2016, Vol. 37
自1940年青霉素被发现以来，抗生素极大地促进了人类和动物疾病的预防和治疗，但是随着抗生素的大量生产和使用造成了环境中抗性细菌和抗性基因的严重污染[1~4].抗性基因作为一种新型的环境污染物，在饮用水系统中被广泛检出和发现，对人类公共健康构成潜在的威胁[5~8].微生物质粒是独立于染色体外能够自主复制的遗传因子，可赋予细菌一些特殊的表型和性状，如抗生素抗性[9, 10].因此，质粒是微生物抗生素抗性基因重要的携带者之一.有研究表明，抗性质粒会使细菌产生一定的适应度代价[11, 12].质粒介导的适应度代价是指携带抗生素抗性质粒的细菌在面对有抗生素选择压力时，细菌因有抗性质粒，较野生型菌株生长更具优势; 而当抗生素选择压力解除时，抗性菌株中的某些耐药机制(如酶的产生、外排泵系统的高表达等)会成为菌株生长的额外负担，使其适应能力小于野生菌株，这一现象称为适应度代价(fitness cost)[13].
饮用水系统的典型特征是贫营养条件(TOC＜4 mg·L-1)和痕量抗生素水平(ng·L-1)[14, 15].该条件对细菌的生长和各种生理生化特征具有很大影响.但迄今，对于饮用水系统中质粒介导的抗生素抗性的适应度代价仍无人研究.本研究将选取pACYC184质粒，分析不同营养水平和痕量抗生素水平(Tet和Chl)对其适应度代价的影响.并且，用同样方法验证另外2种不同的抗性质粒(RP4和PBR322)是否具有同样的现象，以探讨饮用水系统中抗生素抗性维持可能性这一科学问题.
1 材料与方法 1.1 试剂和培养基所试抗生素，包括四环素(tetracycline，Tet)、氯霉素(chloramphenicol，Chl)、氨苄青霉素(ampicillin, Amp)和卡那霉素(kanamycin，Kan)均购自北京索莱宝科技有限公司. pACYC184质粒购于杭州宝赛生物科技有限公司，PBR322质粒购于宝生物工程(大连)有限公司. RP4质粒获赠于军事医学科学院李君文教授和邱志刚博士. CaCl2、LB肉汤和琼脂培养基购自青岛海博生物技术有限公司.质粒小提试剂盒购于天根生化科技有限公司.首先分别配制1 mol·L-1的MgSO4母液、1 mol·L-1的CaCl2母液和5×M9母液(每200 mL添加Na2HPO4 12.8 g、KH2PO4 3 g、NaCl 0.5 g、NH4Cl 1.0 g)，单独装瓶，121℃灭菌15 min.然后配制20%的葡萄糖溶液，0.22μm滤膜过滤除菌.含葡萄糖的M9基础培养基(即M9+Glc)的配方如下：5×M9母液200 mL，20%的葡萄糖溶液20 mL，1 mol·L-1的MgSO4 2 mL，0.1 mol·L-1的CaCl2 0.1 mL，最后加无菌双蒸馏水至1 000 mL.不含碳源的M9培养基(即M9-Glc)除了不添加葡萄糖外，其它配方同上.实验用的所有玻璃器材及枪头均需高压灭菌.
1.2 质粒和抗性菌株的构建实验菌株为大肠杆菌Escherichia coli K12; 3种实验质粒为pACYC184质粒(携带Tet和Chl抗性)、RP4质粒(携带Tet、Amp、和Kan抗性)、PBR322质粒(携带Tet和Amp抗性).各个质粒具体的特征见表 1.
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表 1 质粒的特征 Table 1 Characteristics of Plasmids |
携带质粒的抗性菌株的构建：采用氯化钙转化的方法分别将pACYC184、RP4、PBR322质粒转化导入到野生型大肠杆菌E. coli K12，获得具有抗生素抗性的菌株.具体的方法如下.
首先从-80℃冰箱取出保存的野生型甘油菌E.coli K12，接种至LB肉汤培养基，置于37℃摇床180 r·min-1振荡培养12~16 h进行活化，此时细菌达到对数期的末期.重复活化2次，使细菌生长活跃.取上述的菌液，按1 ：100~1 ：500比例接种于100 mL的LB肉汤培养基37℃振荡扩大培养约2~3 h，使细菌浓度约为108 CFU·mL-1.接着，取50 mL离心管，加入20 mL菌悬液，在冰上冷却20~30 min. 4℃，4 000 r·min-1离心10 min，尽量倒掉培养基(之后所有操作均在冰上进行).加入20 mL提前预冷的0.1 mol·L-1的CaCl2溶液，轻轻悬浮细菌，冰浴片刻，感受态细胞制备完成.
取10μL质粒加入新鲜制备的感受态E. coli K12中，冰上放置30 min.将样品在42℃水浴加热2 min后，迅速放入冰中1 min.加入1 mL不加抗生素的LB肉汤培养基，37℃振荡培养约2 h，使细菌复苏生长.将上述菌液上下颠倒轻轻混匀，取100μL菌液涂布于含抗生素的LB琼脂平板，37℃培养16~24 h.挑取单个菌落，划线于新的含抗生素的平板上培养，4℃保存.最后，将菌落扩大培养，用天根的质粒小提试剂盒抽提质粒进一步验证质粒是否导入成功.
1.3 竞争实验分别将野生型和携带质粒的抗性菌E. coli K12接种于LB肉汤过夜活化.取1 mL菌液用无菌生理盐水漂洗2次，调节细菌的浓度约为108 CFU·mL-1.按体积比1:1的比例混合野生菌和抗性菌，获得混合的菌液.配制不同营养梯度的培养液：M9、M9/10、M9/100、M9/1 000、M9/10 000;对应配方分别为：20 mL(M9+Glc)、2 mL(M9+Glc)+18 mL(M9-Glc)、2 mL(M9/10)+18 mL(M9-Glc)、2 mL(M9/100)+18 mL(M9-Glc)和2 mL(M9/1 000)+18 mL(M9-Glc); 对应的TOC分别约为：2 000、200、20、2和0.2 mg·L-1.
按1:10 000的比例(2μL:20 mL)将混合菌液接种于上述培养液中，37℃振荡培养.通过预实验测定细菌的生长曲线，得出E. coli K12在M9培养液生长达到稳定期的时间为24 h.因此，每隔24 h将细菌按1:10的体积比转接至新鲜的培养液进行培养，连续转接6~7次.同时，每次转接前将混合菌液稀释至合适浓度，分别涂布于普通的LB平板和加入相应抗生素的LB平板，37℃培养16~24 h后计数，获得总菌和抗性菌的数量.研究pACYC184质粒时，LB平板加入Tet 10 mg·L-1和Chl 35 mg·L-1; 研究RP4质粒时，LB平板加入Amp 60 mg·L-1、Tet 40 mg·L-1、和Kan 50 mg·L-1; 研究PBR322质粒时，LB平板加入Tet 25 mg·L-1和Amp 10 mg·L-1.
预先测定野生型E. coli K12对Tet和Chl的最小抑制浓度(MIC).为了考察抗生素Tet和Chl对pACYC184质粒适应度代价的影响，将营养梯度设成M9/500，Tet抗生素浓度梯度设为0%、1%、10%、50%和90% MIC(野生型E. coli K12)，对应的Tet的浓度分别为0、0.008、0.08、0.4和0.72 mg·L-1. Chl抗生素浓度设为0%、1%、10%、20%、50%和90% MIC(野生型E. coli K12)，对应的Chl的浓度分别为0、0.054、0.54、1.08、2.7和4.86 mg·L-1.具体的竞争实验操作同营养梯度实验.
为了进一步研究营养梯度对质粒适应度代价影响的广谱性，选取另外两种抗性质粒PBR322和RP4.具体的操作同质粒pACYC184.
1.4 数据分析将抗性菌的数量记为Nr，野生菌的数量记为Ns，那么lg(Nr/Ns)的比值即抗性菌和野生菌数量的比值，可以用来评价两菌的竞争关系即抗性质粒的相对适应度.本研究中用酶标仪测量初步确定初始细菌的浓度，平板培养需经过16~24 h才能获得准确的细菌数，所以初始抗性菌和野生菌数量的比值存在一定的偏差，计算lg(Nr/Ns)时，先将i h时的细菌数除以0 h时的细菌数进行标准化处理.具体计算公式如下：
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式中，Ns0和Nr0分别为0 h时野生型和抗性菌的细菌浓度，Nsi和Nri分别为i h时野生型和抗性菌的细菌浓度.另外，当lg(Nr/Ns)＝0时，表示抗性菌与野生菌生长的适应度相同，适应度代价一致; lg(Nr/Ns)＜0时，表示抗性菌适应度小于野生菌，适应度代价大; lg(Nr/Ns)＞0时，表示抗性菌适应度大于野生菌，适应度代价小.
2 结果与讨论 2.1 营养水平对pACYC184质粒适应度代价的影响从图 1看出，携带pACYC184质粒的抗性菌株在与野生型菌株竞争培养过程中，随着转接次数的增加，抗性菌与野生型菌株的比值逐渐变小.到第6次转接时(培养144 h)，两菌的比值下降了2.15~6.0个数量级.而且，营养水平越低，抗性菌与野生型菌株的比例减小得越快，即质粒丢失的速度越快.在M9/10 000的营养水平下，第3次转接时(培养72 h)，抗性菌已不能生长.该结果表明，pACYC184质粒在不同的营养水平下，都存在适应度代价.质粒往往通过表达修饰酶或外排泵等抗性机制产生抗生素抗性，这些机制的表达及质粒的复制都会使细菌消耗能量，影响细菌的正常生长，从而表现出适应度代价[11, 16].质粒发生丢失，不稳定遗传的原因主要有两个：一是细胞分裂时不均匀分配，二是质粒存在适应度代价，细菌为了自身的生存往往将质粒丢失，产生新的不携带质粒的菌体[17, 18].而且，营养水平越低，适应度代价表现得越明显.因为抗性菌株在低营养水平时，必须先满足细菌最基本的能量和生理需求，尽量降低其生存成本.所以，低营养水平时，质粒丢失的速度也最快. Lenski等[19]用数学模拟研究也发现E. coli菌群的pACYC184质粒在葡萄糖有限的基础培养基中培养时快速丢失，不能稳定遗传，与本研究的结果相互印证.
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图 1 营养水平对pACYC184质粒适应度代价的影响 Fig. 1 Effect of nutrition level on the fitness cost of pACYC184 plasmid |
已有报道发现在饮用水系统检测出痕量的抗生素[20, 21].通常情况下，短期饮用含痕量抗生素的水体不足以直接危害人类的身体健康[15].但是，痕量的抗生素仍可能通过间接影响细菌的抗性给人类带来潜在的健康风险.从图 2看出，当四环素和氯霉素的浓度＜50% MIC时，其对野生菌的损伤或抑制作用不足以抗衡抗性质粒对细菌生长带来的负担即适应度代价.从而，在竞争实验过程中抗性菌与野生型的比例逐渐减少.当四环素浓度＜50% MIC时，转接7次后(培养168 h)抗性菌比野生菌下降了2.25~3.13个数量级.另外，当氯霉素浓度＜50% MIC时，抗性菌的数量在转接7次后(培养168 h)，迅速下降，比野生菌约下降了5.03~6.53个数量级.而当抗生素包括四环素和氯霉素的浓度继续提高(即大于或等于50% MIC时)，抗性菌在竞争过程中，逐渐表现出优势.这是因为该浓度的痕量抗生素会杀死或抑制部分野生菌的生长.相反地，携带质粒的细菌通过表达抗性机制产生抗生素抗性，在含有抗生素的条件下更具生长优势[22].进一步观察抗性菌的生长曲线(未显示)也可以看出，当抗生素浓度为50%和90% MIC时，抗性菌的生长较其它浓度下生长得更稳定.如前所述，在实际饮用水系统中，抗生素的浓度通常在ng·L-1的水平，即在本研究的＜50% MIC的抗生素浓度范围.也就是说，抗性质粒在实际饮用水的痕量抗生素浓度条件下不容易维持，适应度代价较大，从而对人类健康的影响也较小.
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图 2 抗生素水平对pACYC184质粒适应度代价的影响 Fig. 2 Effect of antibiotic level on the fitness cost of pACYC184 plasmid |
从上面的研究得出pACYC184质粒对E. coli K12菌株是有适应度代价的，而且营养水平越低，适应度代价表现得越明显.为了验证这一现象的普遍性，再选择两种质粒RP4和PBR322作进一步的研究.由表 1介绍，RP4质粒长度为60 kb，每个细胞含4~7个拷贝数的质粒.而且，RP4质粒是接合型质粒，可能通过接合方式发生水平基因转移. PBR322质粒长度为4 kb，每个细胞含15~20个拷贝数的质粒.从图 3(a)表明，RP4质粒在所有的营养水平条件，都很多容易丢失.在第2次转接(培养48 h)时，抗性细菌就比野生菌下降约3.0~4.44个数量级.而且，在M9/10 000的营养水平下，抗性质粒丢失的速度最快.在第5次转接(培养120 h)时，抗性菌就已经全部消失了.另外，图 3(b)显示PBR322质粒在不同营养水平条件下，均会发生丢失的现象即都具有适应度代价.但是，除了M9/10 000的营养水平外，其它的营养水平下的适应度代价区分不明显.因此，认为质粒的适应度代价具有普遍性，但是具体到某个质粒的适应度代价更为复杂，可能与质粒大小、拷贝数及其类型等因素有关[23].比如，Dahlberg等[16]研究两个接合型质粒R1和RP4对E. coli J53-1的适应度代价，发现这两种质粒都有适应度代价.虽然接合型质粒会通过水平基因发生转移，但是水平转移率很低，不足以补偿质粒的适应度代价，因而质粒仍会发生丢失.
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图 3 营养水平对质粒适应度代价的影响 Fig. 3 Effect of nutrition level on the fitness cost of plasmids |
本研究选取了3种不同的抗性质粒pACYC184、RP4和PBR322，分析营养水平和痕量抗生素对其适应度代价的影响.结果得出营养水平影响抗性质粒的适应度代价.而且，在较低浓度的营养条件下(M9/1 000和M9/10 000，即2 mg·L-1和0.2 mg·L-1的TOC)，质粒介导的抗生素抗性的适应度代价表现得越明显，抗性质粒很快丢失.另外，在小于50% MIC的抗生素浓度下(即μg·L－1甚至ng·L-1水平)，抗性质粒的适应度代价效应大于该浓度的抗生素本身对细菌生长的抑制作用，质粒难以维持.进一步将该研究结果拓展到实际饮用水系统中，即贫营养条件(TOC＜4 mg·L-1)和痕量的抗生素浓度(ng·L-1)，这两种条件同时存在的情况下，质粒介导的抗生素抗性的适应度代价将表现得更为明显.因而，质粒介导的抗生素抗性在实际饮用水系统中不易维持.从这个角度来讲，质粒介导的抗生素抗性对人类健康的潜在风险也将大大减小.