环境科学  2016, Vol. 37 Issue (8): 3114-3119   PDF    
引用本文
李祥, 林兴, 杨朋兵, 黄勇, 刘恒蔚 . 活性污泥厌氧Fe(Ⅲ)还原氨氧化现象初探[J]. 环境科学,2016, 37(8): 3114-3119.
LI Xiang, LIN Xing, YANG Peng-bing, HUANG Yong, LIU Heng-wei . Simultaneous Ferric Reduction with Ammonia Oxidation Phenomena in Activated Sludge in Anaerobic Environment[J]. Environmental Science,2016, 37(8): 3114-3119.
活性污泥厌氧Fe(Ⅲ)还原氨氧化现象初探
李祥1,2 , 林兴1,2 , 杨朋兵1,2 , 黄勇1,2 , 刘恒蔚1,2     
1. 苏州科技大学环境科学与工程学院, 苏州 215009;
 2. 苏州科技大学环境生物技术研究所, 苏州 215009
收稿日期: 2016-03-19; 修订日期: 2016-04-01
基金项目: 国家自然科学基金项目（51478284，51408387）；江苏省研究生创新基金项目（CXLX14_1289）；江苏省特色优势学科二期立项项目；江苏省水处理技术与材料协同创新中心项目
作者简介: 李祥(1984~), 男, 硕士, 实验师, 主要研究方向为废水脱氮处理理论及工艺, E-mail:lixiang@mail.usts.edu.cn
摘要: 采用常规化学分析和微生物群落变性梯度凝胶电泳（DGGE）监测技术，探究了厌氧条件下活性污泥中Fe（Ⅲ）还原氨氧化（Feammox）反应的存在及微生物群落动态响应.结果表明，当反应器运行至第24 d时NH4+发生转化，同时检测到NO3-和Fe（Ⅱ）的生成，表明活性污泥中存在着Fe（Ⅲ）还原NH4+氧化反应，产物主要为NO3-和Fe（Ⅱ），并伴随少量N2生成.经过84 d培养，氨氮最大转化量达29.85 mg·L-1，转化率为59.7%，出水NO3-最高值达24.56 mg·L-1.活性污泥中Feammox为产酸过程，体系中pH值下降.整个培养过程中微生物群落条带分布发生变化，参与活性污泥中Feammox反应的部分群落在培养过程获得保留，部分优势菌群获得富集.
关键词: 活性污泥      厌氧环境      Fe(Ⅲ)还原氨氧化      变性梯度凝胶电泳(DGGE)      微生物群落     
Simultaneous Ferric Reduction with Ammonia Oxidation Phenomena in Activated Sludge in Anaerobic Environment
LI Xiang1,2 , LIN Xing1,2 , YANG Peng-bing1,2 , HUANG Yong1,2 , LIU Heng-wei1,2     
1. School of Environmental Science and Engineering, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China;
 2. Institute of Environmental Biotechnology, Suzhou University of Science and Technology, Suzhou 215009, China
Abstract: In recent years, a few phenomena of ferric reduction and ammonia oxidation (Feammox) have been discovered in Paddy soil, lake sediments and wetland soil, but none was observed in activated sludge. Thus, the Feammox process and the dynamic response of corresponding microbial community in activated sludge were explored by conventional chemical analyses and microbial community denatured gradient gel electrophoresis (DGGE) technique. After 24 d of operation, ammonia transformation occurred. Nitrate and ferrous ion were detected in the reactor, indicating the existence of Feammox process in activated sludge with a reduction of nitrate and ferrous ion accompanied by a small amount of nitrogen gas. After 84 days of culture, the highest inversion of ammonia was 29.85 mg·L-1, the conversion rate of ammonia reached 59.7%, and the highest nitrate concentration of the reactor effluent was 24.56 mg·L-1. Feammox in activated sludge was a process that resulted in acid leading, which decreased the pH value. The structure of community bands changed during the whole incubation, some communities were retained and part of the dominant bacteria were enriched in the reaction of activated sludge.
Key words: activated sludge      anaerobic environment      ferric reduction and ammonia oxidation      denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE)      microbial community     

氮素的循环与转化途径一直是学者们研究的重点，自然界的氮素主要有NH4+-N，NO2--N、NO3--N、N2以及氮氧化合物几种存在形式.而微生物脱氮就是利用微生物将NH4+-N、NO2--N、NO3--N等对环境产生污染的物质转变为N2的过程.传统的生物脱氮主要以硝化-反硝化机制为主[1].厌氧氨氧化(ANAMMOX)[2]的发现打破了人们对传统脱氮观念的认识，使人们对脱氮的机制有了新的认识，为新型生物脱氮工艺的推出奠定了重要的基础.

ANAMMOX反应即在厌氧条件下以NH4+-N为电子供体，NO2--N为电子受体将氮素转化为N2的工艺.随着人们对ANAMMOX微生物脱氮机制研究的深入，发现在厌氧条件下很多物质可以作为电子受体与NH4+-N进行反应，包括Mn[3]、SO42-[4, 5]和有机酸[6, 7]等. Roden等[8]和Clément等[9]在湿地沉积物和湿地土壤中发现了Fe(Ⅲ)氧化NH4+-N的现象，并推出Fe(Ⅲ)也可以作为脱氮的电子受体. 2006年日本学者Sawayama[10]在固定床反应器中验证了Fe(Ⅲ)与NH4+-N反应，并将厌氧条件下Fe(Ⅲ)与NH4+-N反应的现象定义为铁还原氨氧化(Feammox)反应，目前Feammox现象在稻田[11]和森林湿地[12]等很多系统中也得到了验证.

近年来，曲久辉等[13]在活性污泥中研究高价铁对NH4+-N氧化去除效率影响时发现，加入少量Fe(Ⅲ)有助于提高NH4+-N的去除率.柴立元[14]等在活性污泥中添加0.15 mol·L-1的氯化铁溶液对其进行改性，结果表明加入氯化铁后污泥脱氮效率大幅度提升.但是对于增强NH4+-N转化机制的分析较少，是否由于Feammox现象存在而导致尚不清晰.而目前活性污泥中有关Feammox的现象也鲜有报道.

为此，本研究在厌氧条件下利用常规的水质分析及变性梯度凝胶电泳(DGGE)技术对活性污泥中Feammox反应存在性进行初步研究，并对Feammox反应器启动过程中微生物群落的变化进行观察，以期为更好地阐述传统活性污泥中脱氮机制提供理论参考.

1 材料与方法 1.1 装置及运行条件

实验运行装置采用250 mL规格的血清瓶，螺旋盖密封.装置运行条件：血清瓶放置在气浴恒温振荡箱中，温度为32℃恒定; 转速为125 r·min-1; 水力停留时间为2 d; 进水pH值为6.5~7.0，通过0.5 mol·L-1的盐酸调节控制; 每次静置后换水体积保持在200 mL.反应前用高纯氦曝气15min以除去水中溶解氧，通过ORP进行表征，进水反应器内ORP控制在(-60±20)mV.

1.2 接种污泥来源与实验废水

接种的污泥取自苏州某污水处理厂的沉淀池，MLVSS/MLSS为0.65.实验废水采用模拟废水，模拟废水主要成分为NH4Cl(NH4+-N 50 mg·L-1)、FeCl3[Fe(Ⅲ)按需配制]、NaHCO3 600 mg·L-1、KH2PO4 27 mg·L-1、CaCl2·2H2O 92 mg·L-1、MgCl2·7H2O 16.5 mg·L-1.微量元素浓缩液成分为: EDTA 5 000 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 430 mg·L-1，CoCl2·6H2O 240 mg·L-1，NaMoO4·2H2O 220 mg·L-1，NiCl2·6H2O 190 mg·L-1，NaSeO4·10H2O 210 mg·L-1，H3BO414 mg·L-1.微量元素投加量为1.25 mL·L-1.

1.3 分析方法

分析方法参见文献[15]. NH4+-N：纳氏试剂分光光度法; NO2--N和NO3--N：戴安ICS900/AS23离子色谱; pH：哈纳pH211型酸度计; MLSS和MLVSS：重量法; TN：以NH4+-N、NO2--N和NO3--N三者之和表示TN; TOC：德国耶拿Multi 3100 TON/TC仪; Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)：采用邻菲啰啉分光光度法.

1.4 DNA的提取与PCR-DGGE

反应器运行0、48和84 d时分别提取5 g活性污泥，利用土壤DNA快速提取试剂盒(MP，美国)提取DNA. PCR扩增时，采用真细菌16S rRNA通用引物F341 (5′CgCCCgCCgCgCgC ggCggg CggggCgggggCACggggggCC)和R518 (5′ATT ACC gCggCTgCTgg3′)，引物F341 5′端有一个GC夹(TAC gggAggCAgCAg3′)，由宝生生物公司(上海)合成. PCR反应程序为：预变性95℃，5 min; 接以20次循环包括94℃变性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸5 s，循环完毕，72℃延伸5 min.

采用Bio-Rad公司DcodeTM基因突变检测系统进行DGGE分析.变性梯度胶为45%~65% (100%的变性剂为7 mol·L-1的尿素和40%的去离子甲酰胺的混合物).待胶凝固后，将胶板装入电泳槽，取5μL PCR样品混合加样缓冲液后上样.在80 V电压下，60℃电泳16 h.电泳结束后，将胶片剥离，然后放入盛有硝酸银的溶液中进行染色5 min.然后对各泳道群落进行主成分分析，并与反应器运行状态相结合，解析群落变化与反应器功能的关系.

1.5 Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)测定

Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)测定均采用邻菲啰啉分光光度法，为避免取样过程中氧气对Fe(Ⅱ)的影响，保证测量的准确性，测定中需注意以下两点：① 水相中Fe(Ⅱ)测定：采用0.5mol·L-1盐酸溶液作为稀释液，用带有塑料管的针筒进行取样.加样时先加稀释液，再将采样的塑料管深入稀释液内部加入水样.② 污泥中Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)测定：用带有塑料管的针筒吸取10mL静置完全后的污泥于预先装有40 mL稀释液的50 mL离心管中，在摇床上振荡30 min，用0.22μm滤膜进行过滤[16]，测定滤液中Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)浓度，方法与水相测定相同.

2 结果与讨论 2.1 Feammox反应过程中氮素形态及浓度转化

保持进水NH4+-N浓度50 mg·L-1、Fe(Ⅲ)浓度50mg·L-1不变，长期运行结果如图 1所示.根据进水NH4+-N浓度的变化将整个运行时间分为2个阶段，驯化阶段(0~23 d)和富集培育阶段(24~84 d).驯化阶段，出水NH4+-N浓度最高达到60 mg·L-1，明显大于进水，主要是因为该阶段驯化以NH4+-N和Fe(Ⅲ)为营养的自养微生物，接种污泥中的异养微生物及部分无法获取营养基质的自养微生物出现死亡，导致体系中NH4+-N浓度的升高.当反应器运行到18d后，出水NH4+-N基本围绕在50 mg·L-1左右波动.说明此时不适应环境的微生物基本筛选掉，反应器中的微生物开始以自养为主.从24d开始，NH4+-N开始稳定下降，体系中开始测定到NO3--N生成，同时检测到有Fe(Ⅱ)生成.由于反应器运行初期进行了除氧，由ORP的监测指标看出体系中不含氧，所以排除硝化反应生成NO3--N的可能，而唯一的电子受体是Fe(Ⅲ)，所以认为NO3--N是Fe(Ⅲ)与NH4+-N反应生成.随着运行时间的增长，NH4+-N转化量在不断增加，第76 d时下降到20.15 mg·L-1，转化率为59.7%，而出水NO3--N含量也随之增大，最高值达24.56 mg·L-1.整个反应器的运行过程中出水NO2--N浓度很少，基本低于2 mg·L-1.根据氮元素守恒可知，反应器运行过程中会有少部分的氮损失，通过长期累积气体后分析为N2.

图 1 Feammox反应过程中氮素转化 Fig. 1 Nitrogen transformation in Feammox reaction

目前报道的Feammox反应产物主要有NO2-[9, 10, 12, 17]、NO3-[17]、N2[11, 17]以及N2 O[11]. Yang等[17]指出这种反应产物的不一致可能与所在系统控制条件有关，其研究表明，Feammox反应可以在很多领域内发生，在高风化等含低结晶铁矿物场所发生的可能性更大，同时指出从能量方面来说Feammox反应产生N2比NO2-和NO3-更容易. Ding等[11]虽然认为产物是N2，但其也表示N2有可能是Feammox产生NO2-或NO3-以后发生反硝化或者厌氧氨氧化反应产生的. Park等[18]用厌氧污泥在验证Feammox反应产物是否为NO2-时就发现有大量的NO3-，因为其接种的厌氧污泥具有厌氧氨氧化的能力，所以生成的NO2-会被再次反应生成NO3-.所以，目前对Feammox反应的产物以及控制条件没有一个很好的界定.本实验在厌氧条件下进行，由氮素形态转化可知NH4+转化的产物主要为NO3-，还有少量的NO2-和N2. Feammox过程中，NH4+是一步达到NO3-、NO2-或N2，还是有其他生化反应共同完成还需要进一步深入分析.

2.2 Feammox反应过程中铁素形态及浓度的转化

Feammox反应过程中保持进水Fe(Ⅲ)浓度50 mg·L-1不变，出水Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)变化如图 2所示.反应前期出水基本没有Fe(Ⅱ)生成，第6 d出水NH4+-N不再升高且呈现下降趋势，此时出水Fe(Ⅱ)开始升高，达到8.34 mg·L-1.测定反应器中进出水TOC为0 mg·L-1，判断有机物与Fe(Ⅲ)反应生成Fe(Ⅱ)的可能性不大，因此Fe(Ⅱ)为Fe(Ⅲ)与NH4+-N反应产物.随着出水NH4+-N的持续降低，出水Fe(Ⅱ)开始逐步提升，最高值达16.95 mg·L-1.第18 d出水中开始有NO3--N的生成，此时体系中Fe(Ⅱ)浓度开始快速下降，从接种反应开始，体系中水相中的Fe(Ⅲ)含量一直处于较低范围. 0~6 d，体系中没有Fe(Ⅱ)生成时，出水中Fe(Ⅲ)呈现较低值，且从13.61 mg·L-1逐渐降低至6.84 mg·L-1.第6 d后出水Fe(Ⅱ)开始升高，此时出水中Fe(Ⅲ)继续降低，最终稳定在1~5 mg·L-1范围内.第18 d后，出水Fe(Ⅱ)开始大幅度降低，此时出水中Fe(Ⅲ)有升高的趋势，由元素守恒推测是由Fe(Ⅱ)转化而来，但浓度只有10 mg·L-1左右.而在整个过程中，水相中总铁[Fe(Ⅱ)与Fe(Ⅲ)之和]一直都远低于进水(50mg·L-1).

图 2 Feammox反应过程中铁元素转化 Fig. 2 Iron transformation in Feammox reaction

Mazuelos等[19]研究表明，铁离子在进行氧化还原反应时，Fe(Ⅲ)与Fe(Ⅱ)相互转化会产生电子的传递，因此铁离子的加入可以对生物氧化反应起促进作用.而Bond等[20]

和Pham等[21]研究表明，当体系中溶解氧有限时，Geobacter sulfurreducen和Aeromonas hydrophila两种酶可以在缺氧条件下利用Fe(Ⅲ)代替O2作为电子受体参与反应.由本实验结果可知，厌氧条件下Fe(Ⅲ)确实可以作为电子受体与NH4+-N反应，其中Fe(Ⅲ)被还原为Fe(Ⅱ).但按照方程理论比计算可知反应前期Fe(Ⅲ)消耗量比理论值要多，这与Ding等[11]和Yang等[17]在稻田和旱地系统中研究结论相似，他们认为可能是Fe(Ⅲ)发生了其他的反应.然而在本实验体系中只有NH4+-N和Fe(Ⅲ)两种反应物，Fe(Ⅲ)的过多消耗可能与其他反应无关.而按照Fe(Ⅲ)与NH4+-N反应方程理论比可知，当NO3--N最大生成量为24.56 mg·L-1，对应混合体系中Fe(Ⅲ)应该需要761.09 mg·L-1，而进水的50 mg·L-1远远不够.这在Sawayama[10]的研究中也有体现，按反应方程比例，其进水最高铁浓度为10 mmol·L-1，理论NO2--N最高生成量为23.33 mg·L-1，但其反应实际得到的NO2--N最大生成值为49 mg·L-1，是理论值的2倍多.结合本实验的现象，推测过多消耗的Fe(Ⅲ)可能是被吸附在污泥中或者以沉淀形式存在，由Fe(OH)3溶度积(Ksp=2.64×10-39)可知，pH时在6.5~7之间时，Fe(Ⅲ)会有部分形成沉淀.而实际产物中NO3--N的过量生成，可能是由污泥中的Fe(Ⅲ)或者沉淀的Fe(Ⅲ)与NH4+反应形成.

2.3 污泥中Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)含量

Wilfert等[22]研究表明随着pH在0~14之间变化，铁离子的形态会发生转变，由离子态变为固态[如Fe、FeOx和Fe(OH)x]，而当pH > 4就可能形成沉淀(如图 3).本课题组[23]前期在研究Fe(Ⅱ)和Fe(Ⅲ)对厌氧氨氧化污泥影响时发现，当进水铁离子浓度大于5 mg·L-1时，出水铁离子浓度基本不会增加，会以Fe(OH)3形式存在于反应器底部.本实验模拟废水pH在6.5~7之间，推测反应器内Fe(Ⅲ)会出现快速的絮凝沉淀.为验证推测，将反应结束后反应器中污泥提取测定污泥中Fe(Ⅲ)和Fe(Ⅱ)含量，并与接种前污泥进行对比.结果如图 4所示，起初接种的活性污泥中Fe(Ⅱ)含量为41.9 mg·L-1，Fe(Ⅲ)含量为27.2 mg·L-1.经过84d反应后污泥中Fe(Ⅱ)含量为214.1 mg·L-1，Fe(Ⅲ)含量为1893.2mg·L-1.说明水相中Fe(Ⅲ)的过量减少是被吸附在活性污泥中. Fe(OH)3是一种不稳定的化合态，易与还原性物质发生反应[17].

扣除接种前污泥中Fe(Ⅱ)的含量，计算得到经过反应体系中Fe(Ⅱ)的累积量为172.19 mg·L-1.其值仍低于理论计算量，出现其原因可能有两个方面：一方面Fe(Ⅱ)极易氧化为Fe(Ⅲ)，很容易造成测定误差，这可能也是很多研究者发现实际量低于理论量的原因; 另一方面本实验采用SBR反应器，因此在每次打开反应器盖子出水后，反应器中Fe(Ⅱ)都有机会与O2充分接触，从而保证体系中有足够的Fe(Ⅲ)与NH4+反应.

图 3 不同pH下铁离子形态变化 Fig. 3 Species changes of iron ions at different pH

图 4 接种前与反应后活性污泥中铁离子变化 Fig. 4 Changes of iron ion in activated sludge before and after reaction

2.4 Feammox反应过程中pH变化

pH是铁还原氨氧化反应的一个重要参数，Luther等[24]研究表明，铁还原只有在pH较低时才可能发生，且从能量角度来说只有当pH小于6.8时铁氨氧化才可能产生NO3--N[25]; 而Yang等[17]也表明，当pH低于6.5时才有可能发生NO3--N的生成. Clément等[9]研究表明，在合适范围内适当的提高pH有助于Fe(Ⅱ)生成量的增加.本实验进水pH维持在6.5~7.0之间，出水pH如图 5所示，整体结果出水pH比进水低，且随着NH4+-N转化量的增大，pH下降得越多.因此活性污泥中铁还原氨氧化反应过程是一个产酸的过程.

图 5 Feammox反应过程中pH变化 Fig. 5 Changes of pH in the Feammox reaction

2.5 生物群落分析(DGGE)

反应器中物质的转化与微生物群落结构存在很好的响应关系.反应器中的主体是微生物，其状态是由某些功能微生物类群决定的[26].为了探究反应器内微生物群落的变化，本实验结合DGGE技术对不同时期污泥中的微生物群落进行分析[27].在反应运行的0、48和84 d分别从体系中提取少量污泥，采用DGGE技术检测体系中微生物种类的变化，微生物图谱变化如图 6所示. DGGE技术的图谱具有明显的差异性，说明整个培养过程微生物群落发生很大的变化，可以分为4种：整个过程中基本不变的、减少或者消失的、本身存在并得到富集的以及本身不存在驯化后产生并富集的.从图 6可知，1号和3号条带的信号在反应器运行前后没有发生太大变化，说明该菌种一直存在于反应器内，在整个驯化过程得到了保留; 5号条带的信号逐渐减弱并消失，说明在驯化过程中逐步被筛选出.而2、4、6、7号条带的信号在驯化过程中逐步增强，说明在反应过程中逐渐富集.说明Feammox驯化过程微生物发生了较大的变化.从图谱也可以看出，虽然部分微生物明显获得富集，但是微生物多样性一直比较高，说明反应器内发现的Feammox反应仍是一个多菌种协调的过程.对于氮素的具体转化途径，及各个途径的主要参与微生物仍需要深入分析.

图 6 Feammox反应器允许过程中细菌群落的演替过程 Fig. 6 Succession of bacterial community in activated sludge with Feammox reactor operation

3 结论

(1) 在厌氧自养的条件下，经过84 d富集培养，活性污泥中出现NH4+-N的转化和Fe(Ⅱ)的生成，NH4+-N最大转化量为29.85 mg·L-1，出水硝酸盐最高值达24.56 mg·L-1.说明活性污泥中存在Feammox反应.

(2) Feammox过程中NH4+-N的转化产物主要是NO3-同时还有少量NO2-和N2. Fe(Ⅲ)的转化产物为Fe(Ⅱ).同时Feammox过程是一个消耗碱度、pH下降的过程.

(3) 通过DGGE技术分析后发现Feammox驯化过程中微生物群落发生很大变化.即使经过84d的驯化，反应器内仍然是多群落共生的状态，说明Feammox现象是一个多菌种协调的过程.

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