前已有的关于SO₄^2-和S^2-对SRB菌株DNRA过程影响的研究中，虽然都发现了SO₄^2-和S^2-对菌株DNRA整个过程的抑制作用^[13~17]，但是DNRA分为NO₃^-还原为NO₂^-，NO₂^-再进一步还原为NH₄⁺两个阶段，不同浓度SO₄^2-和S^2-对DNRA过程哪个阶段的影响更为关键需要进一步研究.所以，针对目前关于SRB菌株DNRA过程影响因素和机制考察的不足，本实验利用筛选出的具有DNRA功能的SRB菌株Desulfovibrio sp. CMX，首先考察了其在无外加氮源条件下还原NO₃^-和NO₂^-为铵的能力.在证明了菌株Desulfovibrio sp. CMX具有DNRA能力的基础上，进一步考察了不同外加氮源、不同浓度SO₄^2-和不同浓度S^2-对菌株DNRA过程的影响，并通过实验数据分析和对比，推断了上述各因素对DNRA过程不同的影响机制.

1 材料与方法 1.1 菌种

实验所采用菌株Desulfovibrio sp. CMX是本实验室由大连市春柳河污水处理厂的厌氧污泥筛选而得到^[20].在GenBank上登录，其序列号为GU584224，在广东省微生物菌种保藏中心的保藏号为GIM1.765.

1.2 培养基

基础培养基： KH₂PO₄，2.65g ·L^-1；Na₂HPO₄ ·12H₂O，10.92g ·L^-1；K₂HPO₄，0.50g ·L^-1；MgCl₂，0.10g ·L^-1；NaCl，0.50g ·L^-1；CaCl₂，0.10g ·L^-1；乳酸钠(质量分数为70%~80%)，5 mL ·L^-1；pH调至7.00±0.20.在0.1 MPa，121℃下灭菌20 min.在培养基使用前，用0.22 μm有机滤膜过滤灭菌加入0.10g ·L^-1的维生素C.

1.3 菌株Desulfovibrio sp. CMX的DNRA性能考察

在100 mL基础培养基中添加初始浓度为10 mmol ·L^-1的NaNO₃和NaNO₂，并将Desulfovibrio sp. CMX(细胞蛋白质浓度为20 mg ·L^-1)分别厌氧接种于各培养基中，在30℃的条件下厌氧培养，并定期取样测定其细胞蛋白质浓度、NH₄⁺、NO₃^-和NO₂^-浓度.同时设置培养基、培养条件完全相同的同批次实验，用于在实验结束时测定最终气相产物.

1.4 不同外加氮源对菌株Desulfovibrio sp. CMX的DNRA过程的影响研究

在100 mL分别添加有10 mmol ·L^-1的NaNO₃和NaNO₂的基础培养基中分别加入酵母浸粉和氯化铵，使其浓度为0.5g ·L^-1.并将Desulfovibrio sp. CMX(细胞蛋白质浓度为20 mg ·L^-1)分别厌氧接种于各培养基中，在30℃的条件下厌氧培养，并定期取样测定其细胞蛋白质浓度、NH₄⁺、NO₃^-和NO₂^-浓度.同时设置培养基、培养条件完全相同的同批次实验，用于在实验结束时测定最终气相产物.

1.5 不同初始浓度SO₄^2-对菌株Desulfovibrio sp. CMX DNRA过程的影响探究

在100 mL分别添加有10 mmol ·L^-1的NaNO₃和0.5g ·L^-1酵母浸粉的基础培养基中，分别加入初始浓度为0、4、8、12、16和20 mmol ·L^-1的SO₄^2-，在30℃的条件下厌氧培养，并定期取样测定其细胞蛋白质浓度、NH₄⁺、NO₃^-、NO₂^-和SO₄^2-浓度.

1.6 不同初始浓度S^2-对菌株Desulfovibrio sp. CMX DNRA过程的影响探究

在100 mL分别添加有10 mmol ·L^-1的NaNO₃和0.5g ·L^-1酵母浸粉的基础培养基中，分别加入初始浓度为0、2、4、6、8和10 mmol ·L^-1的S^2-，在30℃的条件下厌氧培养，并定期取样测定其细胞蛋白质浓度、NH₄⁺、NO₃^-和NO₂^-浓度.

1.7 分析方法

pH值采用pH计测定(Mettler toledo，FE20). NH₄⁺采用水杨酸-次氯酸钠法测定^[21]. NO₃^-、NO₂^-和SO₄^2-采用离子色谱法测定(DIonex，ICS-1100).气相产物的测定是采用气相色谱仪(上海天美，GC7900).菌株Desulfovibrio sp. CMX细胞蛋白质浓度采用考马斯蓝法测定^[20].

2 结果与分析 2.1 菌株Desulfovibrio sp. CMX DNRA性能考察

分别利用10 mmol ·L^-1 NO₃^-和NO₂^-作为唯一的电子受体，考察菌株DNRA能力.如图 1(a)所示，前40 h菌株在NO₃^-为底物时迅速生长，同时NO₃^-迅速转化.随着NO₃^-的转化，NO₂^-逐渐积累随后进一步被菌株还原为NH₄⁺.最后在90 h时，NO₂^-被完全转化，最终NH₄⁺浓度为8.6 mmol ·L^-1，生成率达到85.8%.而在1(b)中，以NO₂^-为底物时，菌株生长受到抑制作用，但是随着NO₂^-浓度的降低，菌株蛋白质浓度也在逐渐上升.虽然菌株生长受到了很强的抑制作用，但是菌株依然能转化NO₂^-，且降解速率随着NO₂^-浓度的降低而增大，126 h时NO₂^-降解完全，最终NH₄⁺的浓度为9.69 mmol ·L^-1，生成率达到97.3%.同时对同批次实验的气相产物分析，气相中并未检测到NO、N₂O、N₂等含氮气体的生成，由于本实验没有外加其它氮源，部分NO₃^-和NO₂^-可能发生同化作用而转化到菌株体内.

2.2 外加氮源对菌株Desulfovibrio sp. CMX DNRA过程的影响

本实验分别考察了外加酵母浸粉和氯化铵对菌株Desulfovibrio sp. CMX DNRA过程的影响.如图 2(a)、2(c)所示，转化NO₃^-时，加入酵母浸粉和氯化铵对菌株生长起到了一定的促进作用，反应期间菌株稳定蛋白质浓度由未加外加氮源的45 mg ·L^-1[图 1(a)]分别增加到了55 mg ·L^-1和53 mg ·L^-1，NO₃^-降解速率加快，NO₂^-降解完全的时间由未加氮源的90 h加快到了78 h；降解NO₂^-时[图 1(b)、2(b)和2(d)]，反应期间菌株稳定蛋白质浓度分别为25、48和34 mg ·L^-1(依次为未加外加氮源、外加酵母浸粉、外加氯化铵).而3种条件下NO₂^-降解完全所消耗的时间分别为126、90和138 h.同时测量气相产物，气相中并未检测到NO、N₂O、N₂等含氮气体的生成.本实验中NH₄⁺依然是DNRA过程唯一的还原产物.

2.3 不同初始浓度SO₄^2-对菌株Desulfovibrio sp. CMX DNRA过程的影响

如图 3(a)所示，在考察不同初始浓度SO₄^2-对菌株降解NO₃^-的DNRA过程影响发现，加入SO₄^2-后，NH₄⁺生成速率降低，随着SO₄^2-浓度的增大，其对DNRA过程的抑制作用增强，当SO₄^2-浓度达到12 mmol ·L^-1后，继续增大SO₄^2-浓度抑制作用增强不明显.而在图 3(b)中可以发现，有SO₄^2-存在的情况下，NO₃^-转化更快，且不同浓度的SO₄^2-时NO₃^-降解速率相差不大.但是当NO₃^-降解完全、NO₂^-积累达到最大值后，此后NO₂^-的降解随着SO₄^2-浓度的增大，NO₂^-的降解变慢，无SO₄^2-时NO₂^-降解最快. 图 3(c)中SO₄^2-的降解情况可知，SO₄^2-长时间内未被降解，随着SO₄^2-浓度的增大，SO₄^2-开始降解的时间提前. 图 3(d)中可以看出，加入SO₄^2-后能促进菌株生长.

2.4 不同初始浓度S^2-对菌株Desulfovibrio sp. CMX DNRA过程的影响

本部分实验考察了不同浓度S^2-对于菌株降解NO₃^-的DNRA过程的影响.如图 4(a)所示，未加入S^2-的对照组NH₄⁺生成速率最快，S^2-加入会使得NH₄⁺生成速率降低，且随着初始S^2-浓度的增大，NH₄⁺生成速率降低.由图 4(b)可知，NO₃^-降解也是随S^2-浓度增大速率降低.在S^2-浓度在0~4 mmol ·L^-1之间时，NO₂^-降解速率随着S^2-浓度的增大而降低，当S^2-浓度达到6 mmol ·L^-1后，NO₃^-降解速率很低，且体系中始终未检测到NO₂^-的积累. 图 4(c)中，随着初始S^2-浓度的增大，菌株生长速率变慢，且稳定时菌株蛋白质浓度降低.

3 讨论 3.1 菌株Desulfovibrio sp. CMX DNRA性能

关于DNRA过程，NO₃^-首先在硝酸盐还原酶的作用下转化为NO₂^-，NO₂^-再在亚硝酸盐还原酶的作用下进一步被还原为NH₄^+[17].而目前关于NO₂^-还原到NH₄⁺的机制还未明确，在已有报道的机制推测和对细胞色素c亚硝酸盐还原酶的研究，更多的结论是倾向于NO₂^-到NH₄⁺的一步反应，即NO₂^-在多因素的催化下，没有产生NO、羟胺等中间产物，直接转化为NH₄^+[22~25]，其多因素作用的一步反应式如公式(1)所示^[19]：

(1)

而当此过程受到很强的抑制或者毒性作用导致NO₂^-不能被顺利地转化为NH₄⁺时，NO₂^-将会被转化为N₂O，以此来消除NO₂^-对菌株的毒性作用^{[26, 27]}.有研究发现1 mmol ·L^-1 NO₃^-还原后积累的NO₂^-就促发了Propionibacteria的解毒机制，最终N₂O生成率达到了90%以上^[28].在本实验中，菌株转化10 mmol ·L^-1 NO₃^-和NO₂^-时，NH₄⁺最终转化率分别达到了85.8%和97.3%，且未检测到N₂O等气体的生成，表明菌株Desulfovibrio sp. CMX在无其他氮源时有很强的异化还原NO₃^-和NO₂^-为铵的能力.

3.2 外加酵母浸粉、氯化铵对菌株Desulfovibrio sp. CMX DNRA过程的影响

由上述实验结果可以得出，在降解NO₃^-时和NO₂^-时，虽然NO₃^-和NO₂^-都能作为氮源供微生物合成细胞内物质，但是酵母浸粉作为有机氮更有利于菌株吸收和利用，以此促进菌株的生长和代谢.特别在没有外加氮源时处理高浓度NO₂^-时，由于高浓度NO₂^-对微生物的毒性，所以前期菌株不能有效地利用NO₂^-来作为微生物生长和代谢所需的氮源，菌株的生长和代谢都受到了很明显的抑制作用[图 1(b)].此时可以被菌株有效利用的氮源，就成为了解决菌株生长和代谢的关键.分析其原因主要是由于酵母浸粉是通过酵母细胞中蛋白质等物质水解处理后得到的主要含有氨基酸、小分子蛋白质、多肽、糖类、维生素和核苷酸等的化合物，其富含细胞内有机质，所以较无机氮源相比更有利于菌株生长和代谢利用.在很多实验中酵母浸粉和有机氮的加入都较无机氮等有更好的菌株生长效果^{[29, 30]}.而从图 2(b)可以看出，加入酵母浸粉明显缓解了NO₂^-的抑制作用，而由图 2(d)可以看出，在NO₂^-抑制的情况下，氯化铵对菌株的促进作用较小.而且本课题组关于菌株Desulfovibrio sp. CMX降解SO₄^2-和Fe(Ⅱ)EDTA-NO的研究中，酵母浸粉都是最合适的氮源^{[20, 31]}.综上所述酵母浸粉是促进菌株Desulfovibrio sp. CMX DNRA过程的适宜氮源.本实验中添加酵母浸粉时，促进了菌株的生长因此促进了DNRA全过程的进行.

3.3 不同浓度硫酸根对菌株Desulfovibrio sp. CMX DNRA过程的影响

目前为止关于具有DNRA能力的SRB菌株，研究SO₄^2-对于DNRA过程影响的报道中，都只是简单得出SO₄^2-对于DNRA过程抑制的结论，并未有更进一步的报道^[13~17].而从本实验中可以发现，SO₄^2-的加入对于菌株DNRA过程并不是单纯的抑制作用, 而是存在促进和抑制的双重作用. 图 3(b)中可以看出，对于NO₃^-的降解，SO₄^2-的加入有一定的促进作用；而对于NO₂^-进一步还原为铵的过程，SO₄^2-起抑制作用.最终，综合两种作用，SO₄^2-对于DNRA整个过程有一定的抑制作用. SO₄^2-对于NO₃^-降解过程的促进作用，主要是由于SO₄^2-的加入促进了菌株的新陈代谢和电子传递过程，促进了菌株的生长，使得菌株与未加入SO₄^2-时对比有更高的稳定浓度^[32].另一方面，图 3(c)中前期SO₄^2-未降解，这是由于SO₄^2-对于电子的竞争力要弱于NO₃^-对于电子的竞争能力.因此菌株浓度增大促进NO₃^-的降解成了主要的影响因素，所以SO₄^2-对于DNRA过程中NO₃^-降解为NO₂^-过程是起促进作用的.而由图 3(b)中可以看出，SO₄^2-对于NO₂^-进一步还原为铵的过程有明显的抑制作用，且当SO₄^2-浓度达到16 mmol ·L^-1后，抑制作用明显加强. SO₄^2-浓度越高，其对于NO₂^-还原的抑制作用越强，可能是由于SO₄^2-对于电子的竞争作用导致该过程被抑制.从图 3(c)中可以发现，SO₄^2-浓度越高其开始降解的时间提前，这也是SO₄^2-竞争电子能力增大的一个证明，相对的NO₂^-竞争电子的能力减弱，其还原过程就受到了抑制.

目前关于SRB菌株在SO₄^2-、NO₃^-同时存在的研究报道中，其对于SO₄^2-和NO₃^-的还原顺序有不同的报道. Seitz等^[14]研究结果与本实验相符，即当SO₄^2-和NO₃^-共同存在时，菌株优先降解NO₃^-.菌株Desulfovibrio sp. CMX在同时降解Fe(Ⅱ)EDTA-NO和SO₄^2-时，同样先降解Fe(Ⅱ)EDTA-NO后降解SO₄^2-[33].在Dalsgaard等^[17]的实验中，当菌株Desulfovibrio desulfuricans在SO₄^2-存在的条件下生长后，需要2~4d的适应期后，菌株才能开始降解NO₃^-；而在NO₃^-和SO₄^2-同时存在时，只有SO₄^2-被还原.当SO₄^2-浓度低至4 μmol ·L^-1左右时，NO₃^-、SO₄^2-才能被同时降解. Dalsgaard等^[17]认为，SO₄^2-对于NO₃^-的抑制作用可能是由于SO₄^2-切断了NO₃^-的还原途径，类似于O₂对于Paracoccus denitrificans反硝化过程的抑制^[34]. McCready等^[13]实验采用的4株Desulfovibrio sp.菌株在SO₄^2-不存在或SO₄^2-浓度达到35 mmol ·L^-1后，NO₃^-还原都不能进行，即DNRA过程被抑制；而当只有低浓度SO₄^2-存在时(如1 mmol ·L^-1左右)，菌株才能发生DNRA过程，McCready等推测高浓度SO₄^2-对NO₃^-还原的抑制途径与Tam等^[35]的研究中SO₄^2-对于反硝化过程的抑制作用相似^[36].

3.4 不同浓度硫离子对菌株Desulfovibrio sp. CMX DNRA过程影响

S^2-对于SRB菌株生长有普遍的抑制作用.由图 4实验现象可以看出，S^2-对菌株生长和DNRA过程都具有抑制作用，随着S^2-浓度增大，抑制作用增强.陈效等^[37]的实验中S^2-浓度达到150 mg ·L^-1，不再检测到SRB菌株. Okabe等^[38]研究发现，在S^2-浓度达到250 mg ·L^-1后其菌株生长浓度降低50%.硫化物对菌株普遍的抑制作用可能是因为各形态硫化物(如H₂S、HS^-和S^2-)与细胞内细胞色素和铁氧化还原蛋白以及其他含铁化合物结合，从而导致电子传递系统失去效用^[37]. S^2-对Desulfovibrio sp. DNRA过程的抑制作用，首先是由McCready等^[13]提出. Dalsgaard等^[17]实验发现，127 μmol ·L^-1的S^2-就能抑制70% NO₃^-还原的速率，当S^2-浓度达到320 μmol ·L^-1时，菌株的生长稳定浓度降低了50%.通过图 4(b)中NO₃^-、NO₂^-转化曲线可以看出，对于DNRA过程的两个阶段，S^2-都是起抑制作用.但当S^2-浓度达到6 mmol ·L^-1可以发现，NO₃^-部分被降解，且有NH₄⁺的生成，但体系中不再有NO₂^-的积累，即此时NO₃^-还原为NO₂^-的速率低于NO₂^-进一步被还原为NH₄⁺的速率.而在没有S^2-的对照实验中可以发现，NO₂^-还原为NH₄⁺的速率是低于NO₃^-还原为NO₂^-的速率的.所以可以得出结论，S^2-对于菌株Desulfovibrio sp. CMX的生长和DNRA过程有很强的抑制作用，且当S^2-初始浓度达到6 mmol ·L^-1或更高时，其对DNRA过程中的NO₃^-还原过程的抑制作用强于其对NO₂^-还原过程的抑制作用，此时体系中NO₃^-降解缓慢，且体系中不再有NO₂^-的积累.

4 结论

(1) 在无其它氮源时，菌株Desulfovibrio sp. CMX能分别利用NO₃^-和NO₂^-作为唯一的电子受体，将其还原为铵，转化率分别达到85.8%和97.3%，且无气态含氮气体产生，表现出较强的DNRA能力.

(2) 外加氮源对于菌株Desulfovibrio sp. CMX降解DNRA过程影响较大，合适的N源能有效促进DNRA过程，且能缓解高浓度NO₂^-对菌株的毒性作用.酵母浸粉更易被菌株Desulfovibrio sp. CMX有效利用，对菌株的生长和DNRA过程都有明显的促进作用.

(3) SO₄^2-对于菌株Desulfovibrio sp. CMX的DNRA过程的两个阶段存在不同的作用机制，对NO₃^-还原为NO₂^-过程有促进作用，而对于NO₂^-还原为NH₄⁺的过程有抑制作用，综合两种作用机制，对于DNRA全过程是抑制作用.

(4) S^2-对菌株Desulfovibrio sp. CMX生长和DNRA过程有明显的抑制作用，当S^2-达到一定浓度后(6 mmol ·L^-1)，其对DNRA过程中的NO₃^-还原为NO₂^-过程的抑制作用强于其对NO₂^-还原为NH₄⁺过程的抑制作用，此时会出现NO₃^-还原速率低于NO₂^-还原速率.