2016, Vol. 37
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 华侨大学化工学院, 厦门 361000
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. College of Chemical Engineering, Huaqiao University, Xiamen 361000, China
地下水是水资源的重要组成部分，是地球上最丰富且分布最广泛的淡水资源，对于人类的生产生活、社会经济发展具有重要的意义，也是生态环境中非常重要的生态系统类型.近年来，随着经济社会的快速发展，人类对地下水生态系统的过度干扰导致部分区域地下水水质恶化、形态结构破坏、水文条件变化、生境退化以及重要或敏感生物消失，许多地方的地下水生态系统健康严重受损，甚至引发灾难性的后果[1, 2].地下水生态系统健康状况已经成为许多国家和地区重点关注的环境问题之一.然而，迄今为止国内外鲜见开展地下水生态系统健康的研究报道.因此开展地下水生态系统健康评价体系的研究，选取有效的指标和科学的方法，对地下水生态系统的健康状况进行准确诊断，进而开展可持续利用与管理，对于促进地下水生态系统健康发展具有重大意义.
目前，国内外有很多关于水体生态系统健康评价的研究，采用的评价指标和方法繁杂多样.其中，生物完整性指数(index of biotic integrity，IBI)是目前水体生态系统健康评价中应用最广泛的指标之一.IBI评价法是由多个生物状况参数组成的，主要从生物类群的组成和结构来反映生态系统的健康状况，定量描述生物特性与非生物因子的关系，建立对环境干扰最敏感的生物参数，通过比较参数值与参考系统的标准值对生态系统健康水平进行评价[3~5].最早，Karr[4]提出IBI指数并以鱼类为研究对象构建评价标准(fish-index of biotic integrity，F-IBI)，应用于美国河流生态系统的健康评价中.随后，研究者们根据不同水体状况，逐渐将研究对象扩展延伸到大型底栖无脊椎动物、藻类、水生植物和浮游生物等.美国环保署(EPA)利用底栖无脊椎动物完整性指数(benthic index of biotic integrity，B-IBI)评价了美国16个州的河流健康状况[5, 6].有研究利用硅藻生态特征以及对不同压力和干扰的响应参数[7]，构建IBI评价体系，比较了当地Hungary河流生态系统健康状况随季节的变化特征.Kane等[8]发展了浮游生物完整性指数(planktonic index of biotic integrity，P-IBI)评价美国Erie湖在1970~2002年内的健康状况变化.我国对IBI的研究始于1990年，王备新等[9]以安徽黄山地区的溪流为研究对象，首次在我国构建B-IBI评价指标并对其与理化指标的关系进行研究.卢东琪等[10]推广B-IBI评价方法应用到钦江流域河流的健康评价.IBI 自提出至今，经过研究者们近30年的应用、验证和改进，现已广泛应用于水体(主要是地表水体)的生态系统健康评价中[11, 12].
完整的水生态系统生物群落由生产者、消费者和分解者共同构成，但是已有的研究中，构建B-IBI评价指数的生物主要集中于水体生态系统的生产者和消费者部分，忽略了分解者.水体生态系统中的分解者，主要是微生物，是水体自我净化的基础.微生物群落特性与水生态环境具有高度相关性，微生物的变化比水文地球化学指标的变化更为敏感，其结构特征和功能状态可以反映水体生态系统对污染输入胁迫的恢复力.目前，随着水体污染日益严重，生产者和消费者的丰度及多样性日益减少，数据可获得性难度增加，以这些生物作为生态系统表征指数，经常无法为生态系统健康评估提供足够的信息[13]. 而在受污染水体生态系统中，微生物作为分解者，其功能活性极其活跃，群落结构多样性很高.因此，以分解者——微生物群落作为主要对象构建IBI(microbe index of biotic integrity，M-IBI)指数体系用于评估水体生态系统健康是一个值得关注的重要研究方向.目前，黄艺等[13]已成功构建浮游细菌生物完整性指数(bacterioplankton index of biotic integrity，BP-IBI)并用于滇池流域河流生态健康的评价.这表明微生物群落生物完整性指数具有成为水体生态系统健康状况有效评价指标的潜在可能性.
地下水生态系统中由于大型生物丰度低，生物信息匮乏，数据获取困难，现阶段国内外还很少将 IBI 应用于地下水生态系统健康评估的研究，有关微生物生物完整性指数(M-IBI) 的研究更是鲜见.因此，如果可以将M-IBI引入评价地下水生态系统健康状况必将进一步补充和完善地下水健康评价体系.包钢稀土尾矿库周边地下水生态系统由于受到尾矿库污染物泄漏、污染物地表径流、降水等原因而遭到不同程度损害，目前关于尾矿库周边地下水生态系统健康评估的研究工作还未开展[14].本文以包钢稀土尾矿库周边地下水为研究对象，尝试构建地下水中的M-IBI，并应用于尾矿库周边地下水生态系统的健康分级与评价，探讨基于微生物生物完整性指数在地下水生态系统健康评价中应用的科学性和可行性，以期为地下水生态系统健康分级评价提供新的科学依据，也为该区域地下水资源的可持续利用和管理提供支撑.
1 材料与方法 1.1 研究区采样位点设置包钢稀土金属冶选尾矿库(109°40′06.41″E~109°42′23.45″E，40°37′15.66″N~40°39′10.55″N)位于内蒙古自治区包头市西南部3 km处，总面积大约12 km2.尾矿库位于哈德门沟和昆都仑河冲洪积扇前缘交汇处，地势北高南低，平均坡降约4‰.2013年7~8月对尾矿库周边地下水进行监测井的布设，共设置12个位点.选择远离尾矿库、无点源污染、受人为活动影响小、污染小的地下水样点作为参照点(G10、G111、G12)，选择人为活动明显、靠近尾矿库、可能有点源污染的其余9个样点为受损点(G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G9).样点的分布如图 1所示.
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图 1 包钢稀土尾矿库周边地下水样点示意 Fig. 1 Sampling map of groundwater of Baogang rare earth tailings analyzed in this study |
使用QJ不锈钢潜水泵(朝隆，上海)采集地下水样品，每个样品收集2 L.使用便携式pH/电导率/溶氧仪(alalis MP3500，MP3500，美国)现场测定地下水水质酸碱度(pH)、温度(T)、溶解氧(DO)、电导率(Ec)、氧化还原电位(Eh).其中1 L密封装于塑料瓶，低温带回实验室进行理化指标分析，包括溶解性总固体(TDS)、总硬度(GH)、高锰酸盐指数(PI)、氨氮(NH4+)、硝态氮(NO3-)、亚硝态氮(NO2-)、硫酸根(SO42-)、碳酸根(CO32-)、氟(F-)、氯(Cl-)、钠(Na+)、钾(K+)、镁(Mg2+)、钙(Ca2+)、砷(As)、硒(Se)等离子.另外1 L装于已灭菌处理的采样瓶中，置于冰盒运回实验室，立即进行微生物群落的收集处理.每个样品取500 mL水样经过0.22 μm的微孔滤膜进行抽滤，将抽滤后的膜保存于-20℃冰箱备用.
1.3 地下水微生物核酸信息的获取将冷冻保存的0.22 μm滤膜采用灭菌剪刀剪碎(约1 mm2)转移至DNA提取的破碎管中，DNA提取步骤参照FastDNA Spin Kit for Soil(MP医疗，美国)试剂盒说明书进行.得到的DNA样品采用带有barcode序列的引物对(515F和907R)对16S r RNA基因V4~V5区片段进行PCR扩增，扩增体系是包括40~50 ng模板DNA，25 μL的2×Premix ExTaqTM聚合酶(Takara，Japan)，0.5 μL牛血清蛋白(BSA) (20 mg ·mL-1，Takara，日本)以及10 μmol ·L-1引物各1 μL，用无菌水补充至50 μL.扩增条件是95℃预变性3 min，随后94℃变性30 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸5 min.
扩增得到的PCR产物采用通用DNA纯化试剂盒(天根，中国)进行纯化回收.所得纯化的DNA样品采用Quant-iT PicoGreen double-stranded DNA (dsDNA)试剂盒(Invitrogen，美国)进行定量，具体步骤参考试剂盒说明书进行.
纯化的PCR扩增产物等份合并后，送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司进行测序.测序采用双末端测序，测序平台采用Illumina MiSeq PE300高通量测序平台.
1.4 微生物群落信息的分析总的测序reads通过不同的barcode序列区分并分配到相应的样品中，采用QIIME软件包去除所得序列中包含模糊碱基的，引物错配的或者多于6个碱基同聚物的序列，并过滤掉含有>20 bp低质量碱基的低质量序列，随后去掉引物序列.采用RDP classifier的方法生成OTU table(cutoff=97%)，去除嵌合体序列和单一序列.选择每个OTU中丰度最大的序列为代表性序列，将代表性序列与Greengene database进行比对分类.
为使样品间的序列数标准化，随机从每个样品中挑选最小数目19221条序列，利用QIIME进行稀有化分析并计算α-多样性指数(Chao-1指数、Shannon指数、Simpson指数、物种累计数、偏Simpson指数、Observed species、均匀度指数以及PD_whole_tree进化多样性等).基于各样点的微生物相对丰度信息，建立本研究所需的微生物IBI评价体系.
1.5 M-IBI评价体系的构建参考现阶段F-IBI、B-IBI、P-IBI和BP-IBI的指数构建流程，初步确定其主要步骤包括：①确定候选生物参数； ②通过参数指标值的分布范围、判别能力分析和相关关系分析，建立评价指标体系； ③确定每种生物参数值及IBI指数的计算方法； ④确定微生物生物完整性指数的评分标准； ⑤通过独立数据的比较，对IBI进行验证与修订，判别IBI指数方法的有效性.
1.5.1 候选生物参数的确定本研究选取与丰富度相关的参数、与群落组成相关的参数和与对干扰耐受能力有限的参数作为计算生物完整性指数的候选参数.干扰耐受参数与栖境参数的计算参照文献所述的具体方法[10].首先应用典范对应分析(canonical correspondence analysis，CCA)筛选关键环境因子，然后利用加权平均回归方法计算各分类单元的最适值.其具体运算方法与公式参照文献[13]，即可确定对各关键环境因子敏感或耐受的分类单元，并按照各样点环境因子的25%与75%百分位数为分界点.根据微生物对环境因子的最适值不同，将其划分为对环境干扰的敏感种、中间种或耐受种.
1.5.2 生物参数的筛选候选生物参数确定后，要对参数进行分布范围分析，判别能力分析、相关性分析和变异度分析，筛选或淘汰不能充分反映地下水生态系统受损情况的参数.
(1) 指数值分布范围分析
根据参照点和受损点的数据计算各候选生物参数值，分析候选生物参数对人类干扰的反应，挑选出对人类干扰反应单向递增或递减的指标； 剔除掉分布范围太大或太小的指数.
(2) 判别能力分析
对剩余参数在参照点和受损点的分布做箱体图，比较各指数在参照点和受损点的25%~75%分位数范围即箱体四分位范围(IQ).根据箱体的重叠情况，对IQ(生物判别能力)赋予不同的值，如无重叠，IQ=3； 部分重叠，但各自中位数值都在对方箱体范围之外，IQ=2； 仅一个中位数值在对方箱体范围之内，IQ=1； 各自中位数值都在对方箱体范围之内，IQ=0.
(3) 相关性分析
经过上述判别能力分析后，选取IQ 述判别的指数用SPSS 22.0作Pearson相关性分析，若两参数相关性较高(∣R∣≥ 0.75)，表明二者所反映的信息重叠性较大，选择其中之一参数用于构建M-IBI评价体系.
1.5.3 M-IBI评价体系标准的确定采用比值法计算各样点各生物参数分值，累加各个参数分值得到各样点的M-IBI指数值.具体步骤参照文献：①对于随干扰增大而数值越低的生物参数，以95%分位数为最佳期望值，参数分值为：该生物参数值/95%分位数； ②对于随干扰增大而数值越低的生物参数，以5%分位数为最佳期望值，参数分值为：(最大参数值－该生物参数值)/(最大参数值－5%分位数).经计算后，得到的分值的分布范围为0~1，如果＞1，则都记为1.
1.5.4 生物完整性的等级划分以参照点M-IBI值分布的95%分位数作为健康评价标准的最佳值，低于该值的分布范围进行5等分，靠近95%分位数的一等分代表被测样点处于健康状态，随后依次是亚健康、一般、较差和极差的划分标准.
2 结果与分析 2.1 关键环境因子的确定研究区各样点微生物信息通过高通量测序分析共获得729 827条序列，各样点微生物多样性指数以及物种丰富度分析结果见表 1，各样点之间存在一定的差异.矿库周边地下水理化因子检测结果和综合水质情况如表 2所示，参照点和受损点的水质等级差异很大.CCA分析了与微生物群落结构变化显著相关的环境因子见图 2.图中第一轴解释了38.1%的微生物分布，第二轴解释了21.9%比例的微生物分布.此外，蒙特卡罗(Monte Carlo)置换检验表明硒含量与微生物群落分布具有极显著相关关系(P=0.008＜0.01).有研究报道地下水环境中温度和氧气的变化对微生物群落扰动比较大，也是影响微生物分布的主要因子[15, 16].在一定程度上温度的增加使水体中溶解氧的含量增加，地下水环境中厌氧或者缺氧的微生物对氧气极其敏感，相应地也受到温度干扰.高锰酸盐指数可以用于部分表征水体环境中有机物含量，与水体环境中微生物的活性极为密切[15].综合考虑，本研究最终确定溶解氧(DO)、温度(T)、高锰酸盐指数(PI)和硒含量(Se)这4个环境因子作为关键环境因子，它们在参照点和受损点中的分布见表 3.
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表 1 各样点微生物多样性指数及物种丰富度 Table 1 Diversity indexes and abundance of microbial community in the studied groundwater |
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表 2 包钢稀土尾矿库周边地下水理化特征/mg ·L-1 Table 2 Geochemical characteristics of groundwater around Baogang rare earth tailings/mg ·L-1 |
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箭头与轴的角度代表环境因子的正负相关性，箭头长度代表相关性大小 图 2 微生物群落分布变化与环境因子相关的CCA分析 Fig. 2 Canonical correspondence analysis (CCA) of microbial community distribution variation and environmental factors |
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表 3 关键环境因子在受损点和参照点中的分布 Table 3 Distribution of major environmental factors in the damaged sites and references sites |
2.2 关键环境因子敏感属和耐受属的确定
根据由加权平均回归分析得到微生物分类属的关键环境因子的最适值，对微生物分类属分别归类敏感属和耐受属.各类群在不同地下水样点的分布存在较大的差异，具体情况如表 4所示.
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表 4 对环境因子敏感和耐受的微生物分类属个数汇总 Table 4 Summary of microbial taxonomic genera which were sensitive or tolerant to the major environmental factors |
2.3 候选生物参数的筛选
本研究选用可以反映地下水微生物群落丰富度、种类个体数量比例以及生物耐污能力的指数，反映环境变化对生态系统结构和功能的影响，最终确定了26种地下水微生物的生物完整性指数(M-IBI)的候选生物参数(表 5).
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表 5 地下水微生物生物完整性指数的候选生物参数 Table 5 Candidate biotic indexes for M-IBI in the groundwater |
2.4 判别能力分析与相关分析
通过对候选参数进行判别能力分析，获得可以参与计算M-IBI的4个生物参数：M13(Methyloversatilis属相对丰度)； M20(高温敏感属相对丰度)； M25(Pseudidiomarina属相对丰度)； M26(Thiobacillus属相对丰度)(图 3).对4个参数进行Pearson相关性分析结果表明，M13和 M25具有显著相关(P＜0.05)，但是r=0.67＜0.75，所以将这4个参数用于M-IBI评价体系标准指数值的计算(表 6).
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表 6 4个生物指数Pearson相关性分析 Table 6 Pearson correlation analysis for the four biotic indexes |
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图 3 4个生物指数在参照点和受损点判别能力分析 Fig. 3 Discriminatory power analysis of the four biotic indexes in the damaged sites and references sites |
基于比值法计算各样点的M-IBI值，所用比值法的计算公式见表 7.
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表 7 比值法计算公式 Table 7 Formula for calculating the scores based on the ratio method |
将4个生物参数按表 7计算所得的值相加，即得到M-IBI指数值.用95%分位数值(3.25)作为健康标准，进行5等分后，依次划分为不同的健康等级(表 8).
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表 8 研究区基于M-IBI指数的地下水生态系统健康评价标准 Table 8 Groundwater ecosystem health assessment criteria based on M-IBI index |
根据尾矿库周边地下水M-IBI指数健康评价标准，对尾矿库周边地下水12个样点进行基于微生物生物完整性指数的生态系统健康水平评价.结果表明，在稀土金属尾矿库周边地下水的样点中，4个样点处于健康水平，占总样点的33.3%； 2个位点处于亚健康水平，占总样点的16.7%； 5个位点是一般健康水平，占41.7%； 1个位点是较差健康水平，占8.3%(表 9).
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表 9 基于M-IBI指数的研究区地下水生态系统健康评价 Table 9 Assessment of groundwater ecosystem health by M-IBI method in study area |
3 讨论 3.1 M-IBI参照点选择的合理性
在IBI评价体系构建中，参照点的选择对最终评价结果具有很大影响.目前国内外没有统一的选择标准，受自然和人类活动干扰的影响，已经很难找到所谓绝对健康的生态系统.在实际研究中，研究者们一般依据理化参数、生境以及土地利用状况等多因素来制定参照点的选择标准，再根据定性标准划分参照点和受损点，即健康的参照点只是相对的[17, 18].本研究依据前期地下水理化性质分析结果，结合考虑距尾矿库远近和周边环境，选择地下水理化指标接近国家地下水二级标准、生物多样性丰富、远离尾矿库、周边无居民或农业耕作等人类干扰活动较少的位点作为参照点.此外，参照点数目的多少与评价结果的准确定性也有很大关系.一般认为，参照点数越多，就越能减少因自然条件改变引起的微生物群落结构和功能的变化对评价标准的影响，提高M-IBI指数的敏感性[19, 20].地下水环境没有完全暴露到外界环境中，通过地表径流或者渗滤等的作用而受外界环境的干扰.与河流湖泊等地上水体环境相比，地下水环境受到外界干扰产生响应的速度相对较慢，特别是北方地区埋藏较深，所维持的环境可能相对稳定[2, 14].人类活动干扰较少的位点其自身的微生物群落或相对稳定，可以在一定程度上反映该区域自然的微生物分布状况.此外，限于地下水采样工作实际操作的复杂性及财物资源有限，生物样品采集难度大，本研究设置了3个样点为参照点.本研究结果显示，微生物生物完整性指数评价结果较好地反映了尾矿库周边地下水生态系统的健康状况，说明本文参照点的选择标准合理、适用.
3.2 基于M-IBI指数评价尾矿库地下水生态系统健康的可行性目前关于微生物生物完整性指数的应用研究屈指可数，但随着现代分子生物学技术的突飞猛进，获取关于环境微生物更多和更完整的信息变得越来越便捷和快速，这使得在生态系统健康评估中发展基于微生物的M-IBI指数成为可能.黄艺等[13]采用限制性片段长度多态性的方法计算浮游细菌丰富度参数，并将其应用于建立基于浮游细菌生物完整性指数评价方法，成功用于评价滇池流域河流生态系统的健康状况.本研究采用新一代的Illumina高通量测序技术来获取更全面的地下水微生物群落信息(可包括数目极少的细菌和古菌)，分析了微生物类群丰富度与多样性等参数，并利用相关参数用于建立M-IBI评价标准.本研究评价结果基本符合尾矿库周边地下水受人类活动干扰的状况：样点靠近尾矿库污染源，受人类活动干扰比较大，健康状况比较差，处于亚健康、一般或者更低(较差)的水平； 参照点远离尾矿库，污染源难以扩散渗透至参照点，受周围人类活动干扰较小，该区域的地下水生态系统受到破坏较小，处于健康水平.G7样点靠近尾矿库边缘，但评价结果显示G7地下水生态系统处于健康水平，这可能与该样点区域小环境的水文地质条件有关.水质是反映地下水生态系统状况的重要因子，参考了欧盟水质5级分类标准[21]，将包钢稀土尾矿库周边地下水水质级别分为健康、亚健康、一般、较差、极差等5级.M-IBI指数评价结果较好地区分了不同样点的水质优劣情况，表明利用M-IBI指数可以反映地下水生态系统的状况.综合来看，微生物生物完整性指数(M-IBI)可以用于地下水生态系统健康状况的评价.
3.3 M-IBI指数评价地下水生态系统健康的不确定性国内外对 M-IBI 的应用刚刚起步，对于微生物完整性指数的研究非常少，可参考的文献资料严重不足.本研究探讨将微生物完整性指数引入地下水生态系统健康评价，从过程到结果很可能存在较多的不确定性.
首先，评价标准的划分是生物完整性指数评价中的关键，目前还不存在一个统一的划分标准. 在多种生物学指标评分方法中，3分制法、4分制法和比值法是较为常见的方法[3, 22, 23].利用底栖动物评价水体生态系统多采用3分制法和4分制法.本研究采用比值法来计算M-IBI指数，并且发现与25%分位数为评价标准相比，以95%分位数为评价标准的评分标准更能准确反映研究区域的污染或健康状况，这种方法也被国外多位学者在研究中采用[5, 20].其次，本研究采用来自包钢尾矿区12个样点的地下水数据较好地开展了M-IBI指数构建与评价研究，但是由于样点数量有限，可能会对评估的准确性有一定的影响.此外，目前为止还没有比较完整的候选微生物指标数据库供研究者自由选择，生物参数的优化研究还有较大发展空间.
总体而言，本研究中M-IBI指数可较真实地反映出被评价系统的生态环境质量状况，证明了其可以成为评价地下水生态系统健康状况的潜在、有效工具之一，但亟待针对各种不确定因素开展探索性研究，以完善M-IBI指数在地下水环境中的应用，这将是未来一个重要研究方向.
3.4 构建M-IBI指数评价地下水生态系统健康体系利用M-IBI指数评价地下水生态系统健康是一项具有挑战性的创新工作，也是一项系统性工作.本研究在包钢稀土尾矿库周边地下水生态系统应用M-IBI指数开展评估工作证明了该体系的适用性，促进了IBI评价系统的延伸与发展.但当前缺乏基础数据的积累，类似的应用与验证研究过少，急需加强对地下水环境微生物生物完整性指数评价的深入研究.
本文依据地下水生态系统健康的内涵，结合案例研究工作的经验提出微生物生物完整性指数评估地下水生态系统健康体系的构建流程(图 4).由于受现行研究资料所限，指标的选取和评价等级的划分可能还不够成熟和合理，该指数体系会随该领域以及相关领域研究的深入和扩大而得到不断地补充和完善.在实际的评价过程中，由于地下水生态系统的复杂性，评价指数的具体构建方法应根据研究区的具体情况进行调整，以对个案中地下水生态系统健康有客观的分析和评价.
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图 4 M-IBI指数评价地下水生态系统健康体系构建流程 Fig. 4 Developing process of the microbiome index of biotic integrity |
通过生物参数分布范围、相关性分析和判别能力分析，得出尾矿库周边地下水基于M-IBI的评价指标包括Methyloversatilis属相对丰度； 高温敏感属相对丰度； Pseudidiomarina属相对丰度；Thiobacillus属相对丰度这4个指标.根据参照点M-IBI的95%分位数作为健康评价标准，确定M-IBI的评价等级：2.6＜M-IBI≤3.25为健康水平，1.95＜M-IBI≤2.6为亚健康水平，1.3＜M-IBI≤1.95为一般水平，0.65＜M-IBI≤1.3为较差水平，M-IBI≤0.65为极差水平.基于M-IBI的健康评价标准，对尾矿库周边地下水生态系统健康进行评价，受损点靠近尾矿库污染源，受人类活动干扰比较大，健康状况比较差，处于亚健康、一般或者更低(较差)的水平； 参照点远离尾矿库，受周围人类活动干扰较小，该区域的地下水生态系统受到破坏较小，处于健康水平.结合该地区理化参数基础上的水质情况分析，发现微生物生物完整性指数(M-IBI)可以较合理地评价地下水生态系统健康状况.本研究依据地下水生态系统健康的内涵，初步提出针对地下水生态系统健康的M-IBI指数体系构建流程，可在未来的研究不断补充完善.
致谢: 感谢中国科学院南京土壤研究所、 内蒙古科技大学、 包头市环保监测站及包头钢铁股份有限公司协助采集地下水样品| [1] | 杨彦, 于云江, 王宗庆, 等. 区域地下水污染风险评价方法研究[J]. 环境科学 , 2013, 34 (2) : 653–661. |
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