2016, Vol. 37
2. 煤矿灾害动力学与控制国家重点实验室, 重庆 400044
2. State Key Laboratory of Coal Mine Disaster Dynamics and Control, Chongqing University, Chongqing 400044, China
聚β羟基烷酸盐(PHA)是一种由微生物合成的热塑性聚酯的总称，由于其优良的热力学性质、 热塑性、 压电性、 可生物降解性，引起研究者广泛的关注. 活性污泥包含极其复杂的微生物群体，有研究发现，废水生物处理过程中活性污泥具有合成PHA现象，因此，利用活性污泥生产PHA可同时实现废水的处理和资源化[1]，食品加工业如糖蜜[2]、 淀粉[3]、 干酪乳清[4]、 啤酒厂废水和工业产生的废水如造纸废水[5, 6]、 木材厂废水[7]、 橄榄油废水[8]以及污泥[9]中富含易生物降解的有机物，可以作为合成PHA的基质.
随着生物柴油的广泛应用，其副产品粗甘油产量也快速增加，粗甘油资源化利用成为新问题[10]. 粗甘油中含有甘油62%～90%，由于粗甘油无需厌氧发酵可直接作为基质合成PHA，引起了学者广泛的兴趣，Moralejo-Gárate等[11]以甘油为基质富集合成PHA混培物，最大PHA含量达到67%. Moita等[12]以粗甘油作为基质合成PHA，其最大产量达到47%. 本研究以甘油作为基质采取“饱食-饥饿”模式筛选具有高贮存PHA能力的微生物，以多种物质作为单基质考察混培物对基质的广谱性以及合成PHA的性能.
目前，PHA测量主要采用离线化学分析方法，其操作步骤(离心、 冷冻干燥、 提取、 气相色谱分析)复杂，无法满足PHA生产过程中实时测量的需求，PHA的快速测量和优化成为研究热点. Kedia等[13]用介光谱来评估和确定发酵阶段PHA最佳收获时间，Elain等[14]用快速定量荧光技术方法快速有效地判断最佳培养条件，Porras等[15]用傅立叶红外光谱(FTIR)测定细胞内PHA的含量，红外光谱法应用可以确定PHA最佳收获时间以及测定PHA的含量，但灵敏度较低，仅适用于短链PHA测量. 本课题组前期以乙酸作为基质合成PHA时发现PHA合成速率与氧利用速率之间呈线性关系，并建立了一种基于OUR在线监测数据估计PHA含量的方法[16]. 但在实际PHA生产过程中，基质通常为多种挥发性脂肪酸(VFAs)的混合物，为了进一步验证该方法的可行性，本文以不同比例的乙酸/丙酸作为基质研究PHA合成情况，并用同时贮存与生长模型对OUR数据进行模拟来验证OUR与PHA之间存在线性关系.
1 材料与方法 1.1 甘油基混培物富集实验采用SBR系统富对活性污泥进行驯化，反应器有效体积4 L，运行周期24 h(进水12 min，曝气1 380 min，沉淀36 min，出水12 min)，水力停留时间(HRT)和污泥停留时间(SRT)控制在48 h. 反应器内温度控制在30℃，pH维持在7.0±0.1.
接种活性污泥取自重庆井口污水处理厂，实验用水采用人工合成废水，以甘油作为碳源，以氯化铵和磷酸二氢钾作为氮源和磷源，其成分包括：甘油 14.19g ·L-1, NH4Cl 3.61 g ·L-1, KH2PO43.39 g ·L-1, MgSO4 ·7H2O 1.37 g ·L-1, KCl 0.53 g ·L-1和微量元素15 mL ·L-1. 微量元素成分包括：ZnSO4 ·7H2O 0.33 g ·L-1，CaCl2 ·7H2O 0.083 g ·L-1，MnCl2 ·4H2O 0.076 g ·L-1，钼酸铵 0.017 g ·L-1，CuSO4 ·5H2O 0.024 g ·L-1，CoCl2 ·6H2O 0.024 g ·L-1，EDTA 0.75 g ·L-1，FeSO4 ·7H2O 0.075 g ·L-1.
1.2 混培物合成PHA取SBR周期运行结束后的活性污泥，用微量元素液淘洗污泥3次，将其加入混合呼吸仪的曝气室中，当污泥处于内源呼吸状态，脉冲投加200 mg ·L-1甘油、 葡萄糖、 乳酸、 乙酸、 丙酸、 丁酸以及不同比例乙酸/丙酸(1 ∶1、 3 ∶1、 1 ∶3) 考察PHA合成情况. 反应器温度控制在20℃.
1.3 分析与测试方法COD测量采用快速消解法，NH4+-N采用纳氏试剂分光光度法，PHA采用气相色谱法[17].
在甘油、 葡萄糖、 乳酸钠、 乙酸钠、 丙酸钠、 丁酸钠单基质以及不同比例乙酸/丙酸(1 ∶1、 3 ∶1、 1 ∶3) 混合基质合成PHA的实验中，利用实验室自主开发的混合呼吸测量仪在线测量OUR数据[15]，同时取样测量不同时刻COD和PHA.
2 结果与讨论 2.1 甘油基混合培养物本实验采用的富集反应器以甘油作为基质在“饱食-饥饿(feast and famine)”模式下驯化微生物，在线DO测量来表征饱食期的长度，DO突然上升表明饱食期的结束. 经过60 d的驯化，反应器中微生物的饱食期维持在1.5 h左右. 以饱食期与饥饿期长度之比(F1/F2)来评价富集反应器微生物的富集效果[18, 19]，结果显示较低的F1/F2(≤0.28) 有利于PHA贮存菌与非贮存菌的竞争，从而获得较高贮存能力的混培物. DO在线测量技术成熟、 操作维护费用低，在混培物好氧合成PHA过程测量于控制方面具有巨大潜力.
图 1为反应器运行60 d后一个周期内COD、 NH4+-N、 PHA的变化，投加基质后，COD快速下降，PHA快速上升，在1.5 h后基质降解完毕，PHA产量达到最大373.7 mg ·L-1，最大PHA含量达到21.8%. 目前研究报道甘油作为基质合成PHA时基质转化率(PHA/甘油)为0.08～0.37 g ·g-1[11]，本实验甘油的转化率达到0.22 g ·g-1，与文献[11]报道具有可比性. 图 2为一个周期内批式反应器中COD与PHA的变化，在限营养(限N)条件下投加过量甘油(20 g)后PHA最大含量达到52.5%.
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图 1 富集反应器一周期内COD、 NH4+-N、 PHA内变化 Fig. 1 COD, NH4+-N, PHA profiles during a steady operational cycle in enrichment reactor |
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图 2 批式反应器一周期内COD、 PHA内变化 Fig. 2 COD and PHA profiles during a steady operational cycle in batch reactor |
目前，乙酸、 丙酸、 丁酸为合成PHA最常见的挥发性脂肪酸，乳酸是获得PHA产量最高的基质(最大PHA含量达到90%)[20]，葡萄糖广泛应用于工业纯培养合成PHA，本文基于甘油富集高性能的PHA合成混培物研究对上述基质合成PHA的情况. 表 1对比分析了投加200 mg ·L-1甘油、 葡萄糖、 乳酸、 丁酸、 乙酸、 丙酸时PHA的合成情况，实验结果表明，基于甘油富集得到的PHA合成细菌能够利用上述多种基质合成PHA，对基质的利用具有广谱性. 甘油、 葡萄糖作为基质合成PHA时产生PHA和多聚葡萄糖(PG)两种聚体，乙酸、 丁酸、 乳 酸合成PHA时只产生PHB聚体，丙酸合成PHA时产生PHB和PHV两种聚体. 甘油、 葡萄糖和乳酸基质消耗所需的时间最短，但甘油和葡萄糖作为基质时PHA的产率系数较低，其原因可能是两种基质在呼吸实验过程中基质加入后DO下降到较低水平，DO浓度较低时有利于PG合成[19]，使得PHA相对含量下降，导致PHA的产量较低； Moralejo-Gárate等[21]研究了DO对PHA合成过程的影响，结果表明DO浓度不仅影响聚体的积累，而且影响PHA与PG的相对含量，高DO浓度下甘油优先用于PHA贮存，低DO浓度下甘油优先用于细胞生长. 乳酸和乙酸作为基质合成PHA时产率较高，分别达到0.60和0.56，这一结果与目前研究结果相一致，Jiang等[20]、 Johnson等[22]应用乳酸、 乙酸合成PHA时，PHA最大含量达到90%、 89%，产量接近于纯培养合成PHA的水平； 乙酸、 丙酸、 丁酸作为基质合成PHA时，基质消耗所需的时间较长，可能由于微生物利用基质时比基质吸收速率较小.
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表 1 不同基质合成PHA对比分析 Table 1 Comparative analysis of PHA synthesis using different substrates |
2.3 混培物利用乙酸/丙酸混合基质合成PHA的特征
甘油作为基质富集的混培物对基质的利用具有广谱性，乙酸和乳酸作为基质时合成PHA时，PHA的产量较高，但是乙酸与乳酸合成PHA时均只产生PHB聚体，而PHB聚体脆性高、 延展性差，在实际应用中受到很大制约，PHB与PHV的共聚物(HB-co-HV)极大地改善其机械性能. 本文以乙酸与丙酸混合物作为基质研究不同乙酸/丙酸下PHA合成情况. 向反应器内投加不同比例的混合基质后，OUR、 COD、 PHA变化如图 3所示，在不同混合比例下，OUR、 COD、 PHA变化基本一致：饱食期内，投加基质后，OUR快速上升达到最大值并保持一段时间，COD不断消耗且PHA含量不断增加； 饥饿期内，基质消耗完毕，COD下降到最低水平，OUR和PHA开始下降并趋于稳定，活性污泥进入内源呼吸期. 投加不同比例的乙酸/丙酸合成PHA时，PHA组成主要包括PHB和PHV两种聚体，无PH2MV产生. 在乙酸/丙酸为3 ∶1时，PHA合成量最高，达到105.94 mg ·L-1，其中乙酸/丙酸为1 ∶1和3 ∶1时，PHB的产量显著高于PHV的产量. 实验表明，随着混合基质中乙酸含量的增加，PHA的最大合成量也相应增加，PHA产率也相应增加，这是由于微生物利用混合基质时，乙酸的吸收速率显著高于丙酸的吸收速率，Jiang等[23]认为丙酸为基质时，微生物较低的基质吸收速率和较高的生长速率导致PHA产率较低.
基于活性污泥同时贮存与生长模型[24]对3种比例下模拟结果显示，乙酸/丙酸为1 ∶3时，直接生长过程氧气的消耗速率高于贮存过程，导致PHA产量较低，这与实验结果相一致. 因此，乙酸与丙酸混合物作为基质合成PHA时，乙酸/丙酸为3 ∶1有利于获得较高产量的PHA.
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图 3 乙酸/丙酸为1 ∶1、 3 ∶1以及1 ∶3时 OUR、 COD、 PHA、 PHB、 PHV随时间变化 Fig. 3 OUR, COD, PHA, PHB and PHV profiles for three different acetate/propionate ratios |
根据活性污泥同时贮存与生长模型，在外部基质充足的情况下，活性污泥对外部基质按照一定比例进行贮存和生长，课题组前期用乙酸作为基质合成PHA过程中发现OUR与PHA存在线性关系，并 建立了氧气消耗量与PHA合成量之间的线性方程[16]. 本研究对3种不同比例混合基质同时贮存生长过程OUR模拟结果进行模拟，模拟结果显示乙酸/丙酸为1 ∶1、 3 ∶1和1 ∶3时(表 2)，贮存耗氧速率与总耗氧速率的比值为常数，三者的均值分别为0.552、 0.526和0.451.因此，在基质充足的情况下，不同比例的乙酸/丙酸合成PHA时，OUR与PHA存在线性关系.
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表 2 3种乙酸/丙酸比例下同时贮存与生长过程OUR模拟结果 Table 2 Model calibration for OUR under three different acetate/propionate ratios |
为进一步验证线性关系的存在，本文采取线性回归方法分析了PHA与氧气消耗量之间的关系，结果如图 4所示，乙酸/丙酸为1 ∶1、 3 ∶1和1 ∶3时，耗氧量与PHA线性关系良好，R2均大于9.5，根据已建立的线性关系[16]计算，贮存耗氧速率与总耗氧速率比值分别为0.558、 0.520和0.443，与模型模拟值相比较，相对误差分别为1.1%、 1.2%和1.8%. 线性回归结果与模型模拟结果显示在不同比例下，OUR与PHA合成量线性关系成立.
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图 4 乙酸/丙酸为1 ∶1、 3 ∶1以及1 ∶3时 OUR与PHA线性拟合关系 Fig. 4 Liner relationship between OUR and PHA under three different acetate/propionate ratios |
目前，在PHA生产过程中均采用实时监测DO(DO突然跃增)来指示基质降解完毕[25]，Serafim等[26]对比了乙酸作为基质合成PHA时DO和OUR在饱食期与饥饿期响应，两者对于基质变化响应相一致(饱食期内，投加基质后，DO快速下降，OUR快速上升； 饥饿期内，基质消耗完毕，DO快速上升，OUR快速下降)，而在线OUR数据不仅可以指示饱食期的结束(基质降解完毕，PHA值达到最大值时刻). 本文的研究结果证明，采用混培物合成PHA，即使是在乙酸/丙酸混合基质下也可以基于OUR与PHA之间的线性关系通过在线OUR测量数据估计实时PHA合成量.
3 结论(1) 采用甘油作为基质富集的PHA合成混培物对基质利用具有广谱性，能够利用乙酸、 丙酸、 丁酸、 乳酸、 葡萄糖合成PHA，乳酸和乙酸的产量较高.
(2) 投加不同比例的乙酸/丙酸合成PHA时，PHA组成主要包括PHB和PHV两种聚体，无PH2MV产生. 随着混合基质中乙酸含量的增加，PHA的最大合成量也相应增加，PHA产率也相应增加，乙酸/丙酸为3 ∶1时，PHA合成量最大.
(3) 采用乙酸/丙酸混合基质时，甘油基PHA合成混培物的OUR与PHA速率间存在线性关系，因此，可以基于在线OUR测量数据估计实时PHA合成量.
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