2016, Vol. 37
2. 中国科学院过程工程研究所绿色过程与工程重点实验室, 北京 100190
2. Key Laboratory of Green Process and Engineering, Institute of Process Engineering, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100190, China
焦化废水是原煤高温干馏、煤气净化和化工副产品回收与精制过程中产生的工业废水，其中含有酚类、吡啶、吲哚、喹啉、氰化物、硫氰化物和氨氮等几十种污染物质，成分复杂，污染物浓度高，毒性大，性质非常稳定，是一种典型的难降解有机废水[1]，其处理主要经过脱酚、蒸氨、脱氰、除油、生化处理、混凝沉淀和后续高级氧化.生物处理，如A-O、A-A-O和A-O-O工艺因处理效率高，成本低被广泛用于处理焦化废水[2~4].焦化废水生物处理工艺的研究已经取得了很多成果[2, 5~7]，但对其中起重要作用的微生物群落结构的了解还十分有限，这在很大程度上制约了焦化废水处理效率的提高.
生物单元污泥相由复杂的微生物群落构成，以细菌为主导的群落结构在废水处理过程中起至关重要的作用[8~10].不同的细菌具有不同的特殊功能，如Burkholderia可以降解PAHs芘[11]，Gulosibacter可降解苯酚[12]，Nitrosomonas和Nitrobacter分别为氨氧化菌和亚硝酸氧化细菌[13]，Pseudomonas可利用间甲酚、4-氯酚、苯酚、PAHs芘和咔唑[11, 14, 15]作为唯一的碳源和能源，Acidovorax可降解喹啉[16], Sphaerobacter、Acinetobacter、Comamonas和Novosphingobium可降解苯酚，Comamonas不仅对苯酚具较高耐受力达到2000 mg ·L-1、且在48 h内可将初始浓度为1000 mg ·L-1的苯酚完全降解[17].尽管依靠传统的培养技术已从焦化废水中分离出多株功能菌[11~17]，然而微生物群落结构是一个复杂的系统不能用传统的生物技术来分析和研究.焦化废水处理系统功能的稳定性主要依靠优势微生物的活性和多样化的群落结构间的相互关系[18].高平平等[19]利用ERIC-PCR技术分析了焦化废水处理系统曝气池的微生物群落结构动态变化与污染负荷和主要污染物降解效果变化的关系，结果表明用ERIC-PCR检测出的该系统中的活性污泥部分微生物种群的结构比较稳定，可能构成了苯酚和氰化物去除效率在监测期间相对稳定的基础.曹军伟等[20]通过BOX-PCR和16S rDNA序列分析对焦化废水污泥中降解酚类的细菌进行了分析，获得分属于20个属的28个种的28株细菌，它们主要为变形菌纲β和γ亚群，其中4株菌可能是潜在的新种. Zhu等[13]利用454高通量测序研究了焦化废水厌氧/缺氧/沸石生物滤池-膜生物反应器中微生物的群落结构组成和动态变化，结果表明沸石材料可以改变微生物菌群结构，使氨氧化菌逐渐成为优势菌.实际焦化废水处理工艺好氧单元基本以活性污泥法为主，活性污泥中的细菌群落结构和多样性直接决定焦化废水的处理效率和后续深度处理的成本，而好氧单元活性污泥细菌群落结构和生物多样性在国内基本未见报道.对焦化废水活性污泥中的微生物进行分子生态学研究，有利于废水生物处理系统的管理控制和稳定运行.
本研究利用454高通量测序技术对采自5个不同实际焦化废水处理厂好氧单元的活性污泥进行分析其细菌群落结构组成和生物多样性，以期为焦化废水处理工艺的稳定运行提供理论基础.
1 材料与方法 1.1 主要试剂和材料生工Ezup柱式土壤基因组DNA抽提试剂盒.
活性污泥分别采自辽宁和湖北5个不同的焦化废水处理厂好氧单元，其中4号活性污泥样品采自二级好氧单元(样品分别编号1、2、3、4、5)，焦化厂主要的水质指标和好氧单元的工艺参数如表 1所示.
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表 1 焦化废水主要水质指标和好氧单元工艺参数 Table 1 Major indices of coking wastewater and operational parameters of aerobic basin |
1.2 污泥细菌总DNA提取、PCR和16S rDNA测序
污泥细菌总DNA提取、PCR和16S rDNA测序由上海生工公司完成.细菌总DNA提取按照生工Ezup柱式土壤基因组DNA抽提试剂盒进行. PCR扩增引物：341F CCTACGGGNGGCWGCAG和805R GACTACHVGGGTATCTAATCC[21]，扩增区域为V3-V4.反应条件94℃ 30 s；94℃ 20 s，45℃ 20 s，65℃ 60 s，5个循环；94℃ 20 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，20个循环；72℃ 5 min，10℃. 50 μL PCR反应体系及10×PCR buffer 5 μL，dNTP(10 mmol ·L-1) 0.5 μL，Genomic DNA10 ng，引物F(50 μmol ·L-1) 1 μL，引物R (50 μmol ·L-1)1 μL，Plantium Taq(5 U ·μL-1) 0.5 μL，水42 μL.各样品PCR扩增后，利用Roche 454 GSFLX+测序仪上机测序.
1.3 序列数据处理原始序列数据通过公司利用Prinseq软件进行质控，舍弃低质量序列之后序列长度分布在400~600之间，平均长度均在440以上，各样本序列数均在500以上.物种分类采用RDP classifier软件.按照相似度为97%的标准将操作分类单位(operational taxonomic units OTUs)进行分类[18]，运行软件mothur(http://www.mothur.org/)中的summary.single命令，计算常用的生物多样性指数，如丰富度指数(Chao/ACE指数)、覆盖率指数(Good's coverage)和多样性指数(Shannon指数).
2 结果与讨论 2.1 细菌群落多样性分析经PCR和高通量测序后，5个污泥样品获得的有效测序条带在16449~22937(表 2).为了解析活性污泥中的细菌群落结构丰富度，在97%相似水平上对污泥有效序列做了多样性分析.污泥细菌多样性指数如表 2所示，5个样品的覆盖率除2号样品外均在90%以上，表明绝大部分的细菌种群都被检测出来. 5个样品的生物分类单元OTUs分别为2613、4666、2275、2097和1728，香农指数分别为5.47、6.62、5.29、4.99和5.21，ACE指数为6160.33~24502.52，Chao1指数为4006.31~14745.15，表明2号样品的细菌群落多样性最丰富，不同焦化废水处理厂活性污泥细菌群落多样性存在很大差异.图 1细菌群落丰富度稀疏曲线同样表明，2号污泥样品的细菌群落结构多样性最丰富；随着测序数量的增加，新的细菌菌系不断出现，OTUs和香农指数均快速上升；当测序条带数量>16000，OTUs稀疏曲线未趋于平稳，说明测序的深度不能涵盖整个细菌菌群的多样性，而香农指数稀疏曲线趋于饱和，没有明显增加，说明本研究的有效序列深度可用于描述整个细菌的群落结构.细菌多样性指数和丰富度稀疏曲线表明，不同焦化废水活性污泥细菌群落结构差异明显，相似的结果也可通过聚类分析和主成分分析(图 2)得以表明.聚类热图采用样本间unifrac距离矩阵绘制，颜色块代表距离值，颜色越红表示样本间距离越近，相似度越高，越蓝则距离越远，2号样品的细菌群落多样性与其他样品的差异最明显；主成分分析表明5个样品的细菌群落结构分布在4个不同的象限内，说明群落结构差异大，尽管样品1和3分布在同一个象限内，但两者之间的距离较远.
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图例编号同表 1中样品编号 图 1 细菌群落丰富度稀疏曲线 Fig. 1 Rarefaction curves of bacterial community abundance |
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图 2 细菌群落结构聚类分析和主成分分析 Fig. 2 Cluster analysis and principal component analysis of bacterial community structure |
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表 2 细菌群落多样性指数 Table 2 Bacterial community diversity indices |
2.2 细菌群落结构门水平上的组成和丰度
为了解析细菌群落结构组成和丰度，对质控后的序列采用RDP classifier软件进行物种分类，图 3、表 3和表 4分别为细菌群落结构在门、目和属水平上的组成和丰度.优势门(图 3)主要有Proteobacteria、Planctomycetes、Acidobacteria、Candidatus Saccharibacteria、Bacteroidetes、Cyanobacteria/Chloroplast、Actinobacteria、Chloroflexi、Firmicutes、Thaumarchaeota、Ignavibacteriae、Verrucomicrobia、未分类的和微小菌群，这与Ma等[18]的研究结果基本一致. Proteobacteria在焦化废水中占主导地位[13]，其在5个活性污泥样品中的丰度也最高，分别为76.98%、51.92%、67.29%、36.00%和69.7%. Planctomycetes、Bacteroidetes和Acidobacteria是活性污泥细菌群落结构中的优势门，在5个样品中的丰度分别为1.81%~21.73%、1.75%~13.35%、0.84%~8.26%，而McLellan等[22]发现Bacteroidetes和Actinobacteria为污水处理厂进水中的优势细菌. Actinobacteria在5个污泥样品中的丰度分别为0.17%、2.77%、0.12%、32.58%和0.40%；微小菌群的丰度分别为0.89%、1.55%、1.38%、2.27%和1.35%；Firmicutes丰度分别为0.62%、19.99%、2.37%、0.50%和2.64%，而在厌氧污泥中的丰度高达92.3%[23].各种分子指纹图谱的方法已被开发用于评估微生物群落结构，而高通量测序可以检测更多未知和低丰度的序列[24].虽然大部分细菌门类在5个污泥样品中被鉴定，然而无法分类或者未知的门类在5个污泥样品中的丰度分别为6.52%、2.27%、0.94%、2.91%和1.08%.
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图 3 细菌群落结构门水平上的组成 Fig. 3 Bacterial community composition at phylum level |
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表 3 细菌群落结构目水平上的组成 Table 3 Bacterial community composition at order level/% |
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表 4 细菌群落结构属水平上的组成/% Table 4 Bacterial community composition at genus level/% |
2.3 细菌群落结构目水平上的组成和丰度
从目水平上分类表 3(每种目的丰度至少在一个样品中不小于1%)表明：5个污泥样品的前7类优势目不同，1号样品为Rhizobiales、Rhodocyclales、Planctomycetales、Burkholderiales、Rhodospirillales、Xanthomonadales和Parvularculales，丰度分别为28.33%、17.13%、10.09%、7.22%、5.27%、3.92%和3.60%；2号样品为Hydrogenophilales、Clostridiales、Rhizobiales、Burkholderiales、Bacillales、Sphingobacteriales和Rhodocyclales，丰度分别为15.06%、8.90%、6.53%、5.74%、4.65%、4.35%和4.12%；3号样品为Phycisphaerales、Rhizobiales、Rhodocyclales、Hydrogenophilales、Burkholderiales、Xanthomonadales和Sphingomonadales，丰度分别为20.34%、16.79%、15.08%、9.77%、7.31%、3.44%和2.79%；4号样品为Sphingobacteriales、Xanthomonadales、Nitrosomonadales、Actinomyce-tales、Burkholderiales、Rhodocyclales和Rhodospirillales，丰度分别为10.48%、6.17%、6.41%、5.59%、4.72%、3.51%和2.29%；5号样品为Hydrogenophilales、Burkholderiales、Rhodocyclales、Xanthomonadales、Phycisphaerales、Rhizobiales和Sphingomonadales，丰度分别为17.86%、14.4%、8.42%、7.45%、5.93%、5.14%和4.18%.优势目Rhodocyclales、Rhizobiales、Xanthomonadales和Burkholderiales为5个污泥所共享.除了优势目外，Legionellales、Bacillales、Clostridiales、Actinomycetales、Flavobacteriales、Verrucomicrobiales、Nitrosomonad-ales、Rhodobacterales、Anaerolineales、Caulobacterales和Gammaproteobacteria是5个污泥样品所共享的目.尽管大部分目被5个污泥所共享，但其丰度在每个群落结构中差异明显，如优势目Rhizobiales在1号样品中的丰度为28.33%，而在4号样品中的丰度仅为2.25%，Rhodocyclales在1号样品中的丰度为17.13%，在2号样品中的丰度为4.12%，Actinomycetales在4号样品中的丰度为5.59%，而在1号样品中的丰度为0.08%.这种不同可能归因于不同的生物处理工艺和水质特点，许多因素，包括进水组成、处理工艺和地理位置等均影响废水处理系统中的微生物群落结构，废水水质是一个关键的决定因素[18, 24].
2.4 细菌群落结构属水平上的组成和丰度细菌群落结构在属水平上的组成和丰度(每种属的丰度至少在一个样品中不小于1%)表明(表 4)：5个污泥共享的主要属(同种属至少在3个样品中不小于1%，Nitrosomonas除外)为Thiobacillus、Thauera、Comamonas、Caldimonas、Steroidobacter、Nitrosomonas、Phycisphaera和Gp4，这不同于市政污水活性污泥中主要的属Planctomyces、Mycobacterium、Rhodopirellula和Leptospira[25]，而与Ma等[26]的研究所得结果相似[18]. Ma等利用高通量研究了实际焦化废水处理厂A-A-O、A-O-O、A-O、A-A-O-O和A-O-A-O脱氮工艺好氧污泥中的生物群落结构，发现Thiobacillus、Comamonas、Thauera、Azoarcus和Rhodoplanes是焦化废水中的优势属，主要的属Azoarcus、Thauera、Pseudomonas、 Ohtaekwangia、Nitrosomonas和Nitrospira与芳香烃的降解和硝化过程有关. Thiobacillus广泛存在于焦化废水中，不仅能对SCN-进行降解，还具有很强的反硝化能力，Comamonas可降解酚类，多环芳烃和杂环类物质如吲哚、喹啉等[18]，Thauera具有反硝化和降解喹啉的能力[27]，Steroidobacter具有反硝化能力[28], Nitrosomonas为氨氧化细菌[29].尽管Denitratisoma、Sphingobium、Thiohalophilus、Aquisphaera、Diaphorobacter、Dongia、Planctomyces、Bacillus、Blastopirellula、Sphingomonas、Paracoccus、Ferruginibacter、Thermomonas、Alicycliphilus、Phenylobacterium和Hyphomicrobium为非优势菌株，但被5个污泥样品所共享.焦化废水处理系统功能的稳定性主要依靠优势微生物的活性和多样化的群落结构间的相互关系[18]，活性污泥是一个复杂的微生物群体，焦化废水中污染物的有效去除是多种菌群共同作用的结果.
3 结论(1)不同焦化废水好氧单元活性污泥细菌菌群结构多样性存在差异.
(2)焦化废水好氧单元活性污泥细菌菌群结构组成中的优势门为Proteobacteria，核心属为Thiobacillus、Thauera、Comamonas、Caldimonas、Steroidobacter、Nitrosomonas、Phycisphaera和Gp4.
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