2016, Vol. 37
2.九江市流域管理与生态保护重点实验室(九江学院), 九江 332005;
3.九江学院电子商务学院, 九江 332005;
4.中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 青岛 266101
2.Jiujiang Key Laboratory of Basin Management and Ecological Protection, Jiujiang University, Jiujiang 332005, China;
3.E-business Institute of Jiujiang University, Jiujiang 332005, China;
4.Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China
在当今环境污染中，水体污染已严重威胁着社会发展与人类健康，成为亟待解决的主要污染问题之一[1, 2]. 一直以来，金属污染因其危害大、 治理难等特点成为工业废水治理过程中的一大难题[3, 4]. 随着冶金、 电镀及核技术等的迅猛发展，水体重金属污染中钴元素污染也随之而来. 当钴离子浓度较高时会对植物产生毒害作用，危害人类健康. 目前的方法对于废水中Co2+的去除比较困难，普遍采用的物理-化学处理方法效果不佳[5]. 因此，治理工业废水中难处理、 高危害的金属污染问题成为净化废水的重中之重.
传统治理重金属工业废水的方法一般如化学沉淀、 溶剂萃取、 离子交换及膜分离等[6]. 这些技术由于金属去除不完全、 昂贵的设备及大量的试剂和能量需求等原因而难以应用[5, 7]. 一种以具有替代不可再生资源潜力的微藻净化为首的生物学方法，可克服传统物理-化学方法缺陷成为金属废水污染净化或恢复的研究热点[8, 9]. 利用微藻处理工业废水的同时，还可以固定CO2，生产生物燃料，这对缓解化石燃料短缺与改善水体环境都有重要意义[10]. 然而，前人研究表明通过传统的液体悬浮培养藻类净化富含金属废水，藻细胞生长受到抑制，生物产率较低[11]. 因此，寻求开发高效的微藻培养方式处理废水具有重要意义.
相比于传统液体悬浮培养，微藻的生物膜贴壁培养是一种新型培养模式. 不同的是，生物膜贴壁培养是根据光稀释与固定化的原理，将藻细胞与培养基相分离，并固定在一定生物膜材料上，极少量的培养基液体通过附着多孔材料的背面或内部滴入以使藻细胞处于半干湿润状态，并在一定光照强度与CO2浓度下进行生长的培养方式(图 1)，其在培养过程中的取样和培养后的培养液回收均比传统液体悬浮培养更为经济、 简便[12]. 前期对包括葡萄藻在内的多种藻类的生物膜贴壁培养进行了深入研究，其中葡萄藻可见光光能利用率最高可达14.9%，培养过程每生产1kg生物量所需培养基NaNO3仅为27.5g，生物产率和烃产率等也都优于传统培养方式[13]. 贴壁培养因为藻细胞与培养基相分离，利用废水进行微藻的生物膜贴壁培养，藻细胞培养完成后无需离心，具有一定优势. 在生产生物燃料的同时耦合处理环境废水，为工业废水处理净化提出新的尝试.
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图 1 葡萄藻生物膜培养装置示意 Fig. 1 Schematic of the attached cultivation device for B.braunii |
众多微藻中，葡萄藻因能产生大量的烃类而闻名. 从生物能源替代化石能源的角度，烃类燃料比脂肪酸甲酯更接近于传统化石燃料[14]. 而且葡萄藻生成的烃类燃烧后产热值高且对大气CO2含量无净增加，是一种非常有潜力的可再生能源[15, 16]. Sawayama 等[17]用经过二次处理的生活污水(second treated sewage,STS)培养葡萄藻，发现生活污水中的氮和磷含量大大减少，而同时有毒重金属元素砷、 铬、 镉等的浓度也大为降低. 本研究利用废水培养葡萄藻可以净化环境、 降低培养成本，以期为葡萄藻生物燃料生产奠定基础.
本文结合贴壁培养反应装置的特殊性及前人的实验研究，主要考察了电镀厂排放的含钴工业废水对葡萄藻贴壁培养生长及烃积累情况的影响，以期净化工业水环境，在生产生物燃料的同时降低葡萄藻贴壁培养工艺成本.
1 材料与方法 1.1 藻种来源与培养藻株： A品系葡萄藻(Botryococcus braunii SAG 807-1，A race)购买于德国哥廷根大学.
葡萄藻种子液培养： 将培养至对数期葡萄藻接种于含Chu 13培养基的玻璃柱800 mL(高80 cm×直径5 cm)中[13]，使其初始培养浓度约0.1 g·L-1，温度(25±1) ℃，连续光照强度(100±10) μmol·(m2·s)-1，通入含有1%(体积分数)CO2的压缩空气(0.1 MPa)，气体流速为1 mL·s-1，培养液的pH值约为7.5.
1.2 葡萄藻贴壁培养及生物量测定葡萄藻的贴壁培养反应装置如图 2所示，一长0.4 m，宽0.2 m，厚3 mm的玻璃板置于0.5 m×0.3 m×0.05 m的玻璃腔中，玻璃板的一面附有滤纸，并接受正上方的光照. 将葡萄藻藻种接种到醋酸纤维素膜上，贴于附着在玻璃板的滤纸上，将附有藻种的玻璃板放入玻璃腔室内，为保障玻璃腔室内的稳定环境，用保鲜膜封住玻璃腔的一面. 二氧化碳混合气通过玻璃腔的小孔进入培养室，培养基通过循环泵滴加(培养基循环使用). 为了培养液更好均匀地渗入藻细胞内，将玻璃培养腔放置一定倾斜角度，荧光灯置于培养腔正上方提供光源. 贴壁培养条件与种子液培养条件相同.
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图 2 葡萄藻贴壁培养实验装置 Fig. 2 Test device of attached cultivation for B.braunii |
葡萄藻生物量测定： 将孔径0.45 μm，面积0.001 m2的醋酸纤维膜煮沸3次后，在105℃ 烘箱中烘至恒重(W1)，将待测藻样(DW)用蒸馏水冲洗完全入干净烧杯中，并倒入抽滤装置内抽滤至已称重的膜上，将附有藻的膜放入105℃ 烘箱中烘至恒重(W2)，用分析天平称量藻样的重量(g·m-2)：
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(1) |
将葡萄藻溶液于2500 r·min-1离心8 min，洗涤离心3次后收集藻体，然后进行冷冻干燥. 称取一定质量的干燥藻粉，加入正己烷超声15 min，1500 r·min-1离心10 min后，收集正己烷提取液，提取过程重复3~4次，直到提取液无色，合并正己烷提取液，25℃ 水浴下旋转蒸发掉正己烷，室温下用氮气吹干所剩残余，称其重量即为“粗烃”质量，计算后得到粗烃含量. 本研究中涉及到的“烃”如无特殊说明均指“粗烃”.
粗烃经硅胶柱(硅胶粒度200～300目，层析柱尺寸10 mm×100 mm，正己烷为流动相)纯化，收集黄色条带出来之前的所有样品，25℃ 旋转蒸发掉正己烷，氮气吹干所剩残余，称重得到“纯烃”质量，计算后得到纯烃含量[18, 19]. 然后硅胶柱分别用氯仿和甲醇进行洗脱，分别收集洗脱后的样品，旋转蒸发、 氮气吹干，称重，即得非极性脂肪酸和极性脂肪酸含量[20].
GC/GC-MS 分析[21, 22]： 气相色谱为安捷伦7890A，检测器为 FID 检测器，所得到的纯烃溶于色谱纯的正己烷中，色谱柱为Agilent HP-5-二苯基聚硅氧烷共聚物色谱柱(30 m×0.25 id)，进样口温度240℃，检测器温度250℃； 初始温度130℃ (5 min)，然后以8℃·min-1 的速度升到200℃ (2 min)，再以5℃·min-1的速度升到280℃ (20 min). 质谱条件： 电子能量70 eV，质荷比m/z范围40～600，结果鉴定对比已报道谱图.
1.4 葡萄藻贴壁培养基中N浓度与Co2+浓度的测定葡萄藻贴壁培养液中氮含量的测定方法参照Collos等[23]的实验研究. 准确量取2 mL培养液，10000 r·min-1下离心5 min，收集上清液在220 nm下分光光度计测定，氮的浓度参照以下公式：
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(2) |
式中,c是氮浓度(mmol·L-1).
葡萄藻贴壁培养液中钴浓度的测定参照Wang等[24]的离子色谱法.
1.5 工业废水应用于葡萄藻的贴壁培养将葡萄藻种子液培养14 d后，在温度(25±1) ℃，连续光照强度(100±10) μmol·(m2·s)-1，1% (体积分数)CO2条件下接种于二次工业废水中(由青岛黄岛废水处理厂提供)，培养8 d后，研究葡萄藻贴壁培养生长及烃类积累情况.
1.6 统计分析和数学计算本实验中，多组数据间差异显著性分析利用 SPSS 11.0(SPSS Inc.,Chicago,Illinois,USA)的方差分析(ANOVA)程序完成，当 P<0.05 时表示差异显著. 实验中，曲线作图及拟合用 Sigmaplot 8.0(SPSS Inc.,Chicago,Illinois,USA)完成.
2 结果与讨论 2.1 工业废水贴壁培养葡萄藻本研究首先将青岛黄岛废水处理厂提供的二次工业废水与正常Chu 13培养基在相同条件下贴壁培养，其中工业废水各主要参数指标见表 1. 相比于正常Chu13培养基，工业废水培养基(表 1)中Co2+浓度为0.86 mg·L-1，明显高于正常Chu 13培养基中Co2+浓度(约为0.09 mg·L-1).
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表 1 工业废水各主要参数指标 Table 1 Content of different components in industrial wastewater |
实验研究工业废水与正常培养基下贴壁培养葡萄藻生长与烃积累情况. 由图 3(a)与3(b)可知，葡萄藻在工业废水及正常Chu 13培养基下长势相当，培养8 d后工业废水贴壁培养葡萄藻生长状况略优于正常培养基下培养，分别约为6.0 g·(m2·d)-1与5.6 g·(m2·d)-1. 对于烃类积累而言[图 3(c)]，葡萄藻在工业废水中烃含量高于正常Chu 13培养基中的含量，分别约是60.2%和51.2%； 而相应的工业废水贴壁培养葡萄藻烃产率为3.6 g·(m2·d)-1，高于正常Chu 13培养基中的2.9 g·(m2·d)-1.
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图 3 工业废水对葡萄藻贴壁培养生长与烃积累的影响 Fig. 3 Effect of industrial wastewater on the growth and hydrocarbon accumulation of B.braunii with biofilm attached cultivation |
同时，还观察了葡萄藻在工业废水与正常Chu 13培养基贴壁培养8 d的细胞显微图(图 4). 从图 4的光学显微照片可看出，葡萄藻在正常Chu 13培养基中贴壁培养藻细胞较为鲜绿[图 4(a)]. 整个藻体细胞串状集落生，类似成串葡萄，由形态不规则且长短各异的绳索状透明胶质部分(折射绍丝)连接而成外型不规则或略近球形的复合集落. 相比较而言，葡萄藻在工业废水中培养，藻细胞中脱落在培养基中“杯鞘”较正常Chu 13培养基中的多； 而且培养基中分散的透明颗粒状堆积物也较正常培养基中多，这些或许是分泌烃类的产物.
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图 4 葡萄藻在工业废水与正常培养基贴壁培养下藻细胞显微图 Fig. 4 LM images of B.braunii in industrial wastewater and Chu 13 with biofilm attached cultivation |
葡萄藻在工业废水中贴壁培养生长与烃类的积累情况优于正常Chu 13培养基，这或许因为工业废水中氮等营养盐浓度优于正常Chu 13培养基. 值得注意的是，本研究工业废水中Co2+浓度相比较正常Chu 13培养基约高10倍，这是否是促进葡萄藻生长和烃积累的关键因素，具体原因需要设计实验研究.
2.2 Co2+浓度对葡萄藻贴壁培养生长影响为了进一步验证Co2+浓度对葡萄藻贴壁培养生长的影响，在上述实验基础上于正常Chu 13培养基中分别设计了不同钴浓度0.09(正常)、 0.18、 0.45、 0.90、 4.50、 45.00 mg·L-1对葡萄藻贴壁生长的影响(图 5). 由图 5可知，在相同条件下Co2+浓度从0.09 mg·L-1至4.50 mg·L-1均能支持葡萄藻贴壁培养较好的生长. 从图 5(b)可看出，在葡萄藻贴壁培养8 d内，Co2+浓度为0.09、 0.18、 0.45、 0.90 mg·L-1下生物产率相差不大，分别是6.9、 6.6、 6.5和 6.6 g·(m2·d)-1. 当Co2+浓度为4.50 mg·L-1时，葡萄藻贴壁培养前4 d内生物产率与正常培养相差不大，培养8 d后生物产率略微下降，约为5.5 g·(m2·d)-1； 当Co2+浓度为45.00 mg·L-1时，葡萄藻贴壁培养生长明显受到抑制，培养8 d后生物产率仅为0.98 g·(m2·d)-1. 由此可知，4.50 mg·L-1钴浓度对葡萄藻贴壁生长影响不大. 在此基础上，为进一步研究Co2+对葡萄藻贴壁培养烃合成的影响，实验选取Co2+浓度0.09 mg·L-1(正常)与4.50 mg·L-1(钴富余)为研究对象，研究烃积累情况及培养基中Co2+浓度变化情况.
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图 5 Co2+浓度对葡萄藻贴壁生长的影响 Fig. 5 Effect of cobalt concentration on the growth of B.braunii under attached cultivation |
在相同条件下，本实验研究了Chu 13培养基中钴富余(4.50 mg·L-1)与正常培养(0.09 mg·L-1)下烃积累的情况(图 6).从图 6可看出，随着培养时间的延长无论是Co2+富余还是正常下烃的含量都增加，但烃含量在Co2+富余下相对较高.培养8 d后，葡萄藻贴壁培养在Co2+富余与正常浓度下烃含量分别是52.9%、43.2%.因为Co2+富余下生物产率低于正常的，因而其对应的烃产率与正常Co2+浓度相当，分别约是2.8 g·(m2·d)-1、 2.9 g·(m2·d)-1 [图 6(b)].
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图 6 Co2+对葡萄藻贴壁培养烃含量、 烃产率的影响 Fig. 6 Effect of cobalt on the content of hydrocarbon and productivity of hydrocarbon for B.braunii with attached cultivation |
一般地，A品系葡萄藻所产烃类为C25-C31奇数二烯和三烯类化合物. 本实验中A品系葡萄藻在Co2+富余与正常浓度下贴壁培养所合成烃构架如图 7所示. 从中可知，Co2+富余下C31含量约为24.9%，高于Co2+含量正常下的15.3%； C27的含量低于正常Co2+浓度下的量，分别约为13.9%与18.0%； 而C29下的含量在两种Co2+浓度下相当. 总体来说，其它类型的烃类含量正常Co2+浓度下略高于Co2+富余下的量. Dennis等[25]认为一定的高Co2+浓度可以提高钴-卟啉复合酶的活性，进而促进脂肪醛到烃类的转换. 因此，4.50 mg·L-1 Co2+促进了葡萄藻长链烃等的合成.
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图 7 Co2+对葡萄藻贴壁培养烃构架的影响 Fig. 7 Effect of cobalt on the hydrocarbon profile of B. braunii with biofilm attached cultivation |
本研究葡萄藻贴壁培养在Chu 13培养基中Co2+富余(4.50 mg·L-1)与正常情况下(0.09 mg·L-1)培养基中N、 Co2+的消耗情况(图 8). 由图 8(a)可知，葡萄藻在Co2+富余下培养，Co2+浓度在前2 d急剧下降，而在随后的6 d中Co2+浓度减少趋于平缓，培养8 d后最终Co2+浓度约为0.71mg·L-1. 这说明葡萄藻在Co2+富余浓度下的贴壁培养基中约85%的Co2+被去除. 结合生物产率计算，葡萄藻贴壁培养Co2+的结合能力为1473.9 μmol·g-1，远高于Carrilho等[26]的报道微藻P. littoralis的结合力560 μmol·g-1.
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图 8 葡萄藻贴壁培养下培养基中Co2+、 N含量的变化情况 Fig. 8 Effects of cobalt enrichment on the cobalt and nitrate concentrations in cultivation broth of B. braunii with biofilm attached cultivation |
从图 8(b)可看出，培养基中N含量的消耗在Co2+浓度富余情况下消耗速率低于正常值，但最终趋势类似，N浓度均从最初的1.98 mmol降到约0. 通过比较图 8发现，在当培养基中Co2+含量变化不大后，N的消耗继续直至消耗殆尽. 这可能是因为培养基中Co2+的消耗伴随着离子交换，当培养基中Co2+浓度较高时阻止N通过位于细胞膜上的离子通道输出细胞[27]. 由此可知，葡萄藻贴壁培养或许在钴元素去除方面比其它培养方式更有优势.
3 结论(1) 葡萄藻贴壁培养对工业废水中重金属钴元素的去除效率较高，而且可以促进生物燃料烃类的合成. 在利用藻类生产生物燃料的同时，去除工业废水中N、 P及重金属元素，可为绿色高能燃料烃类的生产与工业废水处理耦合提供理论基础，为工业废水处理提供“绿色生态”途径.
(2) 葡萄藻贴壁培养可处理含钴工业废水，一定范围内Co2+浓度(<4.5 mg·L-1)对藻细胞生长影响不大，反而有利于烃类的合成. 4.5 mg·L-1 Co2+可以促进葡萄藻长链烃类的合成，提高烃产量.
(3) 葡萄藻贴壁培养去除工业废水中Co2+的能力为1473.9 μmol·g-1，远高于报道的微藻P. littoralis.