2016, Vol. 37
2. 重庆市三峡库区农业面源污染控制工程技术研究中心, 重庆 400716;
3. 重庆市农业资源与环境研究重点实验室, 重庆 400716
2. Chongqing Engineering Research Center for Agricultural Non-point Source Pollution Control in the Three Gorges Reservoir Area, Chongqing 400716, China;
3. Chongqing Key Laboratory of Agricultural Resources and Environment, Chongqing 400716, China
汞(Hg)是一种普遍存在的有毒重金属，其毒性最强的形式——甲基汞(MeHg)是一种强亲脂性、高神经毒性的有机汞化合物，可以在生物体内富集积累，进而通过食物链进入人体，具有极大危害性[1].生物和非生物因素都可以使环境中的无机汞发生甲基化，其中微生物对环境中甲基汞的含量起着至关重要的作用.研究表明，汞的甲基化作用主要发生在厌氧环境下，产甲烷菌(methanogenus)、硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria, SRB)和铁还原菌(dissimilatory iron-reducing bacteria，FeRB)中均发现有能使汞甲基化的菌株, 其中SRB被认为是水库等环境中最主要的汞甲基化因子[2~5].
三峡库区是我国最大的年调节型水库，其季节性蓄水、放水过程形成一个垂直高度30 m，面积为350 km2的水库消落带，是一个典型的“汞敏感生态系统”[6, 7].库区被淹没土壤和植物主动或被动的将汞释放到水库生态系统中[8]，同时土壤有机质和植物腐解释放的大量营养物质为微生物提供丰富食物来源，使厌氧生长的SRB等细菌大量生长，促进无机汞向甲基汞转化[9].目前对消落带土壤和沉积物汞含量，甲基化特征及汞的迁移转化取得了一定的研究成果.消落带沉积物中总汞(THg)含量略高于河流沉积物背景值[10]，且MeHg :THg的值表现为淹没沉积物＞落干沉积物[11].李飞等[12]对三峡库区香溪河消落带泄水期(5~8月)不同海拔土壤理化性质及微生物活性进行研究发现，随海拔降低、淹水强度增强，消落带土壤含水量增加，pH值上升，土壤微生物生物量和微生物熵逐渐降低.干湿交替还导致土壤中氧化还原电位的交替和不同性质微生物群落的周期性交替[13].但是，对于其中与汞甲基化相关的微生物种类、生物汞甲基化过程及其影响因素的研究比较缺乏.在本课题组前期研究中，发现库区消落带10~20 cm土层土壤中，可培养细菌与甲基汞含量呈显著或极显著正相关关系[14].本文通过3个汞浓度水平试验，以汞甲基化模式菌株Desulfovibrio africanus(D. africanus, DSM-2603)接入灭菌的消落带土壤为对照，研究了三峡库区消落带土壤中硫酸盐还原菌的数量与甲基汞含量之间的相关性，通过验证消落带土壤中SRB对甲基汞生成的贡献，以期为阐明三峡消落区土壤汞的生物甲基化机制，明确库区甲基汞的释放特征及环境效应等后续研究提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 供试土壤和水样供试土壤于2015年5月采自三峡水库腹心地带重庆忠县石宝寨新政村(E108°12′3″；N30°24′36″).土壤鲜样一部分冷冻干燥后用于测定土壤理化性质(见表 1)、THg和MeHg；另一部分经风干、过2 mm筛后用于模拟试验，其中，一半土样经高温高压蒸汽灭菌(121℃，120 min)并晾干后，用于接种D. africanus试验(试验A)；另一半用于原土试验(试验B)硫酸盐还原菌的数量分析及其与甲基汞含量的相关性.
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表 1 供试土壤基本理化性质 Table 1 Physicochemical properties of test soil |
供试水样取自长江支流的嘉陵江北碚段，基本理化性质见表 2.其中，一半水样经高温高压蒸汽灭菌(121℃，25 min)处理，用于试验A；一半水样用于试验B.
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表 2 水样基本性质 Table 2 Properties of water in the Jialing River |
1.2 供试菌株及培养基 1.2.1 供试菌株
供试SRB菌株D. africanus购自德国菌种保藏中心(DSMZ)，保存于西南大学资源环境学院.
1.2.2 培养基菌株D. africanus培养和计数用培养基为乳酸-硫酸根基础选择培养基[15].
SRB计数用培养基选用GB/T 14643.5-2009中测定SRB所用培养基[16].
1.2.3 培养基和菌悬液的制备接种对数生长期的菌液于D. africanus选择培养基[15]中，30℃厌氧培养7d，并采用血球计数法测定菌体细胞数量，备用.
1.3 试验设计试验装置为高35 cm、直径22 cm玻璃瓶(试验过程中用锡箔纸避光).称取6 kg不同处理的土壤(表 3)倾斜铺于玻璃瓶中(约45°)，再缓慢注入3.5 L江水，使其淹至斜面高度的一半.在室温30℃±3℃条件下，进行为期30 d的模拟试验.每个处理3个平行，每个样品重复测定3次.
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表 3 试验处理的设置1) Table 3 Experimental treatments |
1.4 样品采集与分析方法
分别于试验的第1、2、3、5、8、11、15、20、25和30 d，采集各处理的水样和土样.用聚四氟乙烯管虹吸采集水样至硼硅玻璃瓶中，然后加入0.5%(体积分数)浓盐酸酸化，4℃冷藏待测.土样使用自制管状采样器按多点采样法分两份采集于无菌自封袋：一份4℃冷藏，用于微生物计数；另一份冷冻干燥后碾磨过0.149 mm筛，-20℃保藏，用于甲基汞、总汞测定以及理化性质分析.
土样THg用DMA-80固体进样自动测汞仪直接测定，土样和水样MeHg分别采用萃取-乙基化结合GC-CVAFS法[17]、蒸馏-乙基化结合GC-CVAFS[18]法测定，水样总汞参照USA EPA Method 1631标准方法进行检测[19]. D. africanus细菌数和总SRB菌群数采用MPN法[20]测定.
1.5 质量控制及数据处理本试验中所用玻璃器皿均在使用前用硝酸(25%，体积分数)浸泡24 h以上，超纯水清洗后置于马弗炉500℃灼烧30 min，洁净无汞环境冷却后使用.取样器皿使用前均湿热灭菌(121℃，30 min).分析过程中采用空白试验、标准物质测定、平行样控制及加标回收率进行质量控制.试验试剂都为优级纯.土样总汞标准物质为GBW07405(GSS-5)，测定加标回收率为89%~108%；氯化甲基汞标准溶液来自Brooks Rand Ltd(USA)，测定加标回收率为86%~118%.
1.6 数据分析数据分析和作图使用Excel、SPSS 18.0和Origin 8.0.
2 结果与讨论 2.1 土壤总汞的动态变化土壤THg的动态变化如图 1所示，各处理THg含量总体上呈下降趋势.试验A中，不同处理总汞降幅表现为A5 > A1 > A0，其中A0处理THg含量在30 d内降低了5.39%，A1和A5则分别降低了7.33%和7.70%，各处理前后差异不显著(P > 0.05，n=30).该结果与贺春凤[21]的研究一致，这是由于土壤淹没后会将Hg释放到水体中，同时上覆水与间隙水中的Hg浓度梯度是Hg在土壤-水体界面迁移的重要动力，因而初始汞浓度越高，释放越快.
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图 1 土壤THg变化趋势 Fig. 1 Variations in soil THg |
与试验A土壤THg的动态变化相一致，在试验B中，处理B0、B1、B5土样THg含量在试验前后差异不显著，THg含量在第30 d较第1 d分别降低了3.02%、6.81%和7.14%.此外，试验B各处理中THg含量的降低程度比试验A稍低，但处理间的差异不显著.
2.2 接种D. africanus对消落带土壤甲基汞含量变化的影响在试验A中，随培养时间增加，各处理D. africanus细菌数量均呈先增高后减少趋势(图 2).试验前8 d，各处理D. africanus细菌数量均增长缓慢.第15 d开始，A0快速增长，至第20 d达到最大值2.26×104 cfu ·g-1，但第25 d开始显著降低；A1第11 d开始较快增长，至第15 d达到最大值2.61×104 cfu·g-1，第20 d开始显著降低；A5第20 d开始急速增长，达到最大值3.65×104 cfu·g-1，随后开始逐渐降低，该结果符合细菌生长规律.
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图 2 接菌试验D. africanus菌数与甲基汞含量变化趋势 Fig. 2 Variations in D. africanus bacteria numbers and MeHg levels over a period of 30 incubation days in the inoculation experiment |
各处理D. africanus细菌数量达到最大值时表现为： A0 < A1 < A5，分别为初始值的23.05倍(第20 d)、22.77倍(第15 d)、39.50倍(第20 d).可见低浓度外源Hg(A1)能促进菌株D. africanus生长，使其较快进入对数生长期，且在整个试验周期内，能保持相对高而稳定的活菌数；高浓度Hg(A5)使菌株D. africanus的迟缓期延长，因而在前期表现出一定的生长抑制作用，但从15 d后，菌株D. africanus表现出对环境中的汞的生态适应性，且菌数显著高于其余两个处理，这与Choi等[22]的研究结果一致.
由图 2可见，处理A0、A1、A5土壤MeHg含量均呈增加趋势.试验前8 d，3个处理土壤MeHg含量差异不显著，这是外源Hg的添加导致微生物汞甲基化活动延迟所致[23].随后，A0土壤MeHg含量继续缓慢增长，至第30 d达到最大值1.43×104 ng·g-1，为初始值的12.85倍；A1土壤MeHg含量变化与A0相比差异不显著，到第30 d达到最大值2.94×104 ng·g-1，为初始值的92.74倍；A5在第25 d达到最大值7.60×104 ng·g-1，为初始值的122.47倍.从第8 d开始，土壤MeHg含量始终表现为A5 > A1 > A0.结果表明，在不添加外源Hg时，菌株D. africanus仍能利用背景环境下的Hg，从而表现出一定的汞甲基化能力；添加外源Hg后，汞甲基化活动增强，且在试验Hg浓度范围内，Hg浓度越高，甲基化活动越强.该结果与Randall等[24]的研究结果一致.
土壤MeHg含量不仅与THg含量有关，而且与D. africanus细菌数量显著正相关性(图 2)： A0、A1和A5处理的D. africanus细菌数量与MeHg含量的相关性系数(r2)分别为0.36(P < 0.05，n=30)、0.44(P > 0.05，n=30)和0.56(P < 0.01，n=30).随着D. africanus细菌数量的增加，MeHg含量呈延滞增高趋势： A1处理在第5d菌体数量显著增加，而MeHg含量则在第11 d开始显著提高；A5处理在第20 d菌体数量显著增加，而MeHg含量则在第25 d后跃升.
2.3 原土SRB菌数与MeHg含量相关性分析试验B中，各处理的SRB菌数量表现为“消-涨”的周期性变化特征(图 3)： B0处理SRB菌在5 d达到306 cfu·g-1的峰值，然后显著降低，到30 d又回升到410 cfu·g-1的峰值水平.与该趋势类似，B1、B5处理的土壤总SRB菌数分别在8 d达到第一个峰值：分别为119 cfu·g-1、541 cfu·g-1，在30 d达到第二个峰值：分别为421 cfu ·g-1、1 105 cfu ·g-1.总SRB菌数量整体表现为B0 < B1 < B5，表明高Hg环境有利于“诱导”土壤总SRB数量的增加.但总体而言，在非严格厌氧条件下，三峡库区消落带土壤中SRB含量较低，在整个试验周期内，3个处理的总SRB菌数平均仅约190 cfu ·g-1，相同Hg浓度下均显著小于试验A的3个处理中D. africanus细菌数量.
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图 3 原土试验SRB菌数与甲基汞含量变化趋势 Fig. 3 Variations in SRB numbers and MeHg levels over a period of 30 incubation days in the inoculation experiment |
试验B处理的土壤MeHg含量也呈一定的“消-涨”趋势. B0、B1和B5处理在3~5 d达到最大值： 2.55×103、4.08×103和5.54×103 ng ·kg-1，分别是第1 d的2.71、7.12和7.02倍.导致该结果的原因可能在于，淹水初期形成厌氧水底环境，有利于汞的甲基化[25].第30 d，B5处理的MeHg含量为1.93×103ng ·kg-1，显著高于B0(0.34×103ng ·kg-1)和B1处理(0.57×103 ng ·kg-1)，相同Hg浓度下均显著小于试验A的3个处理中MeHg含量.总体上，土壤MeHg含量在整个试验周期内表现为： B0 < B1 < B5，该结果与仇广乐等[26]的研究一致，表明外源高汞环境有利于土壤甲基汞的生成.
值得注意的是，试验B处理中，原土中MeHg含量的消涨与总SRB数量不存在显著的相关性(P > 0.05，n=30)，其相关性系数(r2)分别为： 0.01、0.36、0.02.结果表明，在三峡水库消落区土壤中，硫酸盐还原菌等厌氧微生物并不是最重要的汞生物甲基化微生物.这可能是由于： ①本次所采土样为5月落干期土壤，而SRB为严格厌氧微生物，其含量本身可能处于较低水平；②本试验模拟的消落带淹水过程属于非严格厌氧环境，而SRB的汞甲基化作用是在严格厌氧条件下进行的[27].除厌氧微生物外，可能存在某些能使汞甲基化的好氧或兼性厌氧微生物[14]，且库区消落带土壤可培养细菌与甲基汞含量呈显著或极显著正相关关系.因而推测，在三峡水库消落区土壤中，产生汞生物甲基化的微生物种群并不仅仅是硫酸盐还原菌等厌氧微生物，而其它好氧或兼性厌氧微生物菌群的菌群结构、数量和汞甲基化能力对于甲基汞的生成更为重要.
2.4 土壤MeHg占THg比例变化MeHg占THg百分比(%MeHg)被认为是判断MeHg产率的一个重要指标[21].本试验中，各处理MeHg占THg比例如图 4所示.试验A土壤中%MeHg整体呈上升趋势，A0、A1和A5的初始值分别为1.00%、0.13%和0.08%，并且分别在25～30 d达到最大值： 8.88%、12.46%和11.05%，但各处理间差异不显著.可以看出，土壤%MeHg与汞浓度不是简单的线性关系，土壤汞浓度越高的处理，土壤甲基化程度不一定越高.该结果与李楚娴等[28]的研究结果类似.
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图 4 土壤甲基汞占总汞百分比变化趋势 Fig. 4 Variations in the percentage of MeHg in THg over a period of 30 incubation days |
试验B中MeHg含量呈先增后减趋势，整体变化较小，B0、B1和B5达到最大值时仅分别较初始值提高1.46%、0.85%和0.73%，且显著低于处理A，可见其甲基化过程较弱.
此外，在处理A中，%MeHg比率与D.africanus菌数显著正相关，A0、A1和A5的相关系数(r2)分别为0.41(P < 0.05，n=30)、0.34(P > 0.05，n=30)和0.56(P < 0.01，n=30)；而处理B中土壤%MeHg含量比率与总SRB菌数并没有显著相关性(P > 0.05，n=30).
2.5 甲基汞含量影响因子分析土壤MeHg含量与THg、pH值、有机质和Eh等因素的相关性分析见表 4.结果表明，试验A、B处理中，土壤甲基汞含量与总汞含量均无显著相关性，这可能是由于生物可利用性汞只占总汞小部分，总汞的变化并不能直接反映生物可利用性汞的变化[29].此外，甲基汞含量与电导率也无显著相关性.
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表 4 土壤MeHg含量与土壤性质的关系1) Table 4 Correlations between soil MeHg and soil properties |
在本研究中，试验A中pH值和有机质含量均与MeHg含量呈显著负相关(P < 0.05，n=30)；而试验B的pH值和有机质含量则与MeHg无显著相关，该结果与张成等[30]的研究结果不一致，而与丁小勇[31]的结果较为吻合，出现这种结果可能是因为试验处理不同所致.
3 结论(1)淹水状况有利于THg从土壤中释放，且Hg含量越高，释放越快.
(2)三峡库区消落带土壤中总SRB菌群数量较低，且总SRB数与MeHg含量无显著相关性.
(3)菌株D. africanus对环境中的Hg具有生态适应性，且D. africanus细菌数量与MeHg含量显著正相关.
(4)受三峡水库季节性蓄水、放水的影响，库区消落带土壤表现为非严格厌氧环境，其中硫酸盐还原菌也并非优势菌群，因此，土壤中甲基汞含量与总SRB菌数无显著相关，推测三峡库区消落带土壤中还存在其他主导汞生物甲基化作用的好氧或兼性厌氧微生物种群.
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