2016, Vol. 37
2.江苏省水处理技术与材料协同创新中心, 苏州 215009;
3.浙江省水体污染控制与环境安全技术重点实验室, 杭州 310058
, ZHANG Hai-qin1 , WANG Yao-qi1 , YU Xu-liang1 , WANG Jian-fang1,2 , SHEN Yao-liang1,2
2.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Technology and Material of Water Treatment, Suzhou 215009, China;
3.Key Laboratory for Water Pollution Control and Environmental Safety, Zhejiang Province, Hangzhou 310058, China
厌氧氨氧化反应(anaerobic ammonium oxidation，ANAMMOX)在废水脱氮过程中应用优势明显[1, 2]. 但ANAMMOX菌生长缓慢(最大比生长率仅0.0027 h-1)、 倍增时间长(10～12 d)，导致厌氧氨氧化反应器启动耗时长且功能菌难以富集[3]，成为限制厌氧氨氧化处理工艺大规模应用的最主要因素[4]. 因此，如何选择合适的反应器，降低ANAMMOX菌的流失，是成功应用厌氧氨氧化过程的关键. 而厌氧折流板反应器(anaerobic baffled reactor,ABR)具有可耐受较高的污染负荷、 良好的生物截留能力、 易于固液分离、 易形成颗粒污泥等特点，对培养增殖速度缓慢的ANAMMOX菌具有较好的菌体持留能力，已经应用于厌氧氨氧化研究，表明ABR反应器在低基质浓度快速启动、 ANAMMOX污泥流失率降低及不同负荷氮素稳步去除等方面具有显著优势[5, 6].
高通量测序技术作为新型微生物种群鉴定技术，具有分析结果准确、 高速、 高灵敏度和高自动化等特点，在环境微生物鉴定领域应用广泛[7, 8]. 同时，该技术也已经应用于厌氧氨氧化反应器微生物群落结构的检测，取得了较好的应用效果[9]. 而在ABR厌氧氨氧化反应器各隔室微生物的分布方面，还未有相关研究. 本研究拟采用Miseq高通量测序分析，定性并定量研究ABR反应器启动厌氧氨氧化成功并稳定运行后，各隔室微生物的分布情况，以期为ANAMMOX微生物在ABR反应器的分布规律提供理论支持.
1 材料与方法 1.1 污泥来源本研究污泥取自5隔室ABR反应器，反应器由有机玻璃制成，长37.5 cm，宽8 cm，高度33 cm，持水高度26.5 cm，有效容积6.36 L，每隔室升流区降流区格间宽度比为4∶1，折流板导向角45°，见图 1. 为保证ANAMMOX菌适宜生存的温度，ABR反应器置于水浴维持温度30-35℃，启动初期接种取自UASB反应器的厌氧颗粒污泥和城市污水处理厂A2/O工艺的厌氧污泥作为混合污泥(1∶3质量比混合).
|
图 1 ABR反应器装置示意 Fig. 1 Schematic of anaerobic baffled reactor |
ABR反应器采用连续流方式运行，原水采用人工模拟配水，控制较低的进水基质浓度，进水NH4+-N和NO2--N浓度分别控制在55 mg·L-1和60 mg·L-1，水力停留时间(HRT)为48 h[10]. 120 d后，ABR反应器启动厌氧氨氧化获得成功并进入稳定运行期. 稳定运行期间，通过缓慢降低HRT至5 h，反应器表现出较强的TN去除效果，对TN的去除率＞80%，TN去除负荷达504.8 g·(m3·d)-1. 按照各隔室对氮素的去除贡献来看，NH4+-N和NO2--N基本在第1-2隔室被去除，对氮素的去除贡献率分别为97%和2%，后端第3-5隔室的脱氮贡献率不明显，见表 1.
|
表 1 ABR反应器各隔室脱氮效率 Table 1 Nitrogen removal efficiency in each compartment of ABR reactor |
1.2 Miseq高通量测序分析方法 1.2.1 样品采集及DNA提取
取稳定运行期的ABR反应器各隔室中污泥，污泥经过多点采样混合作为该隔室样品，5个隔室的污泥样品分别标记为A-1、 A-2、 A-3、 A-4和A-5. 样品总DNA的提取采用FastPrep DNA提取试剂盒法(QBIOGENE，USA)DNA，并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提的基因组DNA，核对基因组DNA 的完整性与浓度.
1.2.2 PCR扩增采用16S RNA基因V3-V4区通用引物，16S rRNA 引物序列为： 338F(5′-ACTCCTRCGGGA GGCAGCAG-3′)，806R (5′-GGACTACCAGGGTATC TAAT-3′)[11, 12]. 采样PCR仪(ABI GeneAmp 9700型)对细菌16S rRNA基因进行PCR扩增，扩增反应体系(50 μL)为： Premix 25 μL，引物1 μL，模板DNA 5 μL，加入蒸馏水18 μL.
全部样本按照已摸索的正式实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱； 2%琼脂糖电泳检测.
参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，之后按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合.
1.2.3 Miseq文库构建连接“Y”字形接头； 使用磁珠筛选去除接头自连片段； 利用PCR扩增进行文库模板的富集； 氢氧化钠变性，产生单链DNA片段.
1.2.4 Miseq测序按照Illumina公司 Miseq的操作说明对形成的cDNA文库进行2×300 bp的高通量测序，测序后的DNA 序列进行拼接，同时用Qubit 2.0 (Life technologies,USA)和Bioanalyzer 2100 (Agilent,Germany)进行质量控制，并按照barcode 标签序列识别并区分样品得到有效数据. 利用CASAVA 1.8软件，设置97%相似性，对有效DNA 序列数据进行操作分类单元(OTU) 分类. Miseq测序、 序列拼接及OTU 分类均由苏州帕诺米克生物科技有限公司完成.
2 结果与讨论 2.1 ABR各隔室污泥表观现象分析ABR反应器接种的厌氧颗粒污泥和厌氧絮状污泥分别是黑色和灰黑色，混合后的接种污泥为暗黑色. 启动过程中，污泥颜色从暗黑色变为淡黄色，然后逐渐变为棕红色，在稳定运行期红颜色逐渐加深，因厌氧氨氧化污泥含有丰富的细胞色素C而呈现红色(图 2)[13]. 然而，在各隔室污泥的表观颜色上具有明显差异，第1隔室有较为明显的红棕色，随着水流的方向，从第2-5隔室，反应器污泥颜色变化依次为少量红棕色→黄褐色→黑色，这是由于采用低浓度基质(进水NH4+-N和NO2--N浓度分别为55mg·L-1和60 mg·L-1)启动厌氧氨氧化反应器，ANAMMOX菌主要集中在基质浓度较高的第1隔室，造成第1隔室内表观红色强于其余隔室[14]. 而后端隔室基质浓度较低，ANAMMOX菌富集率过低，难以表现出红色.
|
图 2 ABR反应器稳定运行期各隔室污泥表观现象 Fig. 2 Sludge pictures of each compartment during stable operation in ABR |
从表 2可以看出，ABR反应器5个隔室的序列数和OTU数差异较大，在12195-39495和9690-31697之间波动，特别是第3隔室(样品A-3) ，序列数和OTU数均较低，造成该ABR反应器中间隔室“低谷”的具体原因还有待分析. Chao、 ACE、 Shannon、 Simpson指数表明各隔室细菌群落和物种的丰富度，其中丰富度指数Chao和ACE可以估算群落中含OTU 数目的指数，在生态学中常用来估计物种总数，值越大代表物种总数越多[15]. 从该两个指数来看，从第1-5隔室，细菌多样性总体上呈现持续上升趋势，上升幅度分别为29.8%和30.1%，而在第3隔室存在低谷，这与序列数和OTU数结果相一致. Shannon指数反映了基于物种数量的群落种类多样性，指数越大表明群落的复杂程度越高[16]. Shannon指数的变化趋势与Chao、 Ace指数的变化趋势基本一致，从第1-5隔室呈现持续上升趋势，上升幅度为24.1%. 从以上3种指数结果来看，ABR反应器从第1-5隔室细菌群落的多样性逐渐增加，也就是说基质浓度较高的前端隔室，因为ANAMMOX菌的富集，竞争能力弱的菌群将逐渐减少，而功能性脱氮菌逐渐占据主导地位，造成群落结构逐渐集中化. Simpson指数与Shannon指数结果相反，呈现逐渐降低趋势，降低幅度为57.6%，特别是从第3隔室开始，Simpson指数出现较大幅度降低. Simpson指数体现了优势物种生物量占群落生物总量的比重，该指数越大表明优势菌群生物量占总生物量比重越大，反之则优势菌群生物量占总生物量比重越小[17]，与Shannon指数一样，表明ABR反应器前端隔室基质充足，ANAMMOX菌逐渐富集，优势种群比例较大，而后端隔室因为基质浓度过低，优势种群并不明显.
|
|
表 2 ABR反应器各隔室细菌丰度变化情况 Table 2 Variations of richness and diversity estimators of microbial communities in the compartment of ABR reactor |
2.2.2 ABR各隔室细菌在门分类层面的分布规律
从图 3可以看出，ABR反应器中细菌群落结构多样性较为丰富，按照丰富度排列主要存在绿曲挠菌门(Chloroflexi)、 变形菌门(Proteobacteria)、 绿菌门(Chlorobi)、 厚壁菌门(Firmicutes)、 浮霉菌门(Planctomycetes)以及硝化螺旋菌门(Nitrospirae)等门类，ANAMMOX菌所在的浮霉菌门排在第5位.其中，涉及到脱氮功能微生物的有变形菌门，浮霉菌门和硝化螺旋菌门3种，占总细菌的19.29%-26.62%，见表 3.
|
图 3 ABR各隔室中细菌分类(门)的群落组成相对百分比 Fig. 3 Taxonomic classification of bacterial communities in the compartment of ABR reactor at a phylum level |
从脱氮细菌来看，变形菌门在各隔室内所占比例分别为11.66%、 15.42%、 19.75%、 18.14%和20.28%，从第1-5隔室所占比例逐渐加大(表 3). 而ANAMMOX菌所在的浮霉菌门，在5个隔室的分布比例为7.44%、 7.94%、 2.30%、 2.18%和2.51%，低于变形菌门，而且在各隔室中的分布与变形菌门细菌存在较大差异. 浮霉菌门在第1和第2隔室分布较多，占总细菌比例的7.44%-7.94%，而在后端3个隔室基本维持在较低水平，占总细菌比例的2.18%-2.51%. 浮霉菌门的分布与厌氧氨氧化反应基质的利用场所有关，低浓度的基质仅在前两隔室得到利用，后端隔室因基质缺乏而导致ANAMMOX菌富集较低，这也与反应器污泥的表观特性相一致. 而硝化螺旋菌门，占总细菌比例较低，在0.19%-6.30%之间，仅在第4隔室处在较高水平(6.30%)，具体原因还有待分析和研究. 硝化螺旋菌门是推动亚硝化反应的重要微生物，在多种厌氧氨氧化环境中被检测到，如膜曝气生物膜反应器(membrane-aerated biofilm reactor,MABR)[18]，序批式生物膜反应器 (sequencing batch biofilm reactor,SBBR)[19]等都发现了硝化螺旋菌门的足迹. 硝化螺旋菌门是硝化作用的主要实践者，污水中带入的少量氧气导致其在反应器内得到生长，但在厌氧环境中对脱氮过程所起的作用可忽略不计.
|
|
表 3 ABR各隔室中主要脱氮细菌(门水平)的群落组成相对百分比/% Table 3 Relative abundance of the dominant denitrifying bacterial communities in the compartment of ABR reactor at a phylum level/% |
本研究发现，三大门类的脱氮菌相比较，变形菌门占据最为重要的位置，这与多数厌氧氨氧化反应器细菌群落分布情况相一致. Bae等[20]研究发现启动成功后变形菌门占42%，高于浮霉菌门的20%. 李滨等[21]分析了稳定运行的UASB厌氧氨氧化反应器，发现变形菌门占据主导位置(41.9%)，而浮霉菌门仅占3.1%. 但也有研究表明，启动成功后浮霉菌门(占23.2%)会超过变形菌门(占12.9%)成为优势类群，这可能是与该研究采用颗粒污泥作为接种污泥相关，颗粒污泥具有良好的沉降性能，易通过重力沉降持留于反应器内，提高反应器内的微生物浓度，降低ANAMMOX菌的流失，从而促进ANAMMOX菌成为颗粒污泥中的优势菌群[22]. 因此，采用颗粒污泥作为接种污泥可有效提高反应器内ANAMMOX菌的富集率.
而对于其他非参与脱氮的细菌，如绿曲挠菌门、 绿菌门和厚壁菌门等，在厌氧氨氧化反应器中常被检测到. 绿曲挠菌门常存在于富集程度较高的厌氧氨氧化污泥中，有研究指出在成功启动厌氧氨氧化的SBBR反应器[19]、 上升式厌氧颗粒床反应器[23]、 CANON反应器[24]等都发现了绿曲挠菌门，其作用是固碳，将CO2固定为最终产物丙酮酸. 而绿菌门是一类进行不产氧光合作用的细菌，在以聚乙烯海绵为填料的升流式填料塔厌氧氨氧化反应器[25]、 UASB反应器[20]等厌氧氨氧化环境中被发现，但其在厌氧氨氧化反应中起何种作用还不得而知. 厚壁菌门在污水处理污泥中较为常见，常存在于接种污泥中，因此在厌氧氨氧化反应器中经常被检测到，但随着启动过程丰富度会下降. 宋雨夏等[22]以厌氧颗粒污泥作为接种物，通过185 d 的运行，成功启动了UASB 厌氧氨氧化反应器，发现在反应器启动到成功运行后，厚壁菌门一直存在于反应器中，但种群丰度大幅度降低，从7.66%降至0.48%.
2.2.3 ABR各隔室细菌在属和种分类层面的分布规律为进一步阐明反应器在运行过程中细菌群落的演化，在属的水平上，选取系统中占有比例较多的具有脱氮功能的变形菌门和浮霉菌门进行分析. 在变形菌门中，共鉴定出属的细菌有41种，占变形菌门总量的38.42%-54.67%，见图 4. 在变形菌门中，占据比例较高的是Rhodoplanes属(含量在0.33%-3.58%)、 Dok59属(含量在0.78%-2.06%)、 Rubrivivax属(含量在0.05%-1.62%)和Bdellovibrio属(含量在0.14%-1.15%). 这些属均属于变形菌门主要细菌，在废水处理及环境样品中常被检测到. 5个隔室的主要细菌群落结构在属水平上差异并不大，但在比例上差异明显. 从第1-5隔室，Rhodoplanes属所占比例逐渐增大，而Dok59属、 Rubrivivax属和Bdellovibrio属均呈现下降趋势. Rhodoplanes属可在厌氧黑暗环境下很好地降解有机物，一些难以生物降解的含氮杂环化合物如喹啉都能较好地被其降解[26]. 随着隔室的后推，亚硝态氮底物快速降低，ANAMMOX作用逐渐减弱，可广谱性利用有机物的反硝化类细菌开始增长，如Rhodoplanes属，而难以在少量有机物环境下及时利用有机物的细菌，如Dok59属、 Rubrivivax属和Bdellovibrio属所占比例则逐渐减少.
|
图 4 ABR各隔室中变形菌门的群落组成(属)相对百分比 Fig. 4 Taxonomic classification of the Proteobacteria bacterial communities in the compartment of ABR reactor at a genus level |
在浮酶菌门中，Candidatus brocadia 和Candidatus kuenenia是最主要的属，它们也是污水处理厂脱氮系统中常见的浮霉菌门细菌. 在总细菌的分布比例上，Candidatus brocadia属占0.60%-5.19%，在前2个隔室所占比例明显高于后3个隔室； 而Candidatus kuenenia属占比较低，仅0.08%-0.13%，仅分布于前2个隔室，在后3个隔室并未检出，见图 5. ANAMMOX菌在前两个隔室里面富集率较高，也与基质底物在此较为充足，造成ANAMMOX菌大量增长与富集有关，但因底物的缺乏，末端3个隔室ANAMMOX菌的比例处在较低水平.
|
图 5 ABR各隔室中主要ANAMMOX菌菌属的分布规律 Fig. 5 Distribution regulation of the anammox genus in the ABR reactor at a genus level |
Candidatus brocadia属最早是在荷兰的污水处理厂污泥中发现的，是第一个被富集鉴定的ANAMMOX菌种[27]. Candidatus brocadia属以亚硝酸为能源，以CO2为碳源，不能利用小分子有机酸类，如甲酸、 丙酸等. 目前已经发现的属于Candidatus brocadia属的ANAMMOX菌有两种，即“待定厌氧氨氧化布罗卡地菌(Candidatus brocadia anammoxidans)”和“待定荧光布罗卡地菌(Candidatus brocadia fulgida)”. 因测序手段的局限性，本研究中并未鉴定出Candidatus brocadia属属于哪一种细菌. 而Candidatus kuenenia属是在德国斯图加特废水处理滴滤池中发现的，与Candidatus brocadia属一致，以CO2为唯一碳源，通过将 NO2--N氧化成 NO3--N获得能量[28]. 在本研究ABR反应器中，Candidatus kuenenia属仅检测到stuttgartiensis种，即“待定斯图加特库氏菌(Candidatus kuenenias stuttgartiensis)”，该种是ANAMMOX反应器中主要种群[29]，在污水处理反应器中分布较广，研究者已对其代谢途径和关键酶进行了研究[30]，为解析ANAMMOX反应的微生物学机制奠定了基础.
3 结论(1) ABR反应器厌氧氨氧化反应运行稳定，氮素去除率高，TN去除率＞80%.
(2) 高通量测序分析技术结果表明，ABR厌氧氨氧化反应器中脱氮细菌较为丰富，其中变形菌门(Proteobacteria)、 浮霉菌门(Planctomycetes)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)是主体脱氮细菌，分别占11.66%-20.28%、 2.18%-7.94%和0.19%-6.30%，变形菌门主要包含Rhodoplanes、 Dok59、 Rubrivivax和Bdellovibrio等属，占据主导地位，而浮霉菌门次之，主要包含Candidatus brocadia 和Candidatus kuenenia属.
(3) 从各隔室细菌分布来看存在较大差异，从第1-5隔室，污泥表观红色逐渐减退，趋向于灰黑色，Chao、 ACE、 Shannon、 Simpson指数均表明细菌群落丰富度逐渐增加，且变形菌门逐渐增加，而浮霉菌门逐渐降低，这与基质的降解规律相一致.