2016, Vol. 37
2.中国科学院上海高等研究院, 上海 201210
2.Shanghai Advanced Research Institute, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 201210, China
工业废水和生活污水中的氮素以氨氮、 有机氮、 硝态氮、 亚硝态氮等多种形式存在，以氨氮为主要的存在形式. 脱氮是污水处理的一个最重要指标，传统的生物脱氮工艺是基于好氧自养硝化和厌氧反硝化的过程[1]. 在好氧阶段，氨氮通过硝化过程氧化为亚硝酸盐，亚硝酸盐再氧化为硝酸盐； 在厌氧阶段，硝酸盐通过反硝化作用还原为亚硝酸盐，接着还原为一氧化二氮、 二氧化氮，直至氮气排入大气. 近年来人们开发了一些新型的生物脱氮工艺，包括部分亚硝化，好氧反硝化，厌氧性氨氧化等[2]. 1972年，首次有报道从自然环境中分离出1株具有异养硝化能力的节细菌属细菌(Arthrobacter sp.)[3]. 其后多个种属的具有异养硝化-好氧反硝化的细菌被报道，包括粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)[4]、 施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)[5]、 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)[6]、 土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)[7]、 不动杆菌属(Acinetobacter sp.)[8, 9]、 克雷伯氏肺炎杆菌(Klebsiella pneumoniae)[10]、 芽孢杆菌属(Bacillus sp.)[11]、 泛养硫球菌(Thiosphaera pantotropha)[12]等. 异养硝化细菌与自养菌相比，具有更高的生长率，并能利用有机物质作为碳源和能源在有氧条件下将氨氮转变为N2[13, 14]. 此外，反硝化过程中产生的碱性可以部分中和由硝化过程产生的酸[5]. 因此，同步硝化反硝化可以实现低运营成本和在一个反应器达到高速脱氮的效果.
2001年解鸟氨酸克雷伯氏菌(Klebsiella ornithinolytica)、 植生克雷伯氏菌(Klebsiella planticola)和土生克雷伯氏菌(Klebsiella terrigena)等从克雷伯氏菌属种被分离出来单独成立了一个拉乌尔菌新属(Raoultella gen. nov.)[15]. 2,4,6-三硝基甲苯(TNT)是一种广泛使用的炸药，TNT在土壤中的残留带来了大量污染，植生拉乌尔菌(Raoultella planticola)可以在几小时内将100mg·L-1的TNT完全降解[16]. 2,4,5-三氯苯氧基醋酸是一种高毒性的除草剂，可以通过食物链进行富集，1株植生拉乌尔菌可以降解土壤中的2,4,5-三氯苯氧基醋酸[17]. 本研究从活性污泥中筛选出1株异养硝化菌，经鉴定为拉乌尔菌属细菌，通过单因素实验和响应曲面实验对该菌的脱氮性能进行了分析.
1 材料与方法 1.1 培养基[18~20]硝化富集培养基(g·L-1)： (NH4)2SO4 0.945，柠檬酸钠6.536，MgSO4·7H2O 1，NaCl 0.12，MnSO4·H2O 0.01，FeSO4·7H2O 0.05，KH2PO4 0.25，Na2HPO4 0.3，pH 7.0~7.5. 固体培养基添加20g·L-1琼脂.
异养硝化培养基(g·L-1)： (NH4)2SO4 0.945，柠檬酸钠12.25，MgSO4·7H2O 1，KH2PO4 0.25，Na2HPO40.3，pH 7.0~7.5.
反硝化培养基(g·L-1)： KNO3 0.722(NaNO2 0.5) ，柠檬酸钠6.128，KH2PO4 0.25，Na2HPO4 0.3，MgSO4·7H2O 1，pH 7.0.
溴百里酚蓝培养基(g·L-1)： KNO3 1，琥珀酸钠8.5，MgSO4·7H2O 1，CaCl2 0.15，FeSO4·7H2O 0.05，KH2PO4 0.25，Na2HPO4 0.3，1%溴百里酚蓝乙醇溶液1mL，琼脂20g·L-1.
1.2 富集培养及菌株分离活性污泥取自江苏省常州市某铝业公司废水处理池，取5 mL污泥悬浮于45 mL硝化富集培养基，30℃，200 r·min-1摇床富集培养12 h，将富集液进行梯度稀释涂布于硝化富集固体培养基，培养1 d后，挑取单菌落得到初筛菌株[20]. 挑取初筛菌株接种于溴百里酚蓝固体平板，挑取培养基出现蓝色晕圈的菌株，进行异养硝化性能和好氧反硝化性能测定[21].
1.3 菌株的鉴定菌株鉴定采用16S rDNA序列比对法. 提取菌株总DNA，利用一对通用引物扩增菌株16S rDNA. 上游引物为8f(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)，下游引物为1492r(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′). 基因测序后通过GenBank进行同源性序列分析，应用MEGA5.0软件构建该菌株系统发育树.
1.4 脱氮性能研究 1.4.1 培养条件对菌株异养硝化的影响利用单因素实验研究碳源、 温度、 接种量和氨氮质量浓度对氨氮去除效果的影响. 碳源选择柠檬酸钠、 琥珀酸钠、 乙酸钠、 葡萄糖和蔗糖； 温度选择20、 30和37℃； 接种量(菌液D600=2) 为1%、 2.5%、 5%、 7.5%和10%； 初始氨氮质量浓度分别为100、 200、 300、 500、 1000mg·L-1. 将处于对数期的菌液接种于装有50 mL异养硝化培养基的250 mL锥形瓶中，恒温培养，测定样品中D600、 氨氮(NH4+-N)、 硝氮(NO3--N)、 亚硝氮(NO2--N)、 羟氨(NH2OH-N)和总氮(TN)的质量浓度变化.
1.4.2 响应面法优化培养条件(response surface methodology，RSM)基于Box-Behnken design的中心组合实验设计原理，以氨氮降解率为响应值，通过响应面曲面分析进行培养条件的优化，考察因素供氧量(X1)、 温度(X2)、 碳氮比(X3)、 接种量(X4)对菌株脱氮能力的影响，并运用Design-Expert.V8.0.6软件分析得到最优培养条件. 其中，以装液量定性表征供氧量的高低，装液量的含量与溶氧量的大小呈反比关系，装液量多则溶氧低. 初始氨氮的质量浓度为200mg·L-1，依照不同的碳氮比计算柠檬酸钠质量.
1.4.3 菌株sari01的异养硝化功能验证将菌株接入异养硝化培养基中，在优化条件下培养，1 d后检测培养基中各组分氮的质量浓度变化.
1.4.4 菌株sari01的好氧反硝化能力验证将菌株sari01接入反硝化培养基中，分别以硝酸盐和亚硝酸盐为唯一氮源，30℃、200 r·min-1恒温摇床培养，测定样品中各组分氮的质量浓度变化.
1.5 分析方法菌体生长吸光度(D600)采用吸光度法测定； NH4+-N浓度采用纳氏试剂分光光度法； NO3--N浓度采用紫外分光光度法(HZ-HJ-SZ-0138) ； NO2--N浓度采用N-(1-萘基)-乙二胺光度法(GB 7493-87) ； 细胞内氮的含量采用凯氏定氮法(GB 11891-89) ，绘制菌体密度和含氮量的关系图[22]； NH2OH-N浓度采用间接分光光度法[23]； TN浓度为NH4+-N、 NO3--N、 NO2--N和NH2OH-N浓度之和.
2 结果与分析 2.1 菌株的分离及鉴定通过异养硝化培养基富集培养，获得在异养硝化固体培养基上生长的菌株10株. 将这些菌株通过溴百里酚蓝平板复筛，获得1株菌，命名为sari01. sari01菌落表面为乳白色，圆形，表面光滑，不透明，革兰氏染色为阴性.
通过BLAST检索与GenBank中的核酸序列进行菌株sari01 16S rDNA序列的同源性比对，该序列与NCBI数据库的Raoultella sp.XT-8(NCBI登录号为： KR063539.1) 同源性达99%，结合菌株的形态特征，确定菌株sari01属于拉乌尔菌属(Raoultella sp.). 将菌株sari01与其他拉乌尔菌属和一些异养硝化好氧反硝化细菌进行系统发育分析，得到菌株的系统进化树(图 1). 由图 1可以看出，菌株sari01与拉乌尔菌和克雷伯氏菌亲缘关系较近.
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图 1 菌株Raoultella sp.sari01的系统进化树 Fig. 1 Phylogenetic tree of Raoultella sp. sari01 derived from maximum-likelihood analysis of partial 16S rRNA gene sequence |
选取不同碳源进行脱氮实验，结果见图 2(a). 柠檬酸钠和乙酸钠为碳源时，12 h和24 h氨氮去除率分别达到96%和94%以上. 葡萄糖、 蔗糖和琥珀酸钠作为碳源时，氨氮去除率较低，24 h氨氮去除率分别为51.7%、 50.5%和34.2%. 结果表明，柠檬酸盐为菌株sari01的最佳碳源.
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图 2 碳源、 温度和接种量对菌株sari01的生长以及脱氮性能的影响 Fig. 2 Effects of carbon source,temperature and inoculation volume on ammonium removal and the growth of strain sari01 |
选取不同培养温度进行脱氮实验，结果见图 2(b). 可以看出，随着培养温度的升高，菌株的生物量和氨氮去除率逐渐增加，30℃和37℃条件下，菌株的生长适应期最短，4 h后进入对数期，48 h内氨氮去除率分别达到99.1%和98.7%，对应的D600分别为2.97和2.85. 而20℃条件下，菌株经过12 h才进入对数期，48 h后其氨氮去除率仅达到67.2%. 表明菌株sari01的最适生长温度是30℃.
不同接种量对菌株脱氮性能的影响见图 2(c). 可以看出，在接种量为7.5%和10%时，菌株sari01具有很好的生长及氨氮去除性能，最高的氨氮去除率在30 h分别达到99.9%和99.8%. 说明7.5%和10%的接种量的去除效果一致. 接种量为1%和2.5%时，经过60 h，氨氮去除率分别为75.2%和95.5%. 此时，菌株的D600仍在增长，氨氮浓度能够进一步减小. 说明接种量的大小主要是决定菌株繁殖的速度，接种量过大会引起溶氧不足，过小会影响培养时间，从而都可能影响氨氮去除效果[24]. 结果表明，初始接种量越高，菌株繁殖速度越快，缩短脱氮时间，7.5%~10%为最佳接种量.
从图 2可以看出，在不同的碳源、 温度和接种量的条件下，菌体密度的增长与氨氮浓度的减少呈正相关. 随着氨氮浓度的降低，D600相对应的增长，当氨氮浓度趋于稳定后，D600亦趋于稳定，进入稳定期. 说明菌株sari01对氨氮的降解主要发生在对数期.
2.2.2 菌株sari01的氨氮浓度耐受性将菌株sari01接种于不同初始氨氮浓度的培养基中，培养1 d后测定培养基氨氮浓度，结果如图 3所示. 初始氨氮质量浓度分别为200、 500、 1000和2000 mg·L-1，氨氮去除率分别为99.7%、 61.2%、 37.6%和12.3%，其对应的D600分别是3.46、 4.57、 4.49和0.336. 虽然高浓度下菌株的去除效率较低，但是各实验条件下氨氮去除量差别不大，分别是200、 300、 350、 230mg·L-1. 说明菌株生长量与氨氮的去除成正相关. 但在初始氨氮质量浓度为2000 mg·L-1时，生长量仅有0.336. 主要原因是在浓度较低的情况下，营养物质提高有利于细菌的生长繁殖； 而氨氮质量浓度过高时会对菌株产生抑制作用，抑制了菌株的生长代谢以及有效反应. 同时菌株在初始氨氮质量浓度低于1000 mg·L-1时均生长良好，D600高达5左右，说明菌株sari01的氨氮耐受范围很宽.
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图 3 不同初始氨氮浓度对菌株sari01的生长以及脱氮性能的影响 Fig. 3 Effects of different initial ammonium loads on the growth of strain sari01 and the nitrogen removal performance |
选取对脱氮性能影响较大的因素通过响应面实验设计进行优化. 通过Design-Expert.V8.0.6软件进行表 1数据的二次响应面回归分析，得到多元二次响应面回归模型.
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表 1 Box-Behnken design设计方案及响应值 Table 1 Box-Behnken experimental design along with the corresponding responses |
根据统计学知识对回归模型进行方差分析，结果见表 2和表 3.
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表 2 响应面结果的方差分析 Table 2 Analysis of variance for the RSM results |
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表 3 二次回归方程的方差分析 Table 3 Analysis of variance for the quadratic model |
从表 2可以看出，回归方程模型的P<0.0001，说明回归方程描述各因子与响应值之间的关系极其显著，即该模型是可靠的； 虚拟项极其不显著，说明实验的误差很小. 由表 2模型中的回归系数进行显著性检验可知，模型一次项X1对氨氮去除率的线性效应显著，X2和X3对氨氮去除率的线性效应非常显著； 交互项X2、 X3相交影响非常显著，其余相交影响均不显著； 二次项X32的曲面效应显著，X22的曲面效应非常显著. 说明所选因素与响应值之间不是简单的线性关系. 回归系数的符号为正表明因子与响应值之间是正相关，负值则为负相关，而其绝对值越大说明相关性越大. 因子X1、 X2与响应值负相关，即因子X1、 X2越小，响应值越大. 根据绝对值的大小可判断4个因素对氨氮去除率的影响顺序为： X2>X3>X1>X4.
从表 3的方差分析可以看出，实验的信噪比为26.75，其值通常应大于4，说明该模型有足够分辨率，能很好地反映实验结果； 变异系数低于10%，说明实验有良好的稳定性； 模型的相关系数R2=0.9855，表明98.5%的实验数据可用该模型进行解释，说明方程可靠性较高，回归有效. 综上分析，该模型可以用来分析和预测菌株sari01降解氨氮的最佳实验条件.
2.3.2 响应曲面分析为了形象地表现溶氧(X1)、 温度(X2)、 碳氮比(X3)、 接种量(X4)这4个因素之间的相互作用对氨氮去除率的影响情况，根据模型参数拟合出响应曲面，如图 4所示.
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图 4 不同因素间交互作用的响应面和等高线 Fig. 4 Response surface plots and contour plots of degradation rate under the interaction of different factors |
通过Design-Expert 8.0软件分析，由响应面和等高线图以及回归方程分析可知，菌株sari01去除氨氮的理论最优条件为： 装液量50 mL，温度为30℃，碳氮比为15，接种量为7.5%，菌株sari01对氨氮的去除率达到100%. 为了检验响应面法所得结果的可靠性，在此条件下进行了3次重复验证实验，去除率的平均值为99.9%，与理论值基本吻合，这说明该方程与实际情况拟合很好，充分验证了所建数学模型的可靠性，表明响应面法适用于对氨氮去除条件进行回归分析和参数优化.
2.4 菌株sari01硝化过程氮平衡分析菌株sari01硝化实验中的氮平衡分析如表 4所示. 以氨氮作为初始氮源，初始总氮浓度为239 mg·L-1. 培养结束后，氨氮质量浓度下降到0.151 mg·L-1，同时伴有微量亚硝酸盐的积累，而羟胺和硝酸盐几乎无积累. 与初始总氮相比，在整个异养硝化-好氧反硝化过程中，33.7%的初始氮被转化成气体产物而去除，而剩下的66.3%的氮被菌株sari01转化为生物量，说明菌株sari01具有良好的异养硝化作用.
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表 4 以氨氮为唯一氮源时菌株sari01的氮平衡1) /mg·L-1 Table 4 Nitrogen balance of strain sari01 during the heterotrophic nitrification-aerobic denitrification using NH4+-N as the sole nitrogen source/mg·L-1 |
2.5 菌株sari01反硝化能力验证
以硝酸盐作为唯一氮源培养菌株sari01，培养过程中各组分变化如图 5(a)所示，培养24 h硝酸盐去除率为65.2%，8 h亚硝酸盐积累到1.24mg·L-1，12 h降到0.2mg·L-1，最后完全消耗. 相比于菌株Rhodococuus pyridinivorans CPZ24[25]只能将硝氮浓度由初始的50mg·L-1降解到16.6 mg·L-1，菌株sari01对硝氮的利用更具优势.
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图 5 以硝酸盐和亚硝酸盐为唯一氮源，菌株sari01的生长以及脱氮性能 Fig. 5 Growth of strain sari01 and its nitrogen removal performance using nitrate and nitrite as the sole nitrogen source |
以亚硝酸盐为唯一氮源培养菌株sari01，结果如图 5(b)所示，初始亚硝酸盐氮为114mg·L-1，24 h亚硝酸盐去除率为98.4%，氨氮少量积累，无硝酸盐和羟胺的累积. 相比于菌株Serratia marcescens N-2[26]以初始浓度为50mg·L-1亚硝酸钠为氮源时，72 h后对亚硝氮的去除率可达 98.52%，菌株sari01降解亚硝氮的能力更强.
说明菌株sari01能够利用高浓度的氨氮以及低浓度的硝酸盐和亚硝酸盐生长以及反应，以氨氮为底物时，菌株sari01的生长量最大，反应效率最高，亚硝酸盐、 硝酸盐次之.
3 讨论单因素实验表明菌株sari01在柠檬酸为唯一碳源时脱氮效率最高，但其也能在葡萄糖和蔗糖为碳源条件下生长，能够适应更广泛的底物. 而报道较多的异养硝化菌Acinetobacter junii YB[18]在葡萄糖为碳源条件下是基本不能生长的，极大地限制了该菌株的应用.
通过培养条件的优化实验，初步确定了各培养条件对菌株sari01氨氮去除率的影响水平范围. 通过响应面实验优化表明，4个因素对菌株sari01氨氮去除率的影响顺序依次为温度、 碳氮比、 溶氧和接种量，其中温度影响最显著，最佳温度为30~37℃左右，与Providencia rettgeri YL[27]和A. faecalis sp.[28]的最佳脱氮温度一致.
目前许多筛出的异养硝化菌耐受氨氮浓度不够高，报道的大多数菌株的初始氨氮质量浓度在100mg·L-1以内[13, 18, 29]. 配伍菌群(N4+N5+N6) [30]处理氨氮质量浓度为446.9mg·L-1的合成废水，52 h降至0.61mg·L-1，氨氮去除率达到99.8%，总氮去除率为66.5%，表现出很好的耐受高氨氮能力及去除氨氮的性能. 比较而言，前者是配伍菌群(N4+N5+N6) ，废水中氨氮浓度最高只报道了450mg·L-1； 而本实验中筛选的菌株sari01可以适应1000 mg·L-1以内的初始氨氮浓度，其氨氮耐受范围很宽.
总氮平衡表分析表明，33.7%总氮被菌株sari01转化为气体脱除，这些氮可能是通过异养硝化和好氧反硝化的耦合作用转化为气体产物而被脱除的，而异养硝化的产物直接成为反硝化反应的底物. 现有研究表明，大多数菌株的氨氮脱除率在30%~50%. Kim等[11]研究的芽孢杆菌在初始氨氮质量浓度为50mg·L-1时，有33%的氮素通过异养硝化脱除，Chen等[7]研究的Agrobacterium sp.LAD9在初始氨氮质量浓度为97mg·L-1时，脱除率达到了49%，王弘宇等[31]筛得的菌株ZW2和ZW5经过60 h的培养对氮素的去除率可以分别达到 43.90%和48.52%. 以硝酸盐和亚硝酸盐作为唯一氮源的实验表明，菌株sari01能够在有氧条件下利用硝酸盐和亚硝酸盐，相比于菌株Acinetobacter sp.TN-14[32]只能在24 h内将硝氮从94.2 mg·L-1降到39.3mg·L-1，亚硝氮从反应初始浓度97.8mg·L-1下降到21.3mg·L-1，具有更好的好氧反硝化能力. 菌株sari01为污水处理用菌株提供了更多的选择.
4 结论(1) 从活性污泥中筛得1株异养硝化-好氧反硝化菌sari01，经鉴定为拉乌尔菌属(Raoultella sp.). 其氨氮耐受能力较强，能在高浓度(1000 mg·L-1)的氨氮溶液中生长及反应.
(2) 应用响应面法对菌株sari01去除氨氮的条件进行优化，当碳源为柠檬酸钠，C/N为15，pH为7.0~7.5，温度为30℃，溶氧以装液量计取50 mL，接种量为7.5%时菌株sari01降解氨氮效果最佳.
(3) 在最佳条件下，氨氮去除率为99.9%，其中33.7%的氨氮被菌株转化成气体产物的形式去除，而剩下的66.3%的氨氮被菌株sari01转化为细胞内的生物量. (4) 菌株sari01能够利用亚硝酸盐和硝酸盐进行生长代谢，去除率分别为98.4%和65.2%，说明菌株sari01具有良好的反硝化能力.