环境科学  2016, Vol. 37 Issue (8): 3201-3207   PDF    
引用本文
张亚楠, 杨兴伦, 卞永荣, 谷成刚, 王芳, 王代长, 蒋新 . 鼠李糖脂与β-环糊精复合提取预测污染土壤中PAHs的生物有效性[J]. 环境科学,2016, 37(8): 3201-3207.
ZHANG Ya-nan, YANG Xing-lun, BIAN Yong-rong, GU Cheng-gang, WANG Fang, WANG Dai-zhang, JIANG Xin . Prediction of PAHs Bioavailability in Spiked Soil by Composite Extraction with Hydroxypropyl-β-cyclodextrin and Rhamnolipid[J]. Environmental Science,2016, 37(8): 3201-3207.
鼠李糖脂与β-环糊精复合提取预测污染土壤中PAHs的生物有效性
张亚楠1,2 , 杨兴伦1 , 卞永荣1 , 谷成刚1 , 王芳1 , 王代长3 , 蒋新1     
1. 中国科学院南京土壤研究所, 土壤环境与污染修复重点实验室, 南京 210008;
 2. 中国科学院大学, 北京 100049;
 3. 河南农业大学资源与环境学院, 郑州 450002
收稿日期: 2016-01-06; 修订日期: 2016-03-11
基金项目: 国家自然科学基金项目（41271327，41271464，21377138，41271471）；中国科学院南京土壤研究所一三五领域前沿项目（ISSASIP1621，ISSASIP1618）
作者简介: 张亚楠(1985~), 女, 博士研究生, 主要研究方向为环境化学与污染控制, E-mail:yanan@issas.ac.cn
通讯联系人, 蒋新, E-mail:jiangxin@issas.ac.cn
摘要: 以添加3种典型多环芳烃（PAHs）菲（Phe）、芘（Pyr）、苯并[a]芘（BaP）的模拟污染土壤（海南红壤）为对象，研究了鼠李糖脂（RL）与β-环糊精（HPCD）复合提取预测污染土壤中PAHs的生物有效性的可行性.结果表明，当RL浓度大于临界胶束浓度时，由于其胶束增溶作用，PAHs的表观溶解度随RL浓度增加而增加，促使更多的PAHs从土壤固相解吸进入土壤溶液中.通过HPCD/RL复合提取土壤中的PAHs的含量与蚯蚓体内吸收的PAHs的量进行相关性分析，发现两者之间存在显著的正相关关系.但是PAHs蚯蚓吸收量是HPCD单独提取量的2.04倍，是HPCD/RL提取量的1.15倍.结果表明，HPCD/RL比HPCD对PAHs提取更能接近蚯蚓富集.因此，RL的添加在一定程度上增加了HPCD对污染土壤中PAHs生物有效性的预测效果，HPCD/RL复合提取法可以作为一种相对快捷可靠的预测PAHs生物有效性的方法.本研究为复合提取在有机污染物生物有效性评价方面提供一个新的方向，也为有机污染物的风险评估和生物修复提供了一定的技术支持.
关键词: 鼠李糖脂      β-环糊精      蚯蚓吸收      生物有效性      多环芳烃     
Prediction of PAHs Bioavailability in Spiked Soil by Composite Extraction with Hydroxypropyl-β-cyclodextrin and Rhamnolipid
ZHANG Ya-nan1,2 , YANG Xing-lun1 , BIAN Yong-rong1 , GU Cheng-gang1 , WANG Fang1 , WANG Dai-zhang3 , JIANG Xin1     
1. Key Laboratory of Soil Environment and Pollution Remediation, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China;
 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
 3. College of Resources and Environment, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: In this study, composite extraction of hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPCD) with rhamnolipid (RL) was selected to assess the bioavailability of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) to earthworms in red soil from Hainan, China, spiked with phenanthrene (Phe), pyrene (Pyr) and benzo (a) pyrene (BaP). The results showed that when RL was more than the critical micelle concentration, apparent solubility of PAHs increased due to micellar solubilization of RL. So more PAHs were desorbed from solid phase of soil. Real biological experiments showed that there was a good linear relationship between earthworm-accumulated PAHs and HPCD/RL-extracted PAHs (R2=0.98, n=15). However, earthworm-accumulated PAHs was 2.04 times higher than HPCD-extracted PAHs, but only 1.15 times higher than HPCD/RL-extracted PAHs. This indicated that HPCD/RL was more actual and reliable than HPCD in the assessment of PAHs bioavailability to earthworms. Therefore, the addition of RL, to some extent, enhanced the prediction ability of HPCD in PAHs bioavailability, which might provide a new direction and implications in risk assessment and bioremediation of organic contaminants.
Key words: rhamnolipid      hydroxypropyl-β-cyclodextrin      earthworm adsorption      bioavailability      PAHs     

多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs)是一类最常见的、广泛分布于土壤中难降解的疏水性有机化合物[1~3].由于其辛醇-水分配系数高，水溶性差，脂溶性好，可以通过食物链在生物体内富集[4]，对人体具有潜在危害性，以及PAHs特有的“三致”效应(致畸、致癌、致突变)，使其成为关注的焦点[5~7].土壤中PAHs与腐殖酸或者土壤矿物结合，但随着老化时间的增加，PAHs会缓慢扩散进入土壤微孔结构中，从而导致其难以被生物利用或降解[8, 9].目前认为, 只有生物有效态部分才具有环境风险，因此污染物生物有效性在污染风险评估中具有重要的现实意义.近年来已经发展出系列测定PAHs生物有效性的方法，最常用的是非耗竭性(温和)提取法，如树脂提取、β-环糊精(HPCD)提取、丁醇提取等[10~12].但这些方法存在不足之处，即通常高估或低估污染物的生物有效态含量.例如，Covino等[13]研究发现PAHs微生物的降解量虽然与树脂提取量有很好的相关性，但却是树脂提取量的2.3倍; Dandie等[14]也发现，对于高环PAHs，微生物的降解量是HPCD提取量的3.3倍; 因此目前的非耗竭性提取技术并不能真正地评估PAHs的生物有效性，此技术需要进一步的完善和发展.针对非耗竭性提取技术存在的不足，笔者认为可以通过复合提取手段进行改进，即在现有的提取体系中选择性加入另一种试剂，通过二者的共同提取表征污染物生物有效性.

生物表面活性剂具有毒副作用少且易于被微生物降解、化学结构多样性以及环境相容性等特性，使其在提高疏水性有机污染物的生物有效性方面具有良好的发展潜力[15, 16]，其中，鼠李糖脂(RL)是目前研究最为深入的生物表面活性剂之一，其由亲水的鼠李糖基和碳链长度不同的饱和或不饱和脂肪酸组成，由微生物代谢产生的具有表面活性的化合物，已有大量研究表明其对多环芳烃有增溶作用[16~19].因此，在复合提取技术中可以将其作为候选提取剂使用.

本实验通过研究PAHs的蚯蚓蓄积量(赤子爱胜蚓，Eisenia fetida)与4种化学法提取量(ASE耗竭性提取总量、Tenax-TA树脂提取量、HPCD提取量和正丁醇提取量)的相关关系，发现ASE耗竭性提取总量高估了土壤中PAHs的存在风险，并且与蚯蚓富集量没有显著的相关性，因此不能用耗竭性提取总量来评估污染土壤PAHs的生物有效性; 而3种非耗竭性提取量与蚯蚓富集量呈现出较好的线性关系，其中HPCD提取较Tenax提取和正丁醇提取表现更优，是用来评估PAHs生物有效性比较有潜力的方法之一，但从相关方程的斜率看，蚯蚓富集量是HPCD提取量的2~4倍[10].因此，为了进一步优化HPCD对PAHs生物有效性的化学评估，本实验中在HPCD提取的基础上联合RL来预测PAHs生物有效性，希望能够利用RL对有机污染物的增溶作用来提高HPCD对PAHs的提取量，从而使HPCD/RL复合提取剂提取的PAHs量能够更加接近蚯蚓富集实际值，使本研究对PAHs污染土壤的环境生态风险评价具有重要意义.

1 材料与方法 1.1 药品与试剂

3种代表性的PAHs，分别为3环的菲(Phe、99%)、4环的芘(Pyr，99%)以及5环的苯并[a]芘(BaP，96%)作为目标污染物，购自德国Dr. Ehrenstorfer公司，HPCD(98%)、RL(90%)、层析硅胶、硅藻土、氧化铝以及无水硫酸钠均为分析纯试剂，正丁醇、丙酮、正己烷、甲醇、乙腈等均为色谱纯试剂，购于南京第一化学试剂公司.其中硅藻土、无水硫酸钠、氧化铝、石英砂用之前经过高温处理(200℃，4 h)，硅胶(130℃，2 h)活化.

1.2 主要仪器

配有PAHs专用柱(250 mm×416 mm, 5 mm粒径，美国Supelco公司)的高效液相色谱仪(HPLC LC-20A型，日本岛津公司); 加速溶剂萃取仪(ASE200型，美国戴安公司); R210/R215型旋转蒸发仪(瑞士Buchi公司); Sigma2-16K型离心机(德国Sigma公司).

1.3 土壤样品的采集与分析

供试土壤为采自海南的红壤(19°46′16.6″N，110°00′21.5″E).土样置于室内自然风干，磨碎，过2 mm筛，保存备用.其理化性质如下:总碳含量20.57 g·kg-1, 砂粒含量40.88%，粉砂粒含量26.76%，黏粒含量32.36%，土壤pH 6.33，土壤质地为黏壤土.

污染土壤的制备：称取风干土样650 g于2 L的大烧杯中，分别加入含Phe、Pyr、BaP的丙酮溶液，在通风厨内不断搅拌土壤，直至土壤中丙酮完全挥发，然后反复过筛，使制备的污染土壤均匀.最后制得的污染土壤PAHs的初始含量Phe、Pyr、BaP分别为1 635、1 352、353μg·kg-1.然后添加去离子水调节土壤至60%含水率，模拟自然田间状况，用铝箔封口避光培养，定期补充水分至田间持水量的60%.分别静置0、7、15、30、60 d后取样，进行PAHs化学法提取以及蚯蚓蓄积实验.每个处理设置4个重复.

1.4 蚯蚓蓄积实验

实验所用蚯蚓是购自南京养殖场的赤子爱胜蚓(Eisenia fetida)，属于正蚓科(Lumbricidae)，平均湿重在0.25 g左右.实验前，将蚯蚓在实验室环境下驯化14 d.排空肠道48 h后，将40 g老化0、7、15、30、60 d的污染土分别加入90 mm的培养皿中，每个培养皿中放入经48h肠道排空的7条蚯蚓，黑暗培养2周，温度保持在25℃.为保持60%的含水率，需要定期补充水分.实验结束后，实验组和对照组蚯蚓全部存活，将蚯蚓取出，经48 h肠胃排空后，称重，冷冻干燥后磨碎，用于蚯蚓体内PAHs蓄积量的提取; 每个处理设置4个重复.

1.5 ASE提取蚯蚓及土壤样品中PAHs

土壤或蚯蚓体内PAHs含量采用加速溶剂萃取仪(ASE 200)提取，即将称重的冷冻干燥过的蚯蚓样品或土壤样品与硅藻土搅拌均匀后分别装入ASE萃取池中，提取条件为：提取剂为正己烷/丙酮(4:1，体积比)，温度125℃，压力10 MPa，预热5 min，静态提取5 min，循环2次，溶剂冲洗体积为60%萃取池体积.提取液经旋转蒸发，浓缩至2 mL左右，转移入固相萃取柱(SPE)对样品进行纯化.其中，土壤样品的萃取液使用的SPE柱从下层至上层依次为1 g无水硫酸钠、1 g硅胶、1 g无水硫酸钠; 蚯蚓样品萃取液使用的SPE柱从下层至上层依次为1 g无水硫酸钠、0.5 g硅胶、0.5 g Al2O3、1 g无水硫酸钠. SPE柱使用前需用5 mL正己烷进行润洗，弃去润洗液，用15 mL正己烷/二氯乙烷(9 ：1，体积比)对2 mL浓缩的样品进行洗脱，将洗脱液旋转蒸干，用乙腈定容至1 mL，过0.22μm有机滤膜后移入2 mL棕色样品瓶中，采用HPLC测定PAHs含量.

1.6 HPCD以及HPCD/RL复合提取土壤中PAHs

(1) HPCD提取

分别配备一系列不同浓度的HPCD溶液(0、3.0×104、7.5×104、9.0×104 mg·L-1). HPCD提取参照Stokes等[20]的方法，即称取1 g不同老化时间的污染土样于玻璃离心管中，加入20 mL不同浓度的HPCD溶液，在室温下(25℃)振荡20 h(预实验表明，20h提取达到平衡)，振荡结束后，高速离心20 min(4 500 r·min-1)，舍弃上清液.然后加20 mL去离子水，涡旋5 s，离心，弃去上清液.残余物中的PAHs用ASE耗竭性提取法提取，最后用差减法计算得出HPCD提取的土壤中PAHs含量.

(2) HPCD/RL复合提取

分别配备一系列含有不同浓度RL(0、20、100、200、400 mg·L-1)的HPCD/RL溶液(HPCD含量为7.5×104 mg·L-1).称取1 g不同老化处理后的污染土样于玻璃离心管中，分别加入20 mL不同浓度的HPCD/RL溶液，在室温下(25℃)振荡20 h，振荡结束后，高速离心20 min(4 500 r·min-1)，舍弃上清液.然后加20 mL去离子水，涡旋5 s，离心，弃去上清液.残余物中的PAHs用ASE耗竭性提取法提取，最后用差减法计算得出HPCD/RL复合提取的土壤中PAHs含量.

1.7 PAHs的高效液相色谱(HPLC)测定

PAHs使用HPLC荧光检测器进行检测.分离柱为PAHs专用柱(250 mm×416 mm, 5 mm粒径，美国Supelco公司)，检测器的波长设置：Phe的激发波长为245 nm，发射波长为365 nm; Pyr的激发波长为270 nm，发射波长为390 nm; BaP的激发波长为260 nm，发射波长为420 nm.流动相为乙腈：水(9:1，体积比); 进样量为20μL，流速1.5 mL·min-1，恒流; 柱温30℃.

1.8 数据分析与质量控制

在样品分析过程中进行空白、平行样以及加标回收率的测定.在对照空白土壤和蚯蚓样品中分别添加3种PAHs的混合标样(单点加标，加标浓度为1 000μg·L-1)，采用1.6节中分析方法测定PAHs回收率，土壤样品中的加标回收率分别为93%、97%、99%，蚯蚓样品中的加标回收率为92%、93%、95%，相对标准偏差小于10%.土壤中的PAHs浓度用干重表示，蚯蚓中的PAHs浓度用鲜重表示，值为算术平均值.所有实验数据用Excel 2013和SPSS 13.0软件进行统计分析.

2 结果与讨论 2.1 不同浓度HPCD以及HPCD/RL复合提取污染土壤中的PAHs

图 1显示出不同浓度的HPCD对污染土壤PAHs的提取能力：HPCD添加量为7.5×104 mg·L-1时Phe提取量为267μg·kg-1，与对照组纯水体系相比(HPCD添加量为0 mg·L-1时)，Phe提取量为227μg·kg-1，差异极显著(P＜0.05)，表明在一定范围内，HPCD对Phe的提取能力随着HPCD添加量的增加而增加.当添加量大于7.5×104 mg·L-1时，Phe的提取量不再增加，提取达到最大值.实验结果表明HPCD浓度影响其对污染物的提取效果[21].不同浓度的HPCD对Pyr和BaP提取能力变化趋势与Phe相同，在纯水体系中，由于Pyr和BaP的水溶解度很小，提取量几乎为零. HPCD添加量为7.5×104 mg·L-1时，对Pyr和BaP提取达到最大值，分别为376μg·kg-1和64μg·kg-1.表明7.5×104 mg·L-1的HPCD足以使3种PAHs达到最大提取量.这与HPCD具有独特的双亲结构密切相关，HPCD是环外带有羟基的环状结构，环外亲水，环内亲脂.它能够增加有机物的可溶性，使潜在解吸的组分从土壤颗粒释放，进入HPCD环状结构内部[22~24].

图 1 HPCD提取剂浓度最优化选择 Fig. 1 Optimization of HPCD extracting agent concentration

图 2所示为HPCD与RL复合提取污染土壤PAHs的含量，其中HPCD的添加量为7.5×104 mg·L-1，RL的添加量分别为0、20、100、200、400 mg·L-1.从中可知，RL的添加量为0~100 mg·L-1时，HPCD/RL对PAHs的提取量随RL的添加浓度的增加而增加，并且与0添加量相比差异很显著(P＜0.05).这是因为RL增加了PAHs的表观溶解度，促使更多的PAHs从土壤固相溶解到提取相中[25, 26].有研究表明，当RL的质量浓度小于CMC(88.8 mg·L-1)时，主要以单体形式存在，当其质量浓度大于CMC时，其分子在溶液内部自发缔合排列成胶束或双层结构，并且随质量浓度增加，这些聚集体之间可能进一步缔合成囊泡状物质，从而使胶束的内部空间增加，进而提高了RL对PAHs的增溶能力[27, 28]. RL的添加量大于100 mg·L-1时，HPCD/RL对Phe、Pyr、BaP的提取量趋于最大值，分别为370、448、126μg·kg-1.与对照相比(HPCD 7.5×104 mg·L-1，RL 0 mg·L-1)，HPCD/RL对Phe、Pyr、BaP的提取量分别增加了38%、19%和97%，这是RL与HPCD共同作用的结果.

图 2 RL添加量的最优化选择 Fig. 2 Optimization of rhamnolipid adding amount

2.2 不同老化时间污染土壤中蚯蚓体内富集PAHs的含量

不同老化时间污染土壤中蚯蚓体内富集PAHs的含量如图 3所示. ct/c0(%)表示以老化0 d污染土壤蚯蚓富集PAHs(暴露14 d后)的含量为参照(100%)，不同老化时间污染土壤中蚯蚓富集PAHs的含量占0 d污染土壤中蚯蚓富集PAHs含量的百分比.其代表着随老化时间的增加，PAHs被蚯蚓富集潜力的变化趋势.

图 3 蚯蚓富集PAHs的量随老化时间的变化规律 Fig. 3 Variation of PAHs concentration accumulated in earthworms with aging time

从图 3结果可以看出，随老化时间的增加，所研究的3种PAHs代表物在蚯蚓体内的富集含量均有不同程度的下降.其中在0、7、15、30、60 d的污染土中，蚯蚓富集Phe的含量分别为1 572、1 334、674、502、276μg·kg-1. Phe被蚯蚓富集含量分别下降为0 d时蚯蚓富集含量的85%、43%、35%、18%;差异显著性分析结果显示，各时期蚯蚓富集Phe量间的差异显著(P＜0.05).在各对应时期，蚯蚓富集Pyr的含量分别为2 205、1 502、1 155、685、556μg·kg-1. Pyr被蚯蚓富集含量分别下降为0 d时的68%、52%、31%、25%，方差分析结果显示，各时期蚯蚓富集Pyr含量间的差异显著(P＜0.05).蚯蚓富集BaP的含量分别为195、88、41、39、37μg·kg-1，蚯蚓富集Pyr的能力分别下降为0 d时的45%、21%、20%、19%;方差分析结果显示，0、7、15 d蚯蚓富集Pyr含量间的差异显著(P＜0.05)但15 d之后差异不明显，趋于稳定.

由上述结果可知，蚯蚓对PAHs的生物富集受老化时间的影响显著.这可能由于进入土壤中的有机污染物，一部分迅速与有机质作用，发生非线性吸附或分配吸收; 另一部分随着老化时间的增加，进入到土壤微孔空隙更深、更封闭的吸附位点，被强烈的束缚，空隙结构越小，污染物越难被释放与利用[29].因此，老化时间越长，有机污染物的生物有效性就越低，被蚯蚓及其它生物的利用程度就越低[30~32].另外，土壤对有机污染物固持能力以及蚯蚓及其它生物对其利用能力不仅受老化时间的影响，也与污染物的种类息息相关.本实验研究中，Phe、Pyr和BaP的总添加量分别为1 635、1 352和353μg·kg-1，老化时间相同的情况下，蚯蚓对不同种类PAHs的利用能力也是不同的，例如，污染0 d的土壤中，对3种PAHs的富集量分别占总添加量的96%、163%、55%.由此可见，被蚯蚓富集的潜力Pyr＞Phe＞BaP.有研究也表明，蚯蚓对四环的Pyr有一种特殊的亲和能力，它能够富集其他化学试剂提取不到的那部分Pyr[11].

2.3 污染土壤中PAHs的化学提取量与蚯蚓吸收量之间的相关关系

将HPCD(7.5×104 mg·L-1)以及HPCD/RL(HPCD 7.5×104 mg·L-1，RL 100 mg·L-1)提取土壤中PAHs的含量与蚯蚓体内吸收PAHs的含量进行相关性分析，发现PAHs蚯蚓体内富集量与两种化学法提取的PAHs量之间皆存在显著的正相关关系(图 4).但是二者也有明显的差别，PAHs蚯蚓富集量是HPCD提取量的2.04倍，是HPCD/RL提取量的1.15倍，即HPCD提取对蚯蚓富集的低估程度比HPCD/RL严重.为了提高化学预测方法的可靠性，在进行可行性分析时，不但要考虑化学方法与模式生物法的相关性，同时二者比例不能被忽视，即二者比例接近1.0最理想[33, 34].因此，实验结果表明HPCD/RL提取比HPCD提取有较好的线性相关性，且更接近蚯蚓的实际富集量.所以与HPCD提取法相比，HPCD/RL提取法是一种更为可靠的评估PAHs生物有效性的化学提取方法.

图 4 蚯蚓吸收PAHs的量与HPCD提取PAHs的量以及HPCD/RL提取PAHs的量之间的相关关系 Fig. 4 Correlation of earthworm-accumulated PAHs with HPCD-extractable PAHs and HPCD/RL-extractable PAHs

3 结论

RL浓度大于CMC时，能够通过胶束增溶作用增加PAHs的表观溶解度，促使PAHs由土壤固相解吸.通过复合提取法提取的PAHs量与蚯蚓富集PAHs量进行相关性分析，发现与HPCD提取法相比，HPCD/rhamnolipid对PAHs的提取线性相关性更好，且更接近蚯蚓的实际富集量.因此可以认为HPCD/rhamnolipid复合提取在评估PAHs生物有效性方面具有较好的运用前景.

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