2016, Vol. 37
2. 中国科学院大学资源与环境学院, 北京 100049;
3. 中国科学院新疆生态与地理研究所荒漠与绿洲生态国家重点实验室, 乌鲁木齐 830011;
4. 长春市林业科学研究院, 长春 130117
2. College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. State Key Laboratory of Desert and Oasis Ecology, Xinjiang Institute of Ecology and Geography, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011, China;
4. Changchun Academy of Forestry, Changchun 130117, China
随着工业化与城市化的快速发展，人类化石燃料消耗、氮肥使用及汽车尾气排放持续增加，导致对流层臭氧(O3)浓度升高[1, 2]的同时氮沉降加剧[3, 4].近30年来，全球O3浓度正以每年0.5%~2.0%的速度增加[5].2015~2050年O3浓度将会继续上升20%~25%，至2100年将达到40%~60%[6].中国O3污染尤为严重，华北平原白天小时O3浓度最大值已超过300 nmol ·mol-1，已经对植物造成伤害[7].而我国是继欧洲、美国之后的又一氮沉降集中区[3]，其中有些森林生态系统氮沉降已经达到50kg ·(hm2 ·a)-1，远高于10~20 kg ·(hm2 ·a)-1的森林生态系统氮承载阈值[8]，这将严重影响森林生态系统服务功能及健康[9].大气O3浓度和氮沉降的增加将扰乱生态系统的平衡，已成为重大的全球性环境问题[6].
O3及氮沉降均影响了决定植物生物量的光合生理特性.O3浓度升高会对植物产生氧化伤害，引起气孔导度下降，光合速率降低，生长缓慢，生产力下降，从而表现为森林衰退，农作物减产等[10~13].而氮沉降在一定范围内可以有效提高植物的光合能力，提高生长，增加生物量累积，但过量则会造成土壤酸化，营养失衡，因而氮沉降对森林生态系统结构和功能起到重要作用[14~16].李德军等[14]对不同森林树种的研究表明，O3和氮沉降交互作用多被分为协同作用与拮抗作用两种.Lippert等[15]发现高氮使得O3暴露下挪威云杉的光合作用降低.Pell等[16]研究表明：适量氮处理下，O3降低山杨生物量累积； 当氮过量时，山杨对O3的敏感性降低.但Watanabe等[17]却未发现氮沉降对O3暴露下民枹栎的生长及光合有显著性影响.因此，两者的交互作用与树种、O3暴露浓度、氮水平以及本身所处的气候环境有关.
杨树(Populus)是世界中纬度平原地区木材产量最高、栽培面积最大的速生用材树种之一，被广泛用于集约栽培，为提供生物资源和改良环境起到重要作用.我国是杨树产业大国，天然林面积约300万hm2，人工林面积约700万hm2[18, 19].杨树资源分布、品种数量及其人工林面积都处于世界领先地位，广泛用于生态防护林和工业用材林.国外关于杨树O3敏感性的研究已有相关报道，高浓度O3会导致杨树光合色素含量下降，光合能力下降，相对生长速率下降，生物量累积减少等[20~22].
国内当前O3浓度已远远超过了树木生长的受害临界水平[23]，北京地区已超过70 nmol ·mol-1[24]，对杨树已造成了明显的可见伤害[25]，因此对杨树进行O3胁迫效应的研究尤为重要.但目前国内关于O3与氮沉降共同作用影响的研究只是针对香樟和小麦[17, 26]，未见针对杨树的相关报道.本实验利用开顶式气室(open top chambers，OTCs)对O3和氮沉降对杨树光合和生物量方面的影响进行研究，阐明氮沉降对杨树O3敏感性的影响及相应的光合生理生态机制，以期为应对全球背景下O3浓度升高与氮沉降加剧对杨树的防护提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 实验设计该实验区位于北京市昌平区马池口镇种子站(E116°13′，N40°19′)，属于大陆性季风气候，年平均气温11.8℃，年降水量550 mm.采用的是由长春林业科学研究院提供的青杨(Populus cathayana)扦插苗.2015年5月将长势较为一致的幼苗统一移入20 L的圆形花盆中，所用土为当地表层土壤，其中含氮量为0.9 g ·kg-1.所有幼苗全部移入开顶式气室(OTCs)，以适应气室内环境，之后进行O3熏蒸处理.
OTCs为高2.0 m、边长1.0 m的正八面柱体，为减少外界气体对气室内气体的影响，在柱体顶端加了一个高1 m、倾斜角为45°的收缩口.气室由钢架和钢化玻璃组成.共设置3个O3水平：CF(过滤大气，[O3]＜40nmol ·mol-1)、NF(环境大气[O3])、NF40(环境大气[O3]+40nmol ·mol-1[O3]),每个O3水平设3个OTC重复.每个OTC中幼苗随机分为3组，每组至少5株，分别设为空白对照(N0)、施氮50 kg ·(hm2 ·a)-1(N50)、施氮100 kg ·(hm2 ·a)-1(N100).以尿素为氮源，分别在6月24日、7月12日、7月31日、8月20日、9月5日分为5次浇灌于盆内土壤表层，空白对照浇等体积(100 mL)的自来水.整个实验期间每个氮水平每盆共施加0 g(N0)、0.445 g(N50)和0.890g(N100).实验期间各个罩子的O3浓度由美国热电公司49i臭氧分析仪监测，O3熏蒸时间为6月5日至9月8日.每日熏气时间最长为11 h(08:00~19:00)，阴雨天停止熏气.实验期间所有O3处理(CF、NF、NF40)的实际监测的平均O3浓度和AOT40(实验期间小时O3浓度超过40nmol ·mol-1的累计值)分别为34.3、52.1、 80.3nmol ·mol-1和4.4、16.0、 38.7 μmol ·mol-1 ·h.实验期间每3~5 d将OTC内植株随机移动，以消除气室内部间差异可能引起的影响[27].
1.2 指标测定 1.2.1 光合特性指标测定采用Li-6400便携式光合测定仪(美国LI-COR公司)在不同生长阶段(8月9日、9月5日)测定叶片的气体交换参数和叶绿素a 荧光参数.其中气体交换参数包括净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)和胞间CO2浓度(ci)； 叶绿素a 荧光参数包括：PSⅡ反应中心激发能捕获效率(F′v/F′m)、光化学猝灭系数(qP)、电子传递速率(ETR).具体测定方法：晴天上午09:00~12:00，每处理选取4~5株作为待测植株，每株选取2~3片中部邻近健康叶片.瞬时光合测定时设定的光强为1 200 μmol ·(m2 ·s)-1，CO2浓度为380 μmol ·mol-1，气温控制在环境温度±1℃，相对湿度为45%±5%.9月6、7日两天测定光合速率-CO2浓度响应曲线通过设定不同CO2浓度对应的光合速率进行拟合，开始测量前，叶片同样暴露于1 200 μmol ·(m2 ·s)-1饱和光强下进行15~30 min光诱导，以使光系统Ⅱ充分开放，测量期间叶室光强、温湿度与瞬时值测定过程中保持一致.最大羧化速率(Vcmax)、最大电子传递速率(Jmax)根据Sharkey等[28]的方法拟合确定.
1.2.2 生物量测定2015年9月中旬，对所有实验幼苗进行收获，以原始扦插枝条分叉处以上1 cm为基准将实验幼苗分为地上、地下部分，对根际吸附的土壤颗粒进行小心清洗.植株各部分于80℃烘箱烘干至恒重，称量并计算植株生物量及地上部分与地下部分生物量比值.
1.3 数据处理及分析实验数据先用Excel 2010进行初步整理，然后运用JMP 10.0进行双因素方差分析检验O3和氮处理的主效应及其交互效应显著性.之后采用Tukey's HSD进行多重比较，进行不同处理之间的显著性结果分析.P≤0.05认为是处理间达到显著性差异.运用Sigmaplot 10.0绘制光合作用特性指标与O3和氮的关系图，图中不同字母表示差异显著(P≤0.05).其中O3、N、O3*N分别表示臭氧、氮沉降及其两者的交互作用对各指标影响的统计结果(P值).
2 结果与分析 2.1 臭氧浓度升高和氮沉降对气体交换参数的影响由图 1可知，无论8月还是9月的测量中，O3处理显著降低了青杨的净光合速率(P<0.001)，与对照相比，两个生长阶段NF40处理下的Pn分别降低了34.3%和40.9%.随着氮水平的升高，Pn呈现先升高后降低的趋势.两个生长阶段N50、N100时，Pn比N0分别升高了24.3%、7.9%(8月)和16.1%、14.2%(9月).而氮处理仅仅在8月起到显著性影响，9月的氮处理并未使Pn出现显著性差异(P=0.131).8月结果中，O3浓度升高至NF40时，N50比N0显著升高了46.3%.而9月只升高了21.9%.由方差分析可知，O3和氮对青杨的净光合速率在两次测量时期均未出现显著的交互作用(8月P=0.067、9月P=0.973).
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图中O3、N、O3*N分别表示臭氧、氮沉降及其两者的交互作用对各指标影响的统计结果(P值) 图 1 臭氧和氮沉降对青杨叶片气体交换参数的影响 Fig. 1 Effects of elevated O3 and nitrogen deposition on gas exchange parameters of the Populus cathayana leaves |
两个生长阶段下，不同O3和氮处理对Gs均没有显著性差异(图 1).但8月氮处理下青杨的Gs呈现上升趋势，而9月为下降趋势.ci随着O3浓度升高呈显著上升趋势(P<0.01)，与对照相比，两个生长阶段NF40处理下的ci分别升高了8.3%、9.0%.氮处理在9月才达到显著性差异(P=0.016)，N50与N100影响差异减少，均比N0降低了5%.由方差分析可知，O3和氮交互作用对Gs、ci均没有显著影响.对O3升高条件下青杨气孔损伤的修复作用不显著.
2.2 臭氧浓度升高和氮沉降对叶绿素a 荧光参数的影响由图 2可知，两个生长阶段下，O3处理显著降低了杨树的F′v/F′m、ETR和qP(P<0.01)，与对照相比，两个生长阶段NF40处理下分别降低了12.4%、27.2%和17.6%(8月)与19.6%、40.6%和25.5%(9月).而两个生长阶段中氮处理仅对F′v/F′m和ETR起到显著性差异，且ETR达到极显著水平(P=0.002).随着氮水平的升高，8月F′v/F′m和ETR均呈现先升高后降低的趋势，与对照相比，N50、N100分别升高了9.2%、2.8%和19.3%、5.6%.尽管与对照相比，两个生长阶段N50、N100下青杨叶片的qP分别升高了10.3%、2.5%(8月)和10.1%、11.5%(9月)，但氮处理对在8、9月两个生长时期均未出现显著作用(8月P=0.105、9月P=0.171).随着青杨的不断生长，两种氮处理的差异减小.由方差分析可知，O3和氮对青杨的F′v/F′m、ETR和qP均未出现显著的交互作用(P>0.05).
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图 2 O3和氮沉降对青杨叶片叶绿素a 荧光参数的影响 Fig. 2 Effects of elevated O3 and nitrogen deposition on chlorophyll a fluorescence parameters of the Populus cathayana leaves |
由图 3可知，9月不同O3和氮处理对最大羧化速率(Vcmax)和最大电子传递速率(Jmax)均产生显著性差异(P<0.001).与对照相比，NF40处理下的Vcmax、Jmax分别降低了32.4%、26.4%.随着氮水平的升高，Vcmax与Jmax呈现先升高后降低的趋势，N50处理最高，N50、N100比N0分别升高了36.5%、14.6%(Vcmax)与40.6%、20.9%(Jmax).O3和氮对青杨叶片的Vcmax、Jmax产生了显著的交互作用(P=0.013、P=0.017).O3浓度升高至NF40时，N50的Vcmax、Jmax比N0显著高83.3%和69.1%.
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图 3 O3和氮沉降对青杨叶片最大羧化速率与最大电子传递速率的影响 Fig. 3 Effects of elevated O3 and nitrogen deposition on the maximum carboxylation efficiency (Vcmax),the maximum electron transport (Jmax) of the Populus cathayana leaves |
由图 4可知，不同O3处理对总生物量产生显著性影响(P=0.009)，与对照相比，NF40处理下生物量显著降低了28.9%.虽然高浓度O3使青杨的根冠比升高了20.6%，但并未产生显著性差异(P=0.169).不同氮处理对总生物量和根冠比均未产生显著性差异(P=0.399、P=0.173).但随着氮水平的升高，总生物量增加，N50时最高，比N0升高了14.0%.提高氮水平降低青杨根冠比，N50较对照降低了根冠比15.6%.而氮水平继续升高到N100时，生物量和根冠比变化不大.O3和氮对青杨总生物量和根冠比无显著交互作用(P=0.679、P=0.845).
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图 4 O3和氮沉降对青杨总生物量与根冠比的影响 Fig. 4 Effects of elevated O3 and nitrogen deposition on the total biomass and the root shoot ratio of the Populus cathayana |
光合作用是绿色植物积累有机物的重要过程，是决定植物生物量积累的关键因子.本研究结果显示高浓度O3会降低光合能力，这与国内外大量研究结果一致，光合速率降低是植物对O3胁迫最普遍的响应之一[12, 13].从本研究光合特性指标的变化来看，随着O3浓度的升高，净光合速率(Pn)、电子传递速率(ETR)、PSⅡ反应中心激发能捕获效率(F′v/F′m)、光化学猝灭系数(qP)、最大羧化速率(Vcmax)和最大电子传递速率(Jmax)均显著降低，胞间CO2浓度(ci)显著升高，但气孔导度(Gs)变化不显著.推断O3对光合作用的负效应不是由气孔因素引起的，而是由非气孔因素主导，而气孔导度的下降仅仅是对植物O3胁迫下光合速率下降、胞间CO2浓度升高的一种响应[29, 30].一方面由于植物膜系统、光合器官的直接氧化损伤、叶绿素含量下降，另一方面电子传递、能量转化受阻、光系统Ⅱ受损，最终导致光能捕获能力和利用效率下降.本研究表明，在一定范围的氮沉降显著促进青杨光合作用，而当施氮量逐渐提高，促进作用有所减弱，这与前人对森林树种的研究一致[14].因为在一定范围内，氮沉降增加Rubisco的浓度和活性及叶绿素含量，同时也有利于保护性蛋白和抗氧化物质如抗坏血酸的合成，从而增加光合速率[31].而过量的氮沉降会对光合产生负效应，如本实验中与N50相比较，N100使光合作用有所下降.这可能是过量氮造成土壤酸化，植物体内营养失衡[32, 33].但氮对Pn的影响在8月显著而9月不显著，因为9月青杨开始进入衰老期，整体光合能力下降.但氮对ci的影响则是在8月不显著9月显著，与测定当天的光照、温度等气象条件息息相关.
本实验中，氮沉降虽然使得光合能力明显升高，但与O3两者的交互作用并不显著，说明它在缓解青杨的O3伤害上并未起到显著作用，这与Yamaguchi等[34]对山毛榉的研究结果一致.由于氮沉降增加使Rubisco的浓度和活性增加，减少O3对质膜的损伤，从而增加光合速率.而过量氮沉降引起的植物营养失衡在O3条件下更为加剧.O3会减少氮向可溶性蛋白的分配，而可溶性蛋白中的重要组分之一就是决定光合作用的Rubisco活性，这种分配的减少在高氮环境下更加明显[35].另外，CO2的同化、NO2-通过亚硝酸还原酶还原为NO3-、NH4+通过谷氨酰胺合成酶/谷氨酸合酶转化为氨基酸的过程均需要还原型铁氧还原蛋白(Fdred)[36].通常情况下，CO2的同化对Fdred的亲和力最高，当O3破坏光合组织特别是Rubisco的同时，过量的氮沉降有可能会进一步削弱碳同化对该物质的竞争能力，从而抵消氮的正效应，甚至对光合作用起到抑制作用[37].
植物生物量是反映植物生长和生产力的一个重要指标，会受到植物光合特性变化的影响.O3浓度升高的条件下，光合速率的下降引起同化物的减少，从而使植物生长受到影响，生物量降低.Yamaguchi等[38]利用OTCs研究表明，高浓度O3可以降低山毛榉Rubisco的浓度和活性、净光合速率，使得当年生分枝以及叶片的干重降低，最终减少有机物的累积，降低生物量.本研究中O3胁迫导致青杨幼苗生物量累积显著降低，这是由于光合能力下降，从而减少了有机物的积累.虽然O3对于根冠比未出现显著性影响，但仍有升高的趋势,表示O3对青杨地上部分生物量积累的抑制效应大于其对地下部分生物量积累的抑制效应.这是因为O3抑制叶片光合作用，加速叶片早衰，减少植物地上部分同化产物的积累，改变了同化产物的分配，从而造成植物地下部分与地上部分生物量比值升高.氮沉降量在一定范围内促进植物生物量的增加，但当氮继续增高到一定水平，如本实验氮处理从N50升至N100，氮已达到饱和，如前所述，甚至出现抑制作用，因而造成生物量不再随之升高.而根冠比也表现出一致性的变化，这与Persson等[39]和Grulke等[40]对森林植物的研究结果一致，该研究进一步证明了氮沉降促进地上部分生长，但对根系的生长不利.可能是由于改变了土壤的理化性质，而土壤的理化性质与根的生长和结构显著相关.
综上，本实验中氮沉降与O3对青杨并没有表现出明显的交互作用，而类似报道并不少见[27, 31, 40]，推测一方面或许是由于处理时间较短，另一方面可能的原因是本实验中青杨幼苗在氮沉降超过N50时，氮已达饱和，对氮响应不再增加.
考虑到实验处理控制、盆栽的根系限制、地理气象等因素，可能导致本实验所得结果与自然生境实际情况之间存在一定偏差，因此在全球变化的大背景下，利用田间试验，开展青杨O3胁迫敏感性的区域性研究显得十分必要.
4 结论(1) 随着O3浓度的升高，青杨幼苗叶片光合作用受阻，进而导致生物量累积下降，严重抑制了青杨的生长与生产力.
(2) 一定范围内的氮沉降对青杨光合作用以及生物量有正效应.但是，过量的氮沉降对光合作用不利，降低植物的生物量累积.
(3) O3与氮沉降并未对青杨的光合作用以及生物量产生显著性交互影响，可能与实验处理时间、测定气象条件、树种差异性有关.
(4) 本研究所得结果可为我国青杨O3敏感性评估提供基础数据和理论依据.
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