2016, Vol. 37
2.河海大学环境学院, 南京 210098;
3.南京信息工程大学环境科学与工程学院, 南京 210044;
4.临沂市环境保护科学研究所有限公司, 临沂 276000
2.College of Environment, Hohai University, Nanjing 210098, China;
3.School of Environmental Science and Engineering, Nanjing University of Information Science & Technology, Nanjing 210044, China;
4.Linyi City Environmental Protection Science Research Institute Co., Ltd., Linyi 276000, China
酸中和残渣(NUA)和脱水铝污泥(DAS)分别来自于生产金红石过程中产生的残渣和自来水厂净水过程中的副产物. NUA和DAS成分相似，含有丰富的铝、 铁和钙等物质，目前大部分也被视为废弃物填弃[1]. 上述两种副产物都有较大的比表面积，对污水中的污染物有一定的吸附能力[2~5],已被用作人工湿地滤料去除污水中污染物[6, 7]，并被证明该滤料几乎不存在有毒物质和重金属释放的风险[8]. 氮素是污水污染物中受关注度最高、 转化最复杂的成分之一. 从除氮方式上来说，利用微生物进行生物脱氮是重要途径之一，即通过硝化反硝化等脱氮菌的联合作用使污水中的含氮污染物转化为氮气的过程，此过程是防止氮素污染的最好手段之一[9, 10]. 在整个脱氮过程中，反硝化作用是其中重要环节，是一种微生物异化氧化还原过程，它以氮氧化物作为电子受体，将硝酸盐或亚硝酸盐逐步还原为氧化亚氮或者氮气[11]. 具体过程如下：
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该过程由 4 种金属酶催化完成，编码这些金属酶的基因主要是： 硝酸盐还原酶编码基因narG和napA (nitrate reductases)，亚硝酸盐还原酶编码基因nirS和nirK (nitrite reductases)，一氧化氮还原酶编码基因norB和norC (nitric oxide reductases)，氧化亚氮还原酶编码基因nosZ (nitrous oxide reductases). 其中亚硝酸盐还原酶是反硝化作用的关键限速反应酶，氧化亚氮还原酶能催化温室 N2O 生成无害的N2，因而对亚硝酸盐还原酶和氧化亚氮还原酶编码基因nirS、 nirK和nosZ的研究具有重要意义.
本研究将NUA和DAS作为人工湿地滤料对模拟畜禽养殖废水进行脱氮效果分析，重点探究含3类基因(nirS、 nirK和nosZ)反硝化菌在NUA-DAS生态滤池系统中群落特征，以期为该系统中反硝化脱氮过程提供更加微观的理论支持.
1 材料与方法 1.1 实验滤料实验所采用的两种滤料NUA和DAS分别取自江苏连云港市某金红石厂和南京市某自来水厂，取来之后晾干，去除部分水分，再对NUA和DAS进行烘干、 研磨，用筛网过筛(NUA 的粒径<63 μm，DAS 粒径<0.25 mm)后用于NUA-DAS生态滤池装置系统中. 实验分别称取100 mg NUA及100 mg DAS，将其放入105℃的烘箱中烘干恒重进行测定，然后用王水进行消解至溶解，消解后的样品利用原子吸收分光光谱(ICP-MS)、 扫描电子显微镜 (SEM)、 比表面积分析仪 (BET)、 X射线能量色散谱仪 (EDS)、 电子能谱仪 (XPS)和红外光谱仪 (FTIR)进行测定[12]，得出其比表面积和化学组分.
其中NUA的测定比表面积为720 m2·g-1，化学组分中含有29.8% SiO2、 11.8%Al2O3、 15.5% Fe2O3和8.03% CaO； DAS的测定比表面积为1500 m2·g-1，化学组分中含有55.91% SiO2、 18.96%Al2O3、 5.11% Fe2O3和4.05% CaO.
1.2 NUA-DAS生态滤池装置构建该装置主要包括储水池、 NUA一级滤池和DAS二级滤池，该滤池采用有机玻璃材料制备，呈现圆柱形，直径12 cm，每个滤池高度90 cm. 两装置自上而下均为10 cm 布水区、 70 cm 反应层、 10 cm 鹅卵石承托层，每个装置布置下端各有一个出水口，分别为出水口1和总出水口，各装置有效反应容积均为7.5 L. 实验装置见图 1. 实验进水采用模拟含氮废水，具体指标见表 1.
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图 1 酸中和残渣-脱水铝污泥生态滤池结构 Fig. 1 Structure of NUA-DAS ecofilter |
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表 1 模拟含氮废水进水水质指标/mg·L-1 Table 1 Influent water quality of simulated nitrogen-containing wastewater/mg·L-1 |
1.3 运行方法
进水采用分析纯氯化铵(NH4Cl)、 磷酸二氢钾(KH2PO4)、 硝酸钠(NaNO3)、 亚硝酸钠(NaNO2)、 葡萄糖(C6H12O6·12H2O)试剂配制成模拟含氮废水，通过蠕动泵控制进水流量，水力负荷为1 m3·(m2·d)-1，定时控制器控制进水时间，NUA滤池和DAS滤池为串联式均由蠕动泵加压后重力自流式布水； 一个运行周期为24 h，首先关闭NUA装置阀门对NUA滤池进行布水，布水6 h完毕，在NUA滤池停留6 h后打开NUA装置阀门，再对DAS滤池进行布水同样用时6 h，最后在DAS滤池中停留6 h 完成一个周期运行； 整个装置运行过程中溶解氧控制在0.5mg·L-1； pH在6.5～8.0之间； 整个系统连续运行60 d，运行期间温度范围是15～25℃.
1.4 取样与数据分析运行周期内每隔3 d从出水口1和总出水口取样分析，监测两种滤料协同作用下各自装置出水中COD、 NO3--N、 TN的浓度变化，计算有机物及氮素去除效果. 依据文献[13]，本实验COD、 NO3--N、 TN浓度分别采用重铬酸盐法、 紫外分光光度法和凯氏消煮法测定. 每个样品分为3个平行样，每个指标测定 3 次，取平均值.
系统运行60 d期间，以初始、 运行30 d和60 d共计3个取样时间点，运行周期内从两装置不同滤料层中提取少量基质，其中取样点1为0~20 cm 处理层，取样点2为20~40 cm 处理层，取样点3为40~60 cm 处理层，共计3个取样点. 对各个样品预处理后，在无菌条件下称取5 g的样品，采用试剂盒(MO BIO Laboratories,Loker Ave West,Carlsbad,CA,USA)进行DNA 提取，提出的DNA 作为PCR 的模板进行反硝化菌(nirS、 nirK和nosZ)扩增，选用的引物分别是Cd3aF-R3cd(nirS基因)、 FlaCu-R3Cu(nirK基因)、 nosZ-F-NosZ1622R (nosZ基因)，后续利用基因系统(Bio-Rad 公司，美国)开展DGGE 技术分析. 最后根据DGGE凝胶电泳图得到的各条带数算出丰富度指数，并通过Quantity One软件计算得到戴斯系数(CS)[14]，评价样品之间微生物种群的相似性. 计算公式为：
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(1) |
式中，j为泳道A和泳道B的共有条带，a和b分别为样品A和B中各自的条带数.
2 结果与讨论 2.1 COD、 TN及NO3--N的去除效果 2.1.1 CODNUA-DAS系统生态滤池对污水中COD去除如表 2所示，NUA装置处理后COD去除率范围是15%~55%，经两个滤料层后COD总去除率为17%~81%. 该生态滤池对有机物的高效去除是物理、 化学以及微生物共同作用的结果，这个过程包括对细小颗粒状、 胶质有机物的吸附，有机物的氧化还原和微生物的作用. NUA和DAS发挥主要作用是由于两种滤料具有较高的孔隙率和比表面积，NUA和DAS的比表面积分别为720m2·g-1和1500 m2·g-1，利于有机污染物通过沉淀和吸附截留在滤料空隙中，其中DAS较NUA比表面积更大，相比更利于废水中污染物的吸附和截流. 通过XRF分析得出两种滤料的主要化学成分均为铝、 铁、 硅、 钙、 镁、 钾、 钠、 锰等元素，使得其吸附扩散速率较大，吸附点位较多，有利于吸附反应的进行[15]. 同时加上微生物的硝化反硝化作用，可提高有机物的去除效果[16].
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表 2 NUA装置及总系统对污水中COD去除率 Table 2 Removal rates of COD from sewage via apparatus 1 and the whole system |
系统运行前10~15 d为微生物挂膜阶段，在此期间微生物开始生长繁殖，新陈代谢不稳定，对有机物去除率较低； 随着微生物不断生长繁殖，对有机 物的去除效果逐渐增加[17]，NUA装置中COD去除率由15%增长至55%左右，系统COD总去除率由17%增长至81%左右，并稳定运行. 由于温度对厌氧微生物的影响比对好氧微生物的影响大得多，随着温度的降低，微生物活性下降，对COD的去除效率随之下降[18]. 实验后期，随着天气的温度降低，微生物活性下降，有机物去除效果下降，COD总去除率维持在60%左右.
2.1.2 TNNUA-DAS生态滤池系统中TN的去除需要经过氨化作用、 硝化作用和反硝化作用，大部分总氮以氨氮的形式表现，大量的氨氮和有机态氮通过硝化反应转化为NO3--N，后续通过反硝化转化为氮气. 如表 3所示，NUA装置中TN去除率范围是31%~49%，系统总去除率范围是44%~77%，其中NUA装置的TN去除贡献率在50%左右，DAS装置的TN去除贡献率也为50%左右.
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表 3 NUA装置及总系统对污水中TN去除率 Table 3 Removal rates of TN from sewage via apparatus 1 and the whole system |
2.1.3 NO3--N
本实验硝态氮在NUA装置和总出水中的浓度范围分别是0.11~1.18mg·L-1和0.02~0.55mg·L-1，在两个装置中NO3--N被充分反应，仅有少量的NO3--N积累. 系统装置对NO3--N的平均去除率达到90%以上，具体见表 4. 两种滤料都有较大的比表面积，对污染物有一定的吸附能力，能够给微生物提供一个较好的生长繁殖空间. 对于DAS，Bai等[19]用实验证实了其对污水有很好的脱氮效果，并且实验中反硝化为主要的脱氮途径速率达到2.19 g·(m3·d)-1. 对于NUA，Wendling等[20]研究显示其对水中含氮化合物有较高的去除效果，进水中82%的硝态氮通过NUA被去除.
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表 4 NUA装置及总系统对污水中NO3--N去除率 Table 4 Removal rates of NO3--N from sewage via apparatus 1 and the whole system |
2.2 滤料中3类基因反硝化菌的特征
实验利用 PCR-DGGE 分子生物学技术[21, 22]来考察该实验装置中的微生物种群结构，经过对切胶测序比对、 凝胶图谱分析，考察该实验装置滤料层中含3类基因(nirS、 nirK和nosZ)的反硝化菌群落特征，包括丰富度以及相似度分析.
2.2.1 丰富度分析图 2分别为nirS、 nirK和nosZ基因的DGGE凝胶电泳图，其中D11~D13和D21~D23分别代表运行30 d及60 d的脱水铝污泥上层、 中层和下层的样品； N11~N13和N21~N23分别代表运行30 d及60 d的酸中和残渣上层、 中层和下层样品； D0和N0代表初始脱水铝污泥和初始酸中和残渣样品. PCR-DGGE图谱中的每一条带代表一个可能的细菌类群或可操作分类单元，条带数越多说明生物多样性越丰富[23]. 从图谱检测结果可以看出每一个样品中所包含的3类基因的条带数量，表 5为样品所对应的丰富度指数. 本研究中nirS、 nirK和nosZ这3个基因图谱里各自共识别出46类、 52类和79类不同条带. 初始DAS样品中nirS、 nirK和nosZ的丰富度指数分别为5、 8、 8，初始NUA样品中只有nirK检测到条带，对应的丰富度指数为12. 除初始样，其他各个样品泳道中检测出nirS、 nirK和nosZ所对应的丰富度指数分别为15~29、 15~31、 22~43不等，这表明在系统运行30 d和60 d滤料层中，nirS、 nirK和nosZ基因反硝化菌的丰富度均有明显增加. 对两种滤料进行比较分析，无论是30 d还是60 d，两种滤料里的反硝化菌丰富度基本保持一致； 从上、 中、 下这3个滤料层之间进行丰富度对比分析，在30 d和60 d的各滤料层中反硝化菌丰富度同样变化不大，这说明在系统运行30 d和60 d过程里，各个滤料层中反硝化菌的丰富度基本相同. 亚硝酸盐还原酶nir是催化亚硝酸盐还原为氧化氮这一反硝化反应的关键酶，经常被应用于反硝化微生物多样性研究[24, 25]，nirS和nirK这两个基因编码是具有相同功能的亚硝酸盐还原酶，因此它们也经常用于相互比较. 在胡春晓等[26]和Maeda等[27]的实验中，对两种亚硝酸盐还原酶数量的检测结果均为nirK编码的反硝化菌数量大于nirS反硝化菌. 作者对丰富度的研究中发现，在nirS条带图谱中共识别出46类不同条带，除初始样各个样品中nirS丰富度指数从15~29不等； 在nirK条带图谱中共识别出52类不同条带，除初始样各个样品中nirK丰富度指数从15~31条不等. 实验样品中nirK的丰富度要大于nirS，尤其是在系统运行60 d的样品中，该结果更为明显，这一结果与前人的研究一致. 与此同时，实验样品中检测出大量一氧化二氮还原酶nosZ. 以往研究表明，并不是所有已鉴定的反硝化细菌中都含有完整的反硝化酶编码基因，约1/3的菌种不含有nosZ[28, 29]，而作者在实验运行30 d和60 d的样品中检测到的nosZ条带数较nirS、 nirK更为丰富. 这种差异可能与滤料所处的环境和营养物浓度有关[30].
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图 2 nirS、 nirK、 nosZ基因组DGGE凝胶电泳图 Fig. 2 DGGE gel electrophoresis of nirS，nirK，nosZ |
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表 5 nirS、 nirK、 nosZ丰富度指数 Table 5 Species richness of nirS,nirK,nosZ |
2.2.2 群落相似性分析
表 6、7、8分别为nirS、 nirK和nosZ基因反硝化菌的戴斯相似性系数，各样品间的细菌群落相似性系数不尽相同，相似系数越大，说明反硝化菌的群落结构越相近，反硝化菌对滤料的适应能力越强. 这里以同一滤料在系统运行30 d和运行60 d的戴斯相似性系数为研究对象，从表 6~8中可以发现，同一运行时间里样品的戴斯相似性系数与不同运行时间里样品的戴斯相似性系数并无太大差别，说明运行时间对反硝化菌的群落结构影响并不明显； 同一种滤料的不同层级之间的戴斯相似性系数大部分小于50，说明空间位置对反硝化菌的群落结构有一定影响. 让位置空间不变，比较3类基因运行30 d和60 d的戴斯相似性系数，nirS在DAS滤料上、 中、 下3层中的戴斯相似性系数分别为27.4、 32.1、 37.3，在NUA滤料上、 中、 下3层中的戴斯相似性系数分别为32.2、 59.5、 56.5； nirK在DAS滤料上、 中、 下3层中的戴斯相似性系数分别为39.6、 73.6、 76.5，在NUA滤料上、 中、 下3层中的戴斯相似性系数分别为30.5、 55.1、 84.8； nosZ在DAS滤料上、 中、 下3层中的戴斯相似性系数分别为21、 42.9、 45.7，在NUA滤料上、 中、 下3层中的戴斯相似性系数分别为22.9、 59.4、 64.6. 比较得出，3类基因中nirK基因反硝化菌对滤料环境的适应能力最强. 两种滤料(NUA和DAS)比较发现反硝化菌在NUA中的适应能力优于DAS.
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表 6 nirS戴斯相似性系数 Table 6 Dice Coefficient of nirS |
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表 7 nirK戴斯相似性系数 Table 7 Dice Coefficient of nirK |
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表 8 nosZ戴斯相似性系数 Table 8 Dice Coefficient of nosZ |
3 结论
(1) 采用以脱水铝污泥和酸中和残渣为填料的生态滤池对含氮废水有很好的去除效果，装置出水中COD、 TN的平均去除率分别达到60%和70%，NO3--N去除率高达95%以上.
(2) 系统运行30 d和60 d时，nirS、 nirK和nosZ基因反硝化菌丰富度均有明显增加，且各个滤料层中反硝化菌的丰富度基本相同. NUA和DAS滤料中检测出的3类基因丰富度指数大小均为nosZ>nirK>nirS.
(3) 运行时间对反硝化菌的群落结构影响并不明显，但空间位置对群落结构有一定影响. 反硝化菌在NUA中的适应能力优于在DAS中，且3类基因中nirK基因反硝化菌对滤料环境的适应能力最强.