2016, Vol. 37
2. 海洋环境与生态教育部重点实验室, 青岛 266100;
3. 青岛海洋科学与技术国家实验室, 海洋生态与环境科学功能实验室, 青岛 266071;
4. 中国海洋大学环境科学与工程学院, 青岛 266100
2. Key Laboratory of Marine Environment and Ecology, Ministry of Education, Qingdao 266100, China;
3. Laboratory for Marine Ecology and Environmental Science, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266071, China;
4. College of Environmental Science and Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China
长期以来，人们一直认为反硝化作用是化合氮转化为氮气的唯一途径，该过程可将硝态氮(NO3-)通过一系列中间产物还原为氮气. 1992年，Gist Brocades公司的Arnold Mulder在计算反硝化过程中的氮平衡时，发现其中存在80%~90%的氮损失不能用传统认为的反硝化过程来解释，他推断这可能是一种新的厌氧脱氮反应，并将这一转化过程命名为“anaerobic ammonium oxidation, ANAMMOX”[1]. 1995年，荷兰科学家Van de Graaf等[2]在污水处理厂采用同位素标记法证明了厌氧氨氧化过程是生物过程.该过程以亚硝态氮(NO2--N)为电子受体直接将铵态氮(NH4+-N)氧化为氮气(N2).作为一种新型的生物脱氮途径，自发现之日起，厌氧氨氧化过程(ANAMMOX)就受到了特别关注，有学者已在海洋、河口、湖泊、河流沉积物以及污水处理厂污泥等[3~7]环境中对ANAMMOX进行了大量研究.
2002年，Thamdrup等[5]将近海沉积物中的ANAMMOX与反硝化过程进行比较并首次进行了量化. 2003年，Kuypers等[8]在世界上最大的缺氧海盆——黑海低氧区中首次发现了厌氧氨氧化细菌(anaerobic ammonia-oxidizing bacteria, ANAMMOX Bacteria)，并将其与海洋无机氮的移除联系起来. 2005年，他们又在纳米比亚海岸的本格拉上升流中发现，ANAMMOX在固定氮的释放过程中起主导作用[9].而Ward等[10]则认为在其他海域，反硝化起了主导作用.针对到底是ANAMMOX还是反硝化过程在海洋氮损失中占主导地位的争议，Babbin等[11]详细研究了海洋中两大氮素移除途径ANAMMOX与反硝化过程的平衡关系，发现在全球范围内，ANAMMOX贡献了28%的海洋氮素移除.由此可见，ANAMMOX在海洋氮循环中发挥了极为重要的作用.
有研究表明，几乎在所有的含氮低氧环境中(包括海洋低氧区水域、近海与河口沉积物)都能发现ANAMMOX[12~14].作为ANAMMOX的主要驱动者，厌氧氨氧化细菌一直是人们关注的焦点.厌氧氨氧化细菌属于浮霉菌门(Planctomycetes)，目前发现有5个属存在厌氧氨氧化细菌，分别是Candidatus Brocadia、Candidatus Kuenenia、Candidatus Scalindua、Candidatus ANAMMOXoglobus和Candidatus Jettenia，其中Candidatus Scalindua是海洋环境中最常见的厌氧氨氧化细菌[15].由于至今未能成功分离得到纯菌株，因此对厌氧氨氧化细菌的研究主要以分子生物学技术为手段.近年来，随着分子生物学技术的不断发展，对厌氧氨氧化细菌的研究已取得大量成果.有研究者通过构建克隆文库、定量基因拷贝量分析厌氧氨氧化细菌的群落组成、分布及其丰度.
厌氧氨氧化细菌广泛分布于海洋低氧水体与沉积物、缺氧海湾盆地[12]、北极海冰[16]、深海热液喷口[17]等多种海洋低氧环境中. 2003年，Kuypers等[8]在黑海缺氧海盆的研究发现，ANAMMOX细菌的分布不仅仅局限在海盆中心的缺氧区域，其周边水动力条件较强的低氧区域中也有发现. 2004年，Rysgaard等[16]发现厌氧氨氧化细菌可以在北极海冰中生存. 2007年，Amano等[18]在日本沿海海岸沉积物中检测到厌氧氨氧化细菌的存在.同年，Hamersley等[19]在秘鲁低氧区水体中检测到厌氧氨氧化细菌的存在. 2009年，Penton等[13]甚至在大西洋中脊深海热液喷口周围环境中发现了厌氧氨氧化细菌.其活性、群落组成、丰度也因为受各种环境理化因子的影响，在不同海域存在一定的差异性[12].盐度是影响厌氧氨氧化细菌物种组成差异分布的最主要因素，厌氧氨氧化细菌不同属对盐度的耐受不同，Candidatus Brocadia、Candidatus Kuenenia、Candidatus Scalindua分别适应淡水、寡盐、海水环境的特征，因而不同盐度环境的优势种群也不同[20, 21].而厌氧氨氧化细菌的丰度、活性在有明显温度差异的夏、冬两季也表现出明显不同，在长江口潮滩沉积物中，夏季厌氧氨氧化细菌的丰度高于冬季的[21].
研究者通过对不同海域厌氧氨氧化细菌进行培养，发现ANAMMOX对不同海域N2形成的贡献率在0~79%之间[22].国内研究则发现长江口附近潮滩[21]、东海近海海域[23, 24]沉积物中的厌氧氨氧化细菌群落组成在不同区域具有一定的差异性，受环境理化因子变动、人类活动等影响较大.本研究以长江口邻近海域表层沉积物样品建立利用16S rDNA定量厌氧氨氧化细菌的方法，分析厌氧氨氧化细菌丰度与环境理化因子之间的关系，推测影响其丰度变化的环境理化因子.同时本研究针对长江口邻近海域沉积物的分析，验证了厌氧氨氧化细菌在研究海域的存在，也丰富了中国东黄海近海海域对厌氧氨氧化细菌丰度与环境因子之间耦合关系的数据，旨在为后期研究厌氧氨氧化细菌丰度的季节性差异以及对环境理化因子变化的反应程度提供依据.
1 材料与方法 1.1 样品采集2011年7月29日~8月4日在长江口邻近海域(122°E~123.5°E，28°N~32°N)20个站位，其水深范围是10~72 m，采集表层0~1 cm沉积物的样品(图 1).沉积物样品放置在无菌封口袋中，立即置于-20℃冰箱中保存.
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图 1 长江口临近海域采样站位示意 Fig. 1 Sampling sites in adjacent waters of Yangtze Estuary |
利用CTD多参数温盐深仪对各个站位底层水的温度、盐度、溶解氧浓度等理化参数进行现场测定，底层水的营养盐NO3--N、NO2--N和NH4+-N的浓度于实验室内采用德国Bran-Lubbe公司的Quaatro营养盐自动分析仪测定，沉积物中的总有机碳使用Carlo Erba NA-1500元素分析仪测定.
1.3 DNA提取与引物特异性验证沉积物自然解冻完全混合均匀后，用Power Soil DNA Isolation Kit(MoBio，美国)提取沉积物DNA，溶于100 μL缓冲液并于-20℃保存.用下列引物(表 1)分别扩增细菌16S rDNA(bac-16S rDNA)、厌氧氨氧化细菌16S rDNA(amx-16S rDNA)基因片段，并进行回收纯化.
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表 1 荧光定量PCR引物与反应程序1) Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR primers and amplification procedures |
1.4 质粒标准品的制备
将纯化的DNA与pMD 18-T载体连接后，转化到Escherichia coli Trans 5α感受态细胞中，通过蓝白筛选得到含有目的基因的阳性克隆，质粒提取纯化试剂盒(康为，北京)制备质粒，用引物M13F(-47F)/M13R(-48R)进行PCR反应，检验阳性克隆后测序(华大基因研究中心，北京).
用Picodrop超微量紫外分光光度计(Picodrop, UK)测得重组质粒的浓度，计算bac-16S rDNA、amx-16S rDNA重组质粒的拷贝浓度.将得到的质粒10倍梯度稀释，用于建立定量PCR体系的质粒标准曲线.
1.5 标准曲线的制备与样品测定将所得质粒标准品进行梯度稀释，以此为模板使用FastStart Universal SYBR Green Master (ROX)试剂盒(Roche, Germany)进行荧光定量PCR(qPCR)反应(ABI7500, USA)，并在反应体系中加入0.2 μg ·μL-1牛血清蛋白.用引物341F/518R和Amx368F/Amx820R分别定量bac-16S rDNA和amx-16S rDNA的拷贝数，反应体系为：沉积物DNA 1 μL，引物各0.5 μL，ROX 12.5 μL，BSA 0.5 μL，反应程序如表 1.每个质粒标准品浓度做3个平行样，同时添加阴性对照. qPCR扩增完毕之后进行熔解曲线分析，以确定实验中的每个样品都是特异性扩增.最后以质粒拷贝数常用对数值为横坐标，以qPCR反应中相应的平均Ct值为纵坐标，绘制标准曲线.取2 μL样品DNA按上述条件进行qPCR反应，每个样品3个平行样，实验体系中同时包括阳性、阴性对照.通过标准曲线换算样品中bac-16S rDNA和amx-16S rDNA这2个基因的拷贝数.
1.6 环境因子与厌氧氨氧化细菌的关系分析使用Canoco for Windows 4.5软件对厌氧氨氧化细菌种群丰度和环境数据进行冗余分析(RDA)作图，将各个理化因子标准化处理再分析与厌氧氨氧化细菌丰度之间的关系；采用皮尔森(Pearson)相关系数法对总细菌数量与厌氧氨氧化细菌数量、环境因子与厌氧氨氧化细菌数量之间的相关性进行相关性分析，并进行显著性检验，对总细菌数量及厌氧氨氧化细菌数量的分布采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)、双变量相关性检验进行分析.
2 结果与分析 2.1 环境因子分析本航次各站位底层水的理化参数如表 2所示.在所考察海域，温度在18.05~27.24℃之间，盐度在15.65‰~34.49‰之间，溶解氧的范围为1.11~4.04mg ·L-1，铵盐的浓度范围为0.92~6.20 μmol ·L-1，亚硝酸盐的浓度范围为0.03~1.48 μmol ·L-1，硝酸盐的浓度范围为3.31~187.01 μmol ·L-1，有机碳在0.21%~0.85%之间.长江口邻近海域盐度较低，铵盐、亚硝酸盐、硝酸盐的浓度较高，该海域受长江入海淡水影响显著.
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表 2 长江口邻近海域各站位底层水与沉积物的理化参数1) Table 2 Physiochemical parameters of bottom water and sediments in adjacent waters of Yangtze Estuary |
2.2 测序结果分析
将含有插入目的基因amx-16S rDNA片段的质粒进行PCR扩增，经电泳检验确认后送测序公司(华大基因，北京)测序，并将测序所得序列在GenBank进行比对，所得序列与数据库中的厌氧氨氧化细菌16S rDNA基因序列相似度均达到99%以上，登录号为KU217904、KU217970、KU218091、KU218164、KUKU218198、KU218363、KM925257、JX243468，证实所得质粒标准品中含有的片段为amx-16S DNA序列，其片段长度为477 bp.
2.3 标准曲线的绘制及沉积物中厌氧氨氧化细菌的定量经过qPCR实验分析可知，熔解曲线[图 2(a)]仅在解链温度处有一个显著的峰值，没有引物二聚体、其他非特异性扩增.对含有目的基因片段(bac-16S rDNA和amx-16S rDNA)的质粒进行qPCR反应，获得定量标准曲线[图 2(b)和表 3].
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图 2 含有bac-16S rDNA、amx-16S rDNA基因的质粒标准品熔解曲线和质粒标准曲线图 Fig. 2 Melting curves and standard curves for plasmid reference containing bac-16S rDNA and amx-16S rDNA genes |
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表 3 bac-16S rDNA和amx-16S rDNA基因的标准曲线方程1) Table 3 Standard curve equations of bac-16S rDNA and amx-16S rDNA genes |
通过qPCR定量采样站位表层沉积物中的bac-16S rDNA、amx-16S rDNA拷贝数. bac-16S rDNA拷贝数为9.25×109~1.96×1011copies ·g-1(鲜重)，amx-16S rDNA拷贝数为6.73×105~3.81×107 copies ·g-1(鲜重).厌氧氨氧化细菌16S rDNA拷贝数远远小于细菌16S rDNA拷贝数，仅占0.26×10-4~5.2×10-4，由该比例可知，与总微生物量相比，厌氧氨氧化细菌生物量很小[图 3(a)].
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(a)厌氧氨氧化细菌(amx-16S rDNA)占总细菌(16S rDNA)的相对丰度；(b)厌氧氨氧化细菌16S rDNA 图 3 厌氧氨氧化细菌(amx-16S rDNA)占总细菌(16S rDNA)的相对丰度、厌氧氨氧化细菌16S rDNA拷贝数在长江口邻近海域沉积物中分布 Fig. 3 Horizontal distribution of sedimentary ratio of ANAMMOX bacteria to total bacteria and ANAMMOX bacteria 16S rDNA copies in adjacent waters of Yangtze Estuary |
将定量bac-16S rDNA与amx-16S rDNA所得结果对数处理后用单样本K-S检验验证了总细菌和厌氧氨氧化细菌丰度数值的正态性，结果表明总细菌(P=0.588>0.05)和厌氧氨氧化细菌(P=0.958>0.05)在本研究海域丰度的分布具有空间异质性.用双变量相关性检验验证了总细菌与厌氧氨氧化细菌丰度分布的相关性，结果表明amx-16S rDNA与bac-16S rDNA拷贝数对数值具有相关关系(P < 0.05，r=0.51)，厌氧氨氧化细菌在研究区域的分布趋势与总微生物的分布趋势相同.用One-Way ANOVA检验总细菌与厌氧氨氧化细菌的数量分布，结果表明总细菌和厌氧氨氧化细菌在本研究海域的丰度分布趋势是一致的(P=0.104>0.05).在所考察区域，厌氧氨氧化细菌的分布趋势表现为长江口外及近岸区域较低而南部海域较高[图 3(b)]，与研究海域站位的深度显著相关(P < 0.05，r=0.49).厌氧氨氧化细菌与细菌总生物量在考察海域的特殊区域的丰度分布不完全一致(如4号站，位于杭州湾)，细菌总生物量较小，而厌氧氨氧化细菌的生物量较大.
2.5 不同环境因子对厌氧氨氧化细菌数量的影响采用Canoco for Windows 4.5软件对厌氧氨氧化细菌种群丰度和环境数据进行分析(图 4).种群丰度与环境因子前两个排序轴的相关系数分别为0.388和0.028.第一排序轴与总有机碳含量(TOC)、盐度、溶解氧、铵盐浓度呈正相关，与硝酸盐、亚硝酸盐浓度呈负相关；第二排序轴与铵盐/亚硝酸盐浓度比呈正相关，与温度、盐度、溶解氧呈负相关.因此，总有机碳含量、盐度、溶解氧及铵盐/亚硝酸盐浓度比例等环境理化因子在决定厌氧氨氧化细菌丰度分布上具有重要作用.其中，铵盐浓度、总有机碳含量对厌氧氨氧化细菌的丰度影响较大.
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图 4 各理化因子与厌氧氨氧化细菌种群丰度的RDA分析 Fig. 4 RDA ordination plot for the relationship between environmental parameters and ANAMMOX bacteria abundance |
厌氧氨氧化细菌丰度在本研究区域的分布具有空间异质性，其丰度随盐度值、总有机碳上升而升高，随溶解氧含量、亚硝酸盐浓度上升呈现下降趋势，其中33、34号站溶解氧浓度较高，厌氧氨氧化细菌的丰度也较高.
3 讨论在低氧环境中，由厌氧氨氧化细菌驱动的厌氧氨氧化过程对维持氮素收支平衡具有重要意义.本研究通过amx-16S rDNA对长江口邻近海域表层沉积物中厌氧氨氧化细菌进行研究，结果表明在采样海域的表层沉积物中存在厌氧氨氧化细菌. 16S rDNA是研究微生物分类的常用基因，由于厌氧氨氧化细菌的丰度太低，很难通过16S rDNA通用引物研究厌氧氨氧化细菌，因此针对厌氧氨氧化细菌16S rDNA的研究就显得尤为必要. Schmid等[27]整合研究了一系列厌氧氨氧化细菌16S rDNA的特异性引物，发现通过引物Amx368F/Amx820R进行PCR实验所得序列均为厌氧氨氧化细菌16S rDNA. 2013年，在长江口附近潮滩沉积物的研究中，通过amx-16S rDNA对厌氧氨氧化细菌进行了多样性、丰度等方面的实验与分析，结果表明厌氧氨氧化细菌在长江口附近的潮滩生态系统中广泛存在，且具有较高多样性[21].
通过amx-16S rDNA定量本研究海域的厌氧氨氧化细菌数量结果与珠江口(4.22×105~2.55×106 copies ·g-1)[28]、凯普菲尔河口(1.3×105~8.4×106 copies ·g-1)[20]、长江口潮滩(2.63×106~1.56×107 copies ·g-1)[21]的实验结果相似.厌氧氨氧化细菌在细菌微生物总量中所占的比例很低[图 3(a)]，本研究所得厌氧氨氧化细菌与总微生物生物量之比高于Fu等[28]在珠江口(0.02×10-4)、Dang等[29]在胶州湾(0.047×10-4~0.21×10-4)的研究.推测原因可能与厌氧氨氧化细菌生活、繁殖所需的厌氧环境及其自身生长周期有关.厌氧氨氧化细菌的生长繁殖对环境要求较为苛刻，其对氧气极度敏感，当O2的质量分数达到0.5%(约5.13mg ·L-1)时，对其生长有抑制作用，且厌氧氨氧化细菌的生长周期较长，约14 d[30].本研究区域溶解氧浓度在1.11~4.04mg ·L-1，溶解氧浓度较低，理论上说不会对厌氧氨氧化细菌的生长产生抑制作用.厌氧氨氧化细菌在河口生态系统中广泛存在，其分布与丰度受人为活动和环境理化因子影响较为显著，包括盐度、温度、溶解氧、亚硝态氮以及硝态氮等[31~34].本研究海域地处长江口区域，生态系统循环代谢机制复杂，厌氧氨氧化细菌的生长繁殖及其丰度与各种环境理化因子密切相关.环境因子通过影响厌氧氨氧化细菌的种群结构、多样性组成、地理分布等特征，使其丰度在不同区域存在差异.
有研究认为盐度是影响河口生态系统中厌氧氨氧化细菌群落结构的重要因子.不同属的厌氧氨氧化细菌对盐度的耐受性不同，盐度使厌氧氨氧化细菌形成区域差异分布，进而影响该区域厌氧氨氧化细菌的丰度.在本研究海域，厌氧氨氧化细菌的丰度与盐度并非显著相关，厌氧氨氧化细菌丰度的分布与之前在凯普菲尔河口[20]及长江口附近潮滩[21]沉积物中的研究结果相似，与Hu等[23]对东海椒江口的实验结果不同.在凯普菲尔河口[20]、长江口附近潮滩[21]沉积物中观察到厌氧氨氧化细菌的优势类群随盐度的升高从Candidatus Brocadia过渡为Candidatus Scalindua，这种分布模式说明了不同属的厌氧氨氧化细菌对盐度的响应、耐受能力不同. Dale等[20]在凯普菲尔河口的研究表明，盐度值不同，厌氧氨氧化细菌的优势种不同.在东海椒江口海域潮下带沉积物中，厌氧氨氧化细菌以Candidatus Kuenenia、Candidatus Scalindua的种类为主，其丰度与盐度呈负相关.推测原因可能为不同属的厌氧氨氧化细菌对盐度的耐受性不同.对于河口小范围区域，受淡水输入的影响，总体盐度较低，主要分布为Candidatus Brocadia和Candidatus Kuenenia的种类[21]，随着河海混合加强，盐度上升不利于其种群生长，因而表现为厌氧氨氧化细菌丰度随盐度上升呈现下降趋势；而对于河口外的海湾、陆架等较大的研究区域，Candidatus Scalindua是其主要种群[20]，对高盐度有较强的耐受能力，盐度较高更适合其生长繁殖，丰度较高.
厌氧氨氧化细菌是一种专性厌氧菌[35]，迄今为止科学家们对厌氧氨氧化细菌的研究几乎全部集中于低氧或者厌氧环境中.本研究海域厌氧氨氧化细菌丰度与溶解氧的分布趋势[图 5(b)]与Fu等[28]在珠江口的研究结果相同，珠江口的溶解氧浓度为0.22~7.59mg ·L-1，表现为厌氧氨氧化细菌丰度随溶解氧含量上升呈现下降趋势.在低氧、厌氧条件下，反硝化细菌与厌氧氨氧化细菌存在对底物的协同关系，反硝化细菌可将硝酸盐还原成亚硝酸盐，为厌氧氨氧化细菌提供必要的反应底物.同时两者也存在对底物和竞争关系，反硝化细菌和厌氧氨氧化细菌都以亚硝酸盐作为反应底物.当COD/NO2--N比值较低时，以厌氧氨氧化方式去除氮的过程不会有显著的影响[36]；当COD/NO2--N比值较高时，亚硝酸盐将会被反硝化菌所利用，从而抑制厌氧氨氧化细菌[37].在缺氧、厌氧环境下，厌氧氨氧化细菌有较高的环境竞争力，从而导致其丰度随溶解氧变化而变化的趋势.其中33、34号站溶解氧浓度较高，厌氧氨氧化细菌的丰度也较高，推测可能的原因是在33、34号站位于东海南部，盐度较高、总有机碳含量较高为厌氧氨氧化细菌提供了良好的繁殖与生长条件. 2014年，Daigger[38]在研究海洋中碳氧对氮素移除过程贡献时发现，厌氧氨氧化过程需要少量氧的存在，1 mg铵态氮转化为氮气需要1.71 mg氧气的参与.而厌氧氨氧化细菌在溶解氧浓度稍高的环境中存在可能的原因是，厌氧氨氧化细菌对略高的溶解氧浓度有一定的耐受作用，或者在氧浓度稍高的环境中，厌氧氨氧化细菌处于休眠状态，当溶解氧浓度降低重新恢复活性[12].本研究以沉积物样品的DNA为研究对象表征该海域沉积物中所含有的厌氧氨氧化细菌的丰度，所得结果并非都是处于活性状态的厌氧氨氧化细菌，因此，溶解氧对厌氧氨氧化细菌活性的影响还需要后续从RNA、酶活性等方面进行深入研究.
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图 5 厌氧氨氧化细菌amx-16S rDNA、溶解氧、总有机碳含量在长江口邻近海域分布趋势 Fig. 5 Horizontal distribution of sedimentary proportion of amx-16S rDNA of ANAMMOX Bacteria, DO, TOC in adjacent waters of Yangtze Estuary |
相关性分析显示，沉积物中厌氧氨氧化细菌的丰度与总有机碳含量具有显著正相关关系(P<0.01，r=0.69)，这与之前Li等[39]的研究结果类似.在长江口外、杭州湾外的邻近海域，总有机碳总体含量虽然较低，但在从河口向外延伸的过程中逐渐升高，且南部海域总有机碳含量明显高于北部[图 5(c)]；而厌氧氨氧化细菌的丰度分布与有机碳含量的变化趋势相符[图 5(a)]，Hu等[23]在椒江河口邻近海域、张东声等[24]在舟山群岛海域对厌氧氨氧化细菌的研究也有类似结果.有机质作为反应物参与氨化反应促进铵盐的形成[39]，高的有机碳总量促进亚硝酸盐的积累[12].亚硝酸盐在厌氧氨氧化细菌介导的厌氧氨氧化生物过程中作为电子受体，其浓度的升高有利于促进厌氧条件下的氨氧化作用[40]，有机碳的存在会促进ANAMMOX反应物的产生，为厌氧氨氧化细菌提供反应物，有利于厌氧氨氧化细菌生物量的增多，高总有机碳含量为厌氧氨氧化细菌丰度的增加创造了有利条件.因此，沉积物中有机碳总量是河口生态系统中影响厌氧氨氧化细菌丰度的重要环境因子[21].
亚硝酸盐的浓度是厌氧氨氧化细菌丰度的控制型理化因子[21]，厌氧氨氧化细菌的丰度与亚硝酸盐的积累量有关.亚硝酸盐作为参与厌氧氨氧化反应的底物影响环境中厌氧氨氧化细菌的生物量，厌氧氨氧化细菌的丰度随亚硝酸盐浓度的升高而降低，Dang等[29]在胶州湾海域中亚硝酸盐浓度对厌氧氨氧化细菌丰度影响的研究也有类似结果.本研究中硝酸盐的浓度与厌氧氨氧化细菌amx-16S rDNA的拷贝浓度的相关性较低，说明硝酸盐并非是影响ANAMMOX过程的关键理化因子，这与之前Rich等[32]的研究结果不同，推测可能由于样品采集量较低或者采样环境中存在其他与ANAMMOX耦合或抑制的过程，硝酸盐对厌氧氨氧化细菌丰度的影响需进一步结合反硝化过程综合研究.
4 结论本研究利用实时荧光定量PCR技术，得到了东海近海代表区域表层沉积物中amx-16S rDNA的拷贝数，初步了解厌氧氨氧化细菌在长江口邻近海域的空间分布情况；同时通过厌氧氨氧化细菌amx-16S rDNA与细菌bac-16S rDNA拷贝数的对比，可知厌氧氨氧化细菌在总细菌生物量中所占比例偏低.把各站位的amx-16S rDNA的拷贝数作为表征厌氧氨氧化细菌生物量的指标，结合环境理化因子分析可知，盐度、总有机碳含量、亚硝酸盐等理化因素是影响厌氧氨氧化细菌丰度的重要因子.本研究为长江口邻近海域厌氧氨氧化细菌的研究提供了基础信息，也为进一步研究与反硝化作用的耦合关系指明了方向.
致谢: 感谢中国海洋大学环境科学与工程学院的赵情、乔玲同学在软件使用中给予的帮助| [1] | Mulder A. Anoxic ammonia oxidation[P]: US: 5078884, 1992-01-07. |
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