环境科学  2016, Vol. 37 Issue (8): 3229-3236   PDF    
引用本文
吕玉, 周龙, 龙光强, 汤利 . 不同氮水平下间作对玉米土壤硝化势和氨氧化微生物数量的影响[J]. 环境科学,2016, 37(8): 3229-3236.
LÜ Yu, ZHOU Long, LONG Guang-qiang, TANG Li . Effect of Different Nitrogen Rates on the Nitrification Potential and Abundance of Ammonia-oxidizer in Intercropping Maize Soils[J]. Environmental Science,2016, 37(8): 3229-3236.
不同氮水平下间作对玉米土壤硝化势和氨氧化微生物数量的影响
吕玉 , 周龙 , 龙光强 , 汤利     
云南农业大学资源与环境学院, 昆明 650201
收稿日期: 2016-01-30; 修订日期: 2016-03-22
基金项目: 国家自然科学基金项目（41361065，41201289）；云南省科技计划重点项目（2015FA022）；云南省高校科技创新团队项目；公益性行业科研专项（201103003）
作者简介: 吕玉(1991~), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为土壤环境微生物, E-mail:yulvynau@163.com
通讯联系人, 汤利, E-mail:ltang@ynau.edu.cn
摘要: 利用荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，Q-PCR）技术，结合氨氧化细菌（ammonia oxidizing bacteria，AOB）和氨氧化古菌（ammonia oxidizing archaea，AOA）丰度和土壤理化性质的测定，探索了不同氮水平下间作对玉米土壤硝化势（PNF）的影响.试验设置玉米单作和与马铃薯间作两个种植模式，4个施氮水平（不施氮N0、1/2常规施氮N1、常规施氮N2和3/2常规施氮N3）的随机区组试验.结果表明，从不施氮到常规施氮，土壤硝化势和AOA、AOB数量均随施氮量增加而逐渐增加，而高氮（N3）时与N2没有显著差异；间作对土壤硝化势、AOA与AOB数量的影响与施氮量和作物生育期有关，低氮投入（N1）间作有利于增加土壤氨氧化微生物数量和硝化作用.施肥是硝化势增加的主要驱动因子，相关性分析结果表明，土壤含水量是影响PNF的主要环境因子；PNF与土壤中AOA、AOB amoA基因丰度成显著的正相关.尽管玉米马铃薯间作降低了土壤中AOA、AOB amoA基因丰度，却使得间作土壤中AOB占据氨氧化微生物数量上的优势.以上结果表明，施氮和间作均影响了土壤硝化作用和氨氧化微生物AOA和AOB数量的变化，这些变化会影响土壤环境质量.
关键词: 氮水平      玉米间作      硝化势      氨氧化细菌      氨氧化古菌      荧光定量PCR     
Effect of Different Nitrogen Rates on the Nitrification Potential and Abundance of Ammonia-oxidizer in Intercropping Maize Soils
LÜ Yu , ZHOU Long , LONG Guang-qiang , TANG Li     
College of Resources and Environment, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China
Abstract: The objectives of this study were to explore the effects of different nitrogen rates on the nitrification potential in intercropping maize soils. The experiment included two plantation types (maize monocropping and intercropping maize and potato) and four nitrogen levels (N0: no fertilizer treatment, N1: 1/2 conventional fertilizer treatment, N2: conventional fertilizer treatment, N3: 3/2 conventional fertilizer treatment). Abundance of AOA and AOB was analyzed with real-time quantitative PCR (Q-PCR) and soil properties were also measured. Results of this study suggested that the PNF of soils, the abundance of AOA and AOB were increased with increasing N fertilization in conventional fertilizer range, and there was no significant difference between N2 and N3 treatments. The influences of intercropping on PNF, AOA and AOB were associated with N application rates and crop growth period, as well as the benefits of ammonia oxidizer and nitrification of intercropping on N1 level. Fertilization was obviously the main driving force of the PNF, correlation analysis indicated that water content was the main environmental factor affecting the nitrification potential. Nitrification potential in maize and potato intercropping soils exhibited significant positive correlations with AOA and AOB amoA gene abundance. Maize and potato intercropping could decrease the abundance of AOA and AOB, but it resulted in dominance of AOB among nitrification bacteria in these soils. In conclusion, N fertilizer and intercropping could affect both soil nitrogen internal cycling process and the abundance of AOA and AOB, which further affected soil environmental quality.
Key words: nitrogen level      maize intercropping      nitrification potential      ammonia-oxidizing bacteria(AOB)      ammonia-oxidizing archaea(AOA)      real-time PCR     

硝化作用在土壤氮素转化中发挥着重要作用，是连接固氮作用和反硝化作用的重要环节.前期研究表明，土壤硝化作用受土壤无机氮含量、温度、水分、pH等因子的影响[1~4].其中，氮肥施用增加了土壤无机氮含量，由此对土壤硝化作用产生的影响受到较多关注.氨氧化菌包括氨氧化细菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)，是影响硝化作用过程中重要的功能微生物，其催化的氨氧化过程是硝化过程的限速步骤[5]，因而受到广泛关注并成为研究热点之一. He等[6]研究发现长期不同施肥模式导致土壤中AOA和AOB的组成和丰度发生了显著变化，也发现，施氮增加了土壤amoA基因拷贝数和土壤硝化势[7, 8]; 施肥处理下土壤中AOB数量是不施肥的3倍多[9]，且随施氮量的增加而增加[10]，Ai等[11]研究表明，随着施氮量的增加，AOB的丰度和土壤硝化势也在增加; Chu等[12]发现长期施氮肥能够增加土壤硝化势和AOB的群落结构.

间作具有显著的增产效应，在世界农业生产中被广泛应用[13].在中国西北、西南地区，间作在作物生产上具有悠久历史，大部分关于间作的研究都集中于光、水、养分等资源的利用[14~16].由于作物间的相互作用，间作改变了土壤温度、水分等环境要素和土壤无机氮供应，可能对土壤硝化作用产生重要影响，然而相关报道却较为少见.高阳等[17]通过田间试验研究了玉米大豆间作对硝化-反硝化作用的影响，结果表明，施氮提高了土壤硝化速率，在生育期内，硝化速率呈现先增加后降低的趋势，然而并没有比较单间作之间硝化作用的差异. Song等[18]研究发现玉米大豆间作和小麦玉米间作会影响氨氧化细菌的群落组成.显然，与单作相比，间作对土壤硝化作用和氨氧化微生物的影响仍不够明确，尤其是在氮肥用量不同时的单间作硝化作用差异仍缺乏报道.

玉米马铃薯间作是一种代表高、矮作物立体种植的典型配置，是较为普遍的农业生产方式，尤其在云南及西南地区，玉米马铃薯间作是春季作物种植中最普遍、最重要的种植模式，在云南农业生产中具有广泛地代表性和重要地位，其具有显著控病效果[19]，能充分利用光照、养分和水分资源[20]，能显著提高植物的光合效率[21]，而且有较高的土地当量比与增产效应[22].本文选取云南长期耕作的农田土壤为研究对象，采取室内培养试验，微生物分子生态学的方法分析不同氮水平对间作玉米土壤硝化势的影响和硝化微生物的响应，旨在为作物间作生产提供科学参考，为土壤氮素循环的合理调控提供科学依据.

1 材料与方法 1.1 试验地概况

试验始于2014年，地点位于云南省昆明市，云南农业大学寻甸大河桥农场，N 23°32′、E 103°13′，海拔1 953.5 m.气候条件属于亚热带季风气候，年平均气温14.7℃，年降水量1 040 mm.土壤为红壤，试验开始时，供试土壤0~20 cm土层含有机质20.79 g·kg-1，速效磷(P)10.15 mg·kg-1，速效钾(K)125.34 mg·kg-1，硝态氮(NO3--N)4.09 mg·kg-1，铵态氮(NH4+-N)0.83 mg·kg-1，pH 7.58.

试验设置玉米单作(MM)和玉米间作(IM)两种种植模式，间作时的配套作物为马铃薯.每个种植模式均有4个施氮水平，分别是不施氮(N0，0 kg·hm-2)、低氮施肥(N1，125 kg·hm-2)、常规施氮(N2，250 kg·hm-2)、高氮施肥(N3，375 kg·hm-2).玉米氮肥分基肥、拔节期追肥、喇叭口期追肥3次施入，分别占总施氮量的40%、25%和35%.磷肥(P2O5)75 kg·hm-2和钾肥(K2SO4)125 kg·hm-2均以基肥的形式施入.以上两项试验皆为随机完全区组设计，每处理重复3次，共24个种植小区.小区的面积32.50 m2(5 m×6.5 m)，在小区四周设置保护行.试验期间的管理措施按当地农民习惯进行.

1.2 土壤的采集和基本理化性质的测定

土壤样品采集用五点采样法，采样时间按照表 1所示，采样深度为0~20 cm.将五点采集的土壤去除根系、杂草、土壤动物和石块等杂质后过2 mm筛，混匀.一部分4℃保存用于土壤硝化势和含水量测定，剩余的土样风干用于测定其他理化性质. 2015年7月9日(喇叭口期)另取新鲜土样于-80℃冷冻保存用于土壤微生物荧光定量PCR分析.每次采样的时候进行温度(T)的测定，在单作玉米行间，间作玉米行间，间作玉米马铃薯行间分别插入3根温度计，待稳定之后进行读数.

表 1 玉米种植、收获及土壤样品采集日期 Table 1 Maize planting, harvesting and soil sample collection dates

土壤的含水量(H2O)采用烘干法测定; 土壤pH采用电位法(水土比2.5:1); NO3--N和NH4+-N采用1 mol·L-1 KCl浸提，浸提液用流动分析仪测定; 有机质采用重铬酸钾容量法测定; 速效磷采用碳酸氢钠-分光光度计法测定; 速效钾采用醋酸铵-火焰光度计法测定; 测定土壤溶解性总氮(TDN)采用1 mol·L-1KCl浸提，过硫酸钾氧化，流动分析仪测定NO3--N浓度; DON采用差减法，即溶解性总氮减去硝态氮含量.

1.3 硝化势(PNF)的测定

土壤样品采集回实验室后，立即进行硝化势的测定.采用好气培养法[12].稍作修改，具体如下：称取20 g鲜土置于三角瓶中，加入(NH4)2SO4调节NH4+-N的浓度到40 mg·(100 g)-1，按干土的质量计算，田间持水量调节到60%，不加(NH4)2SO4溶液的作为对照.将三角瓶放到23℃的黑暗培养箱中培养48 h.培养结束之后，土壤NO3--N含量的测定以1 mol·L-1KCl溶液振荡浸提，过滤，用流动分析仪测定.

1.4 DNA的提取

土壤总DNA提取采用PowerSoilTM Total DNAIsolation试剂盒进行(MO BIO Iaboratories，CA，USA)，称取0.4 g、-80℃保存的土壤样品，按试剂盒提供的操作步骤进行，以FastPrep细胞破碎仪(Qbiogene Inc, USA)进行细胞破碎处理，速度5.0 m·s-1，时间45 s.提取的DNA在1%的琼脂糖胶中进行电泳检测，并将提取的DNA保存于-20℃用于后续分析.

1.5 定量PCR

功能基因的定量分析采用SYBR GREEN法，AOA和AOB amoA基因分别采用Arch-amoAF/Arch-amoAR和amoA-1F/ amoA-2R进行PCR扩增，每个样品3次重复.采用TransStartTop Green qPCR SuperMix (全式金生物技术有限公司，北京)试剂盒于ABI StepOne Plus Real-Time PCR System扩增仪上进行绝对荧光定量PCR分析，反应体系20μL，其中2μL稀释5倍的DNA模板加反应液18μL，反应液包括10μL TransStartTop Green qPCR SuperMix(2×)，0.4μL Passive Reference Dye I (50×)，前、后引物各0.4μL(10μmol·L-1，捷基生物工程公司，上海)和6.8μL超纯水.试验对照用灭菌双蒸水代替DNA作为反应模板.

标准曲线的制作：参照He等[6]报道的方法，以土壤中提取的混合DNA为模板进行AOB和AOA的amoA基因PCR扩增，将扩增产物用TIANGEN Universal DNA Purification Kit试剂盒(天根)对其进行纯化回收，按试剂盒方法用pEASY-T3(pEASY-T3 Cloning Kit北京全式金生物技术有限公司)载体连接PCR产物，然后克隆到Trans1-T1感受态细胞中(Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell全式金生物技术有限公司)，在氨苄青霉素平板上进行蓝白斑试验筛选阳性克隆，取部分阳性转化菌液送至上海生工生物工程有限公司进行测序.测序结果为阳性的菌液，利用TIAN Pure Midi Plasmid Kit试剂盒(天根)提取重组质粒DNA，然后用Nanodrop (美国)测定重组质粒DNA的浓度，根据已知质粒全序列和阿伏伽德罗常数(6.02×1023 mol-1)，计算amoA基因拷贝数.以10倍梯度分别进行稀释，每个稀释度进行3次重复，通过荧光定量PCR扩增分别获得AOA和AOB的amoA基因标准曲线，反应程序如文献[23, 24].

1.6 数据处理

采用SPSS 22软件进行数据方差分析和相关性分析; ABT分析采用R语言中的“gbmplus”程序包进行处理，即采用的是R语言软件的ABT聚合推进树分析方法，直接用“gbmplus”程序包先进行编程再进行数据分析; 用Microsoft Excel 2010进行数据处理、制图.

2 结果与分析 2.1 不同施氮水平和间作对玉米土壤硝化势的影响 2.1.1 施氮水平对玉米土壤硝化势的影响

由图 1可知，在常规施氮范围内，玉米单作和间作的土壤硝化势随着施氮量的增加而增加，均在N2处理下达到最大值，超过常规施氮水平之后，硝化势不再增加，甚至出现下降的趋势，MM土壤硝化势在N1、N2、N3处理下分别是N0的1.5、2.0和1.9倍，IM、MM土壤硝化势在N1、N2、N3处理下分别是N0的3.2、4.3和3.5倍.在单间作玉米整个生育期内，生长前期的土壤硝化势较低，由苗期到抽穗期玉米土壤硝化势逐渐升高，抽穗期达到最高，成熟期时反而降低.试验的两个年度间进行比较，单间作玉米土壤硝化势随着施氮量的增加变化趋势大体一致，不同的是2014年玉米前两个生育期的土壤硝化势极低.

MM：玉米单作，IM：玉米间作. N0：不施氮处理，N1：1/2常规施氮处理，N2：常规施氮处理，N3：3/2常规施氮处理; 不同小写字母表示同一生育期不同氮水平处理间差异显著(P＜0.05) 图 1 不同氮水平对玉米土壤硝化势的影响 Fig. 1 Nitrification potential (PNF) in maize soils with different nitrogen rates

2.1.2 间作对玉米土壤硝化势的影响

间作对土壤硝化势的影响与施氮量和作物生育期有关(表 2)，在N0处理下，单作玉米土壤硝化势是间作玉米的1.9倍，显著高于间作玉米，在其它氮水平下单间作玉米土壤硝化势没有显著差异.在玉米整个生育期，除了苗期之外，间作有降低土壤硝化势的趋势. 2014年，在喇叭口期，间作玉米土壤硝化势显著低于单作玉米，其他生育期内没有显著差异.两年的变化规律基本一致.

表 2 间作对玉米土壤硝化势的影响1) Table 2 Nitrification potential (PNF) in maize soils with maize and potato intercropping

2.2 不同施氮水平和间作对玉米土壤氨氧化微生物数量的影响 2.2.1 施氮水平对玉米土壤氨氧化微生物数量的影响

依据标准曲线用Real-time PCR技术获得的不同施肥处理的AOA amoA基因拷贝数(以干土计，下同)在1.808×104~4.413×104 copies·g-1之间，AOB amoA基因拷贝数在1.223×104~2.7×105 copies·g-1之间，结果如图 2. N2和N3处理的MM土壤中AOA的amoA基因拷贝数显著高于N0和N1处理，在N2处理下达到最大值，MM土壤AOA数量在N1、N2、N3处理下分别是N0的1.05、1.67和1.55倍. IM的AOA数量在N2处理下最高，显著高于N0处理，施氮处理间没有显著差异，IM土壤AOA数量在N1、N2、N3处理下分别是N0的1.26、1.56和1.40倍.

图 2 不同氮水平和间作对土壤氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)数量的影响 Fig. 2 Abundance of AOA and AOB in soild with different nitrogen rates and maize intercropping

MM土壤中AOB的amoA基因拷贝数随着施氮量的增加先增加后降低，在N2处理下达到最大值，显著高于其他处理，分别是N0、N1和N3的7.62、7.10和1.25倍. IM土壤的AOB数量随着施氮量的增加而增加，在N3处理下达到最大值，各施氮处理间达到显著差异.

2.2.2 间作对玉米土壤氨氧化微生物数量的影响

由图 2可知，在N0处理下，MM土壤中AOA基因拷贝数显著高于IM，其它施氮条件下单间作玉米之间AOA数量没有显著差异; 在N0和N2条件下，MM土壤中AOB基因拷贝数显著高于IM，在另外两个施氮处理下则刚好相反，为IM显著高于MM.

通过比较同一作物同一施氮处理下土壤中AOA和AOB的数量可知，除了N0条件下IM土壤中AOA数量显著高于AOB数量之外，其他处理土壤中均为AOB数量显著高于AOA数量，AOB和AOA数量比例可达0.68~9.76，两者比例随着施氮水平的增加而增加，IM在N3处理下的差异最大，表明玉米土壤中AOA占据氨氧化微生物数量上的优势.

2.3 氨氧化微生物数量、PNF和土壤理化性质的相关性分析

将PNF、AOA、AOB和土壤理化性质进行相关性分析(表 3)，结果表明：Cw与玉米土壤的PNF都呈极显著正相关，不同的是无机氮、有机氮和T与PNF呈显著负相关; NH4+-N、TDN、P和T与MM的PNF呈显著负相关; NO3--N、NH4+-N、TDN和pH与IM的PNF呈显著负相关.玉米土壤的AOA、AOB数量与土壤因子的相关性和MM的相关性一致，都是Cw与AOA呈极显著正相关，NO3--N、DON、TDN和P与AOA、AOB呈显著负相关，而IM的AOA和影响因子没有相关性，IM的AOB与NO3--N、NH4+-N、DON、TDN呈显著负相关.

表 3 土壤理化性质和PNF、amoA数量的Pearson相关系数1) Table 3 Pearson correlation coefficients between physic-chemical properties and PNF, amoA copies

PNF和AOA、AOB的amoA基因拷贝数的线性回归分析结果显示，PNF和AOA、AOB之间存在极显著的线性正相关关系，且相关系数分别达到0.786、0.845(P＜0.01，图 3).

图 3 PNF和AOA、AOB丰度相关性分析 Fig. 3 Correlation analysis between PNF and abundance of AOA, AOB

2.4 环境因子对PNF、AOA和AOB丰度的相对贡献

采用ABT (aggregated boosted tree)分析了土壤因子对PNF、AOA和AOB丰度的单独的解释量(图 4).结果表明，土壤理化性质对PNF、AOA和AOB有不同的响应.对于PNF来说，各个环境因子对PNF的相对贡献率依次为TDN>NH4+-N＞Cw＞T＞DON＞NO3--N＞K＞pH＞P，TDN和NH4+-N分别占到所有变量可解释量的26.72%和16.8%.对于AOA和AOB来说，Cw和NO3--N是贡献率最大的两大因素，在AOA中分别占到33.1%和32.78%，而在AOB中分别占到23.18%和49.25%的解释量.

图 4 环境因子对PNF、AOA和AOB丰度的相对贡献 Fig. 4 Relative contribution between environmental factor of PNF and abundance of AOA，AOB

3 讨论

土地种植模式、施肥、管理以及土壤特性会对微生物数量、活性与种群结构产生较大影响[25, 26].本研究结果发现施氮提高了作物土壤中的PNF，这与前人研究结果基本一致，如Wertz等[27]分析了长期施肥对森林土壤硝化势的影响，他们发现施肥显著提高了土壤的硝化势; Chu等[12]研究发现施用氮肥土壤的硝化势是不施肥的13~21倍，长期施肥(尤其是氮肥)可以增加土壤的硝化势.土壤硝化势的增加主要是施氮肥带来了无机N，随着施氮量的增加，硝化速率和硝化势也增加的情况在其他研究中都有报道[28~30].并且笔者发现施氮增加了作物土壤的TDN含量，然而通过ABT研究发现，TDN含量是所有环境因子中对PNF解释量最大的，因此推测TDN含量的增加导致了硝化势含量的增加.在一定施氮范围内，土壤硝化势随着施氮量的增加而增加，而在高氮处理下降低.

另外，土地种植方式对硝化势的影响结果表明，在同一施氮处理下，间作玉米显著降低了土壤的硝化势，这可能是由于间作引起硝化微生物的变化.为了探讨玉米马铃薯间作土壤对施肥和种植方式差异性响应的微生物机制，本研究采用Q-PCR技术，通过分析编码施氮以及间作对土壤中AOA、AOB amoA基因丰度的影响.研究结果表明，施肥显著增加了AOA、AOB的基因丰度.相关研究表明，施肥显著促进AOA和AOB生长这种现象具有一定的普遍性，Song等[31]研究发现施肥显著增加了水稻土壤中AOA和AOB的基因丰度.本研究中，在N2处理下，间作显著降低了AOA和AOB的基因丰度，土壤中AOA和AOB丰度随着施氮量的增加呈现先增加后降低的趋势，在N2水平下达到最大值，而且都是AOA amoA拷贝数高于AOB，表明在该试验条件下AOA更敏感，这与前人研究结果一致[32, 33]，说明土壤微生物数量会随着施氮量以及种植方式的不同而发生变化，但也有可能是施氮和种植模式的差异导致微生物群落结构的改变，从而导致微生物数量上的差异，但对于这一原因推测是否合理还需要在接下来的试验中进行深入的研究.

前人的研究结果认为土壤pH会影响AOA和AOB的群落结构和丰度[33~35]，但在本研究结果中，pH介于7.76~7.84，各处理之间土壤pH没有显著差异，另外ABT分析发现pH对PNF、AOA和AOB丰度的贡献率分别为5.98%、2.66%和1.08%，占所有解释变量的比例较低，因此在本试验条件下不是主要影响因子. ABT分析发现Cw对AOA和AOB的解释变量最大，逐步回归分析显示PNF和AOA、AOB之间存在极显著的线性正相关，相关分析表明，Cw和PNF、AOA、AOB都显著正相关，说明水分是硝化作用的主要影响因子，这与曾泽彬等[36]的研究结果一致，因此认为间作降低了Cw，进而影响氨氧化微生物的数量最终导致PNF降低.然而AOB和PNF的相关系数更高，说明AOB的丰度与土壤硝化势的关联更为密切.

4 结论

(1) 不同施肥和间作对土壤硝化势具有明显的影响作用，在常规施氮范围内，随着施氮的增加土壤硝化势也在增加，但是超过常规施氮之后硝化势不再增加，甚至出现下降的趋势.

(2) 随着施氮量的增加，单间作玉米土壤中AOA呈现先增加后降低的趋势，MM的AOB变化趋势和AOA一致，而IM的AOB丰度随着施氮量的增加而增加; 间作玉米的氨氧化微生物数量低于单作玉米.玉米土壤中AOB的丰度高于AOA.

(3) ABT分析表明，含水量和NO3--N对AOA和AOB的相对贡献率最大.相关分析表明，硝化势与含水量、AOA、AOB丰度显著正相关，说明PNF的变化与AOA和AOB的丰度显著相关.

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