2016, Vol. 37
2. 南京林业大学生物与环境学院, 南京 210037
2. School of Biological and the Environmental, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China
偶氮染料是常应用于纺织、印染行业的典型染料，其具有生产废水色度大、特征污染物结构复杂、难降解等特点[1, 2]，采用的处理方法主要有吸附法、高级氧化法、微生物法等[3].吸附法和高级氧化法快速、高效，但处理能力有限，耗能高，且容易造成二次污染[4].近年来，基于添加胞外电子穿梭体的微生物处理法由于脱色彻底、耗能低、经济等特点，逐渐成为降解偶氮染料废水研究的热点[5, 6]，其中提高生物产氢、产乙醇率是其实验研究的关键.
蒽氢醌-2，6-二磺酸钠(AHQDS)\蒽醌-2-磺酸钠\腐殖质等都可以作为胞外电子穿梭体，以加快降解过程中细菌生长率、产氢率和转变降解产物[7]，其中蒽醌-2-磺酸钠(AQS)作为胞外电子穿梭体微小颗粒的还原型，在微生物新陈代谢过程中不仅可以提供和接受电子，而且不会被消耗[8]，可循环利用.此外，相比于嗜温菌，嗜热菌产氢效率更高，但升温耗能会降低整个过程的效能[5, 9]，所以通常采用嗜温菌作为厌氧发酵的主要菌株，例如Xu等[10]利用希瓦式菌脱色偶氮染料甲基红，Chookaew等[5]用克雷伯氏菌降解粗甘油脱色产氢，Maru等[11]用肠杆菌属暗发酵产氢.实验中采用嗜温菌Klebsiella oxytoca GS-4-08作为单一菌种进行厌氧发酵，菌株在脱色的同时可将VFA降解生成不同的产物(乙醇、氢气等)，相比于肠杆菌属等有着更高的脱色和产氢性能[12, 13]；氢气作为可再生能源，不仅清洁无污染，而且可用于工业生产，符合如今“废物资源化”的思想.现有的报道中有一些关于克雷伯氏菌厌氧脱色与产氢机制的研究[5]，但关于蒽醌-2-磺酸钠对其降解过程的影响研究不多，因此本研究采用嗜温菌Klebsiella oxytoca GS-4-08作为单一菌株厌氧发酵，添加AQS作为电子穿梭体以改变其电子传递速率，对降解过程中甲基橙(MO)厌氧脱色和产氢机制进行了分析，同时对电子平衡和能源转换进行了分析.
1 材料与方法 1.1 材料与试剂实验选用染色纺织品和棉纺行业的典型染料——偶氮染料MO作为模拟污染物，其购置于Sigma-aldrich试剂公司，化学结构如图 1所示.
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图 1 甲基橙化学结构 Fig. 1 Chemical structure of methyl orange |
实验中采用菌株为Klebsiella oxytoca GS-4-08(CGMCC 5237)，保存在LB平板上，环境温度保持为4℃.
除酵母膏、蛋白胨、AQS为优级纯外，其余均为分析纯试剂.
微量元素：FeSO4 ·7H2O 5 g ·L-1、ZnSO4 ·7H2O 0.011 g ·L-1、MnCl2 ·4H2O 0.1 g ·L-1、CuCl2 ·2H2O 0.268 g ·L-1、CoCl2 ·6H2O 0.203 g ·L-1、H3BO3 0.029 g ·L-1和NiCl2 ·6H2O 0.025 g ·L-1.
PBS溶液(100 mL)：Na2HPO4 ·12H2O(60 mL)17.9 g ·L-1；KH2PO4(40 mL)6.8 g ·L-1.
LB培养基：酵母膏5 g ·L-1、蛋白胨10 g ·L-1、NaCl 10 g ·L-1和琼脂15 g ·L-1用于细菌的平板保存；未加琼脂的LB培养基用于细菌的好氧培养.
MO脱色产氢的模拟废水配方：蔗糖6.84 g ·L-1、MO 0.033 g ·L-1、(NH4)2SO42.0 g ·L-1、Na2HPO4 ·12H2O 1.57 g ·L-1、KH2PO4 0.5 g ·L-1和微量元素1 mL ·L-1.
仪器类型：紫外分光光度计(UV-2550；Shimadzu，Japan)、气相色谱仪(GC-9790，FuLi，China)和恒温气浴振荡器(SHZ-82，金坛科析，China).
1.2 脱色和产氢实验菌株先在LB培养基中35℃、150 r ·min-1好氧培养12h，直到细菌生长到指数生长期，对其8000 r ·min-1离心15 min，倒掉上清液，利用PBS溶解下层菌液；取250 mL的血清瓶作为模拟反应器，加入100 mL的MO脱色产氢模拟废水，氮吹3 min后，立即用橡胶塞密封以保持瓶中厌氧环境，用一次性注射器将菌液100%接菌到模拟废水中，并置于恒温气浴振荡器中35℃，100 r ·min-1振荡，实时取样监测.血清瓶中最初的细胞干重为0.3 g ·L-1±0.1 g ·L-1.实验中蔗糖和MO分别作为电子供体和电子受体，进行MO脱色和产氢，监测产生的降解产物、MO剩余浓度、蔗糖剩余浓度、细菌生长量及产氢浓度.
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式中，A为最初吸光度值；B为监测吸光度值.
1.3 分析方法培养基中细菌浓度采用660 nm处的光浊度测定，细胞干重CDW采用标准方法测定[13]，蛋白浓度(Pro)采用考马斯亮蓝法在595 nm处测定；D660与Pro换算公式如下：
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(1) |
换算公式表明1.0 D660≈140 μg ·mL-1(以Pro计)≈240 μg ·mL-1(以CDW计).
MO采用紫外分光光度法测定，样品于8000 r ·min-1离心15 min取上清液，在其最大吸收波长465 nm处测定吸光度值；蔗糖测定采用蒽酮硫酸法，在620 nm处测定其吸光度值.
降解产物采用GC测定，方法为：检测器(FID)温度300℃，进样器温度250℃，色谱柱为毛细柱DB-FFAP，程序升温条件：70℃保持3 min，以20 ℃ ·min-1升到180℃，保持3 min，载气为氮气，1 μL进样量；氢气测定也采用GC，方法为：0.5 nm分子筛色谱柱，柱温60℃，进样器温度100℃，检测器(TCD)温度105℃，载气为氩气，流速30 mL ·min-1，1 μL进样量.累计产氢量的计算采用Liu等[14]的计算方法.
产氢动力学方程：Gompertz公式[15]用于拟合累计产氢量，如公式(2)所示：
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(2) |
式中，P(max, i)为最大累积产氢量，mL；Pi为拟合累计产氢量，mL；Ri为产氢速率，mL ·h-1；λi为延滞期，h；i代表氢气.
2 结果与讨论 2.1 产氢机制分析结合文献[16~19]分析添加AQS对细菌产氢的作用：细菌厌氧发酵在糖酵解过程中形成NADH，其再分配形成不同的最终产物，包括有机酸、醇类、氢气等；整个过程通过产物的再生来维持细胞新陈代谢和能源的平衡.克雷伯氏菌依赖于胞内电子载体产生质子(H+)产氢，来扩展还原当量和再生氧化载流子NAD+促进降解产物的产生[20~22].其中氢气摩尔当量受有机酸、溶剂和氢化酶电子当量的影响，也受到胞外醌类物质(AQS)的影响；AQS的添加可改变细胞内NADH/NAD+的比率和部分酶的活性，改变细胞产氢速率[23, 24].
本实验中对不同浓度的AQS，研究其对Klebsiella oxytoca GS-4-08发酵产氢的影响，结果如图 2所示.从中可以看出在0.1 mmol ·L-1 AQS浓度时，累计产氢总量最高.本研究利用Gompertz公式对不同浓度AQS产氢动力学进行拟合，各相关参数见表 1，不同情况下的R2均大于0.987，说明实验中的产氢过程均满足Gompertz公式的产氢动力学模型.从表 1可以看出，0.1 mmol ·L-1 AQS产氢速率常数最高为10.07 mL ·h-1，延滞期最短为5.29 h，产氢总量最高为100.58 mL，是Klebsiella oxytoca GS-4-08发酵产氢合适的AQS浓度；AQS浓度为0.25 mmol ·L-1、0.5 mmol ·L-1时，产氢量分别为79.72 mL、75.20 mL，延滞期分别为5.29 h、5.30 h，实验结果表明：相较于空白实验，随着AQS浓度的增加，产氢量下降，延滞期增长，初步推测是过高的AQS抑制了细菌的生长，在此特增加不同AQS浓度下细菌生长情况，如图 3所示，实验中细菌接菌率为100%，所以初始细菌干重较大，从中可以看出，0.1 mmol ·L-1AQS细菌生长量最多，相较于空白实验，随着AQS浓度的增加，细菌生长量下降，这与上述推测相符.
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图 2 不同AQS浓度下拟合产氢情况 Fig. 2 Fitting hydrogen production under different AQS concentrations |
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图 3 不同AQS浓度细菌生长情况 Fig. 3 Growth of bacteria under different AQS concentrations |
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表 1 产氢动力学数据 Table 1 Data of hydrogen production kinetics |
2.2 蔗糖降解分析
Ye等[4]在研究添加蒽氢醌-2，6-二磺酸钠(AQDS)情况下，细菌利用葡萄糖、木糖、纤维二糖发酵产氢中碳源降解率分别为85%、89%和74%；Chookaew等[5]在利用嗜热菌降解粗甘油产氢中最佳碳源利用率为81%；Zee等[25]发现细菌在脱色产氢过程中受到偶氮染料毒性的影响，醌类物质的投加促进染料的脱色，降低染料毒性对细菌的影响，促进细菌生长，从而增加细菌对碳源的利用率；Yu等[19]对Klebsiella oxytoca GS-4-08利用甘露糖、半乳糖、葡萄糖、蔗糖等降解MO情况进行了分析，得出最佳碳源为蔗糖，同时对0~20 mmol ·L-1蔗糖浓度进行降解MO分析，得出最佳蔗糖浓度为20 mmol ·L-1，因此，文中直接沿用20 mmol ·L-1蔗糖作为培养基底物.
本实验中对不同浓度的AQS，研究其对Klebsiella oxytoca GS-4-08降解碳源的影响，结果如图 4所示.文中对不同浓度AQS降解蔗糖过程进行一级动力学拟合，各相关参数见表 2，不同情况下的R2均大于0.97，说明实验中的蔗糖降解过程均满足一级降解动力学模型.从图 4中可以看出细菌在0.1 mmol ·L-1 AQS时对蔗糖的降解常数达到最高为0.11 h-1，高于0、0.25、0.5 mmol ·L-1AQS时的0.072、0.085和0.079 h-1；0.1 mmol ·L-1 AQS利用碳源的延滞期也最短为6.3 h，0、0.25、0.5 mmol ·L-1 AQS延滞期分别为9.6、8.2、8.8 h. 0.5 mmol ·L-1 AQS的延滞期高于0.25 mmol ·L-1 AQS，说明AQS浓度可以影响细菌对碳源的利用，但不是唯一影响因素；确定合适的AQS浓度有利于Klebsiella oxytoca GS-4-08充分利用碳源，这也有利于其在工业废水处理上的应用.
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图 4 不同AQS浓度拟合蔗糖降解情况 Fig. 4 Fitted sucrose degradation under different AQS concentrations |
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表 2 蔗糖降解动力学数据 Table 2 Data of sucrose degradation kinetics |
2.3 染料降解机制分析
通过改变AQS浓度，研究了胞外电子穿梭体浓度对细菌脱色MO的影响，结果如图 5所示，可以看出不同浓度AQS的MO脱色率均随着时间的增长而增大，MO的脱色效率随着AQS浓度的升高而升高；0.1、0.25、0.5 mmol ·L-1AQS能够分别在2.5、5、7 h内完全脱色MO，未投加AQS的空白实验在25 h尚未脱色完全；文中对不同浓度AQS脱色MO过程进行一级动力学拟合，各相关参数见表 3，不同AQS浓度下的R2均大于0.95，说明实验中的MO脱色过程均满足一级动力学降解模型.从中可以看出，随着AQS浓度的增加，降解动力学常数k逐渐增大，半衰期逐渐缩短，反应速率逐渐增大；在反应初期，速率常数增幅较大，随着反应的进行，速率常数增幅逐渐降低；在AQS浓度为0.1、0.25和0.5 mmol ·L-1时，MO降解的半衰期分别缩短为1.24、0.53和0.31 h，反应速率常数分别提高了622%、1467%和2467%，可见AQS的添加可显著提高MO脱色效率.当AQS浓度超过2 mmol ·L-1时，MO脱色效率变化不大(结果未体现)，这与文献[26]中AQDS促进偶氮染料脱色的结果一致.
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图 5 不同AQS浓度MO脱色动力学拟合 Fig. 5 Decoloring kinetic fitting of MO under different AQS concentrations |
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表 3 MO脱色动力学数据 Table 3 Data of MO decoloring kinetics |
Zee等[25]的研究结果表明醌类物质作为胞外电子穿梭体不仅可以作为电子受体(供体)参与氧化还原反应，而且能够充当偶氮还原反应的媒介；结合文献[27, 28]分析AQS促进MO脱色机制：蔗糖被细菌消耗传出电子，AQS接收电子转变为还原态，还原态AQS把电子传递到MO上，偶氮键断裂，脱色完全，还原态AQS累积在瓶底用于再次降解MO和进行胞外电子传递；为了进一步证实这个推理，通过观察模拟废水中MO脱色过程，发现脱色的同时溶液颜色从亮黄色转变为暗绿色，这与AQS从氧化态到还原态转变过程相符，说明此时的AQS充当催化剂的作用，可循环使用，降低脱色过程的活化能，提高电子传递速率，促进MO的脱色；关于沉积在瓶底的AQS，这与细菌处于稳定期后，蔗糖被消耗，代谢物质不断积累，导致微生物细胞生长速率下降，死亡率上升，新增加的细胞数与死亡细胞数趋于平衡，表现为细胞数量稳定；由于营养物质减少，细胞之间易于相互黏附，分泌物增多，形成菌胶团(絮体)，稳定期微生物不但具有一定的氧化有机物的能力，而且还具有良好的沉降性能.菌胶团沉降在瓶底，吸附AQS，颜色偏深，导致血清瓶底呈暗绿色[29].
2.4 产物分析本实验中通过改变AQS浓度，研究胞外电子穿梭体浓度对细菌产酸、产醇、产氢以及细菌生长量的影响，结果如图 6所示.从中可以看出AQS浓度在0.1 mmol ·L-1时产酸、产醇及细菌生长量均最高分别为0.117 mol ·mol-1、0.116 mol ·mol-1、1.9 g ·L-1.在0.25 mmol ·L-1与0.5 mmol ·L-1AQS时，产酸、产醇及细菌生长量分别为0.102 mol ·mol-1、0.111 mol ·mol-1、1.34 g ·L-1和0.11 mol ·mol-1、0.112 mol ·mol-1、1.25 g ·L-1，乙醇与乙酸之比先增高后降低再增高，这与Niu等[30]细菌降解代谢流模型结论相同，因为在产乙醇路径中消耗NADH辅酶，产乙酸过程中产ATP，ATP给产氢过程提供能量，从而提高产氢量.同时随着AQS浓度增加，细菌生长量逐渐降低，产氢量的下降可能与过高的AQS浓度抑制细菌产氢酶、双向氢化酶活性有关，细菌生长量的降低与AQS影响细菌生长耐受性有关.
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图 6 不同AQS浓度降解产物情况 Fig. 6 Degradation products under different AQS concentrations |
厌氧发酵过程中，部分蔗糖降解用于细菌合成新的有机体，其余蔗糖通过糖酵解(EMP)途径生成电子供体NADH和丙酮酸钠，NADH被偶氮还原酶用来还原甲基橙，而丙酮酸钠则继续经过TCA循环生成大量电子供体，这些电子供体中只有小部分传递给偶氮还原酶催化偶氮键的断裂[31]，绝大部分用于乙酸、乙醇、氢气等降解产物生成过程.经过计算[9, 15]，在细菌利用碳源降解的过程中，0、0.1、0.25、0.5 mmol ·L-1 AQS产生的乙酸、乙醇与氢气的COD值总和分别为416.16、448.41、376.49、408.44 mg远高于150、190、134、125 mg的细菌生长量，这与张晓玉[31]的研究结论类似.
为进一步推测细菌发酵产氢过程，结合文献分析，蔗糖首先被转化酶分解为葡萄糖，葡萄糖经过糖代谢转变为丙酮酸产生电子，为细菌打开MO的偶氮键提供电子；一部分的丙酮酸被格式酶催化产甲酸，甲酸被甲酸氢化酶降解产氢；另一部分的丙酮酸被脱氢酶催化断裂产生电子与氢化酶结合产氢，与此同时剩余电子先后被传递到NAD+、NADH、固氮酶，最终与H+结合产氢[8, 32~34]；这与实验中模拟废水脱色迅速，产氢缓慢的现象相符合. Liu等[14]利用粗甘油产氢，氢气最大产量为0.75 mol ·mol-1，Jitrwung等[32]优化培养基成分促进粗甘油产氢，最大产氢量为0.95 mol ·mol-1，实验中投加电子穿梭体促进蔗糖产氢，最大产氢量能够达到2.25 mol ·mol-1.
2.5 电子平衡计算将细菌生长前添加的碳源与生长结束产生的降解产物、细菌生长量等均转化为COD，并对其进行电子平衡的计算，计算过程参见Wu等[9, 15]的计算方法.
通过改变AQS浓度，研究胞外电子穿梭体的浓度对电子平衡计算的影响，计算结果如表 4所示.从中可以看出AQS浓度在0.1 mmol ·L-1时，生成的乙酸量、乙醇量、细菌量、产氢量均最多，其总量(以COD计，下同)达到638.41 mg，高于0、0.25、0.5 mmol ·L-1 AQS的566.25、556.5、568.44 mg；电子得率可达90.5%，高于0、0.25、0.5 mmol ·L-1 AQS的86.7%、75.5%、79.8%；说明0.1 mmol ·L-1 AQS适合Klebsiella oxytoca GS-4-08利用蔗糖降解MO.在整个降解过程的电子平衡计算中，电子得率范围在72.61%~87.98%之间，这是因为在产氢过程中有一些未检测到的降解产物的生成.
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表 4 电子平衡计算 Table 4 Electronic balance calculation |
2.6 能源分析
Klebsiella oxytoca GS-4-08利用蔗糖降解MO的过程中，产生乙醇和氢气，其燃烧热值分别是1366 kJ ·mol-1和286 kJ ·mol-1.能源计算公式参考Wu等[9, 15]的计算方法.本文研究了不同AQS浓度对细菌降解MO产氢过程中能源转化的影响，结果见表 5.从中可以看出最大的能源产率是0.1 mmol ·L-1AQS的102.2×10-3 kJ ·(h ·L)-1，在0、0.25、0.5 mmol ·L-1AQS浓度，能源产率均较低，分别为99.2×10-3、91.3×10-3、97.9×10-3 kJ ·(h ·L)-1；能源产量在0.1 mmol ·L-1AQS最高为802 kJ ·mol-1，其余浓度能源产量均较低，分别为735、538、631 kJ ·mol-1.降解产物中氢气属于气体、乙醇沸点较低；这两种物质比较容易分离，其热能可应用于工业生产.
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表 5 能源计算 Table 5 Energy calculation |
3 结论
(1)通过改变AQS浓度，研究AQS浓度对Klebsiella oxytoca GS-4-08厌氧降解MO的影响，得到最佳浓度.结果表明该浓度下Klebsiella oxytoca GS-4-08脱色MO、降解蔗糖、产醇、产酸、产氢均能达到较高程度.
(2)通过对不同AQS浓度下，MO脱色降解过程建立一级动力学，得出随着AQS浓度增加，MO脱色越快、延滞时间越短，并对Klebsiella oxytoca GS-4-08脱色MO的机制进行了分析；同时对产氢过程建立动力学模型，得出最佳AQS浓度、最佳产氢量和产氢速率，并对细菌产氢机制进行了初步的分析.
(3)将Klebsiella oxytoca GS-4-08降解MO过程中加入和产出的物质转换成COD，计算降解过程中电子得率，得到最佳电子得率；对降解过程中加入与产出的能量进行对比，得到最高能源产量，表明Klebsiella oxytoca GS-4-08在工业化应用上有很大发展前景.
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