2016, Vol. 37
全程自养脱氮(completely autotrophic nitrogen removal over nitrite，CANON)工艺是一种新型的高效、 经济的脱氮工艺[1, 2]，通过亚硝化菌(AOB)和厌氧氨氧化菌(AnAOB)的协同竞争作用，实现污水中氮素的去除. 目前相关的研究主要集中于高氨氮 (>400 mg·L-1)废水[3]，如污泥消化液[4]和渗滤液[5]，对低氨氮废水的研究较少. 目前，较长的启动时间[6]，较低的脱氮速率[7]，缓慢的AnAOB生长速率[8]和运行性能不易稳定[9]等缺点是限制CANON工艺应用于低氨氮浓度生活污水(20～85 mg·L-1)处理的关键问题. 因此，出现了许多CANON工艺结合于不同反应器类型的研究.
厌氧折流板反应器(ABR)是一种适合处理低浓度生活污水的新型厌氧生物反应器[10]，具有污泥产率低、 无需机械搅拌、 运行费用低等优点. 通过在反应器中加设挡板，将反应器分成几个串联的相对独立的单元格，使反应器介于推流式(PF)和完全混合式(CSTR)之间. 相较于CSTR，ABR的死角区域更少、 容积负荷更高[11]. 污水在反应器内部通过不断地上下折流，不仅使基质与污泥充分接触混合，而且可以使不同种群的微生物在不同的单元格内生长，从而呈现出良好的种群分布特征[12]. 复合式折流板反应器 (HABR) 则是将ABR与生物膜反应器相结合，更进一步提高了反应器的运行效能.
本研究采用一种新型的HABR启动CANON工艺，即利用ABR独特的物理结构，填加醛化纤维丝作为生物膜载体，对位于前段的几个单元格进行曝气处理，将一个反应器分成好氧和厌氧两个区域，以达到促进AOB与AnAOB协同生长的目的，加速实现反应器的启动. 反应器稳定运行后，通过扫描电镜(SEM)及荧光原位杂交(FISH)的手段对生物膜进行研究，分析反应器内微生物种群形态结构及空间分布.
1 材料与方法 1.1 实验装置和接种活性污泥HABR实验装置如图 1所示，材质为有机玻璃，长40 cm，宽20 cm，高70 cm，有效容积32 L. 反应器被挡板分割成6个相互串联的相同单元格，每单元格的底部有倾角为45°的导流板将其分为体积比约为1∶3的下向流格室和上向流格室. 中空塑料圆环周围绑扎醛化纤维丝的填料悬挂填充于整个上向流格室，以助于生物量的保持，增大进水与污泥的接触面积，且每个上向流格室顶端均分布有一取样口.
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图 1 新型HABR反应器装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of novel HABR |
反应器接种污泥取自实验室内运行良好的改良氧化沟污泥[13]，MLSS为2706～5281 mg·L-1，取1.5 L污泥分别从各单元格上向流格室上部向反应器内加入.
1.2 实验配水和启动方法实验用水采用人工配水，即向自来水中加入适量NH4Cl、 NaHCO3和KH2PO4配置而成，平均进水NH4+-N浓度为40 mg·L-1，水温和pH分别控制为(30±2) ℃和 7.7±0.2，碱度和pH通过投加NaHCO3和稀盐酸、 NaOH调节.
通过低负荷连续进水的方式启动反应器，共分为3个阶段，各阶段进水NH4+-N浓度、 水力停留时间(HRT)等运行参数如表 1所示. 反应器启动成功后，对反应器沿程各单元出水水质进行监测，并记录氮素去除规律及沿程的电导率、 pH值和MLSS浓度的变化，最后对反应器中微生物种群形态结构及空间分布进行分析.
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表 1 各阶段反应器运行参数 Table 1 Influent and operational conditions in different phases |
1.3 化学分析方法
NH4+-N： 纳氏试剂分光光度法； NO2--N： N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法； NO3--N： 麝香草酚分光光度法； MLSS： 重量法； DO及水温： WTW Multi340i多功能溶氧仪； pH值： WTW inoLab pH计； 电导率： WTW inoLab cond 730.
1.4 扫描电镜(SEM)分析当新型HABR反应器处于稳定运行阶段时，取纤维填料，用无菌刷将生物膜取下，经PBS清洗3遍、 戊二醛固定、 乙醇梯度脱水、 乙酸异戊酯置换、 冷冻干燥后喷金处理，采用日本JSM-6390LV型扫描电镜仪对样品进行观察.
1.5 荧光原位杂交(FISH)分析荧光探针采用由生工生物工程(上海)股份有限公司合成并标记的Amx820 (5′-AAAAC CCCTCTACTTAGTGCCC-3′-Cy3) 和NSO190(5′-CGATCCCCTGCTTTTCTCC-3′-Cy5) ，按照Amann等[14]的操作方法进行双重染色后，在共聚焦显微镜(Leica TCS SP8) 的同一视野下观察生物群落的空间结构分布.
2 结果与讨论 2.1 反应器启动和运行效能新型HABR反应器的启动及稳定运行共历时187 d，运行参数见表 1，整个过程可划分为3个阶段： Ⅰ(1～41 d)、 Ⅱ (42～71 d)、 Ⅲ-Ⅰ (72～89 d)和Ⅲ-Ⅱ (90～187 d). DO作为实现CANON工艺的关键因素，不仅要满足AOB将部分NH4+-N转化为NO2--N，为后续的ANAMMOX反应提供基质的需求，而且要能够限制抑制NOB的生长[15]. 因此，在前3个向下流格室内控制曝气量分别为0.2、 0.2、 0.1 L·min-1，并通过逐步缩短HRT启动反应器. 反应器3个阶段的进、 出水氮素浓度的变化如图 2所示.
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图 2 新型HABR反应器运行效能 Fig. 2 Performance of novel HABR during operation |
阶段Ⅰ(1～41 d)，实验进水NH4+-N为40 mg·L-1，HRT为24 h，即平均进水氨氮负荷为0.05 kg·(m3·d)-1. 实验初期，较长的HRT有利于活性污泥在填料上附着生长，以形成生物膜. 然而，由于接种污泥未针对厌氧氨氧化菌群做特别的筛选，且厌氧氨氧化菌的世代周期长，增长缓慢，因此反应器在启动初期氮素去除情况不理想. 在经历了41 d的连续驯化培养后，出水NH4+-N浓度逐渐从31 mg·L-1降至 2 mg·L-1，NH4+-N、 TN去除率分别达到95%和63%.
阶段Ⅱ(42～71 d)，通过缩短HRT至12 h的方式提高进水氨氮负荷至0.1 kg·(m3·d)-1. 运行初期，由于HRT的突然缩短，NH4+-N 和TN 的去除率迅速降至46%和32%，但出水中NO2--N和NO3--N浓度变化不大. 待微生物逐渐适应提高的氨氮负荷后，反应器脱氮性能随之恢复，NH4+-N和TN去除率分别逐渐升高至98%和75%.
继续缩短HRT至6 h，在阶段Ⅲ-Ⅰ (72～89 d)初期，NH4+-N和TN的去除率再次出现降低，不过经过短暂的驯化培养后，两者的去除率很快回升至96%和83%，此时，出水NH4+-N和TN浓度维持在2 mg·L-1和10 mg·L-1以下，NRR达到0.15 kg·(m3·d)-1，认为反应器启动成功，其启动时间短于先前的研究报道[16]. 为了测试新型HABR反应器的运行稳定性，维持阶段Ⅲ-Ⅰ的运行条件，进入阶段Ⅲ-Ⅱ (90～187 d). 由图 2可以看出，在阶段Ⅲ-Ⅱ，反应器出水NH4+-N和TN 浓度持续保持在2 mg·L-1和10 mg·L-1以下，NH4+-N和TN去除率分别达到96%和83%，这说明新型HABR反应器不仅启动速度快，而且能够连续稳定运行，即新型HABR反应器具有良好的脱氮性能和稳定性.
2.2 反应器沿程氮素变化在阶段Ⅲ-Ⅱ期间，分别从反应器的6个取样口同时多次取样，以分析反应器沿程氮素的变化规律，其结果如图 3所示. 从中可知，前3个单元格去除了接近90%的NH4+-N，特别是第1个单元格中NH4+-N的去除率达到40%，第2个单元格也达到30%，这与之前的文献报道相类似[12, 17]. NO2--N浓度在曝气量较大的前两格中略有升高，但远小于亚硝化反应中NH4+-N去除量与NO2--N生成量之比为1∶1的理论值，说明亚硝化反应所产生的NO2--N迅速被ANAMMOX反应作为基质所利用，因此并未出现大量NO2--N积累的现象. NO3--N浓度在前3个单元格虽有上升，但幅度较小，由进水中的5.49 mg·L-1最高升至9.94 mg·L-1(第3个单元格)，在后3个单元格中NO3--N浓度略有下降，整个反应器沿程并无大量NO3--N产生，说明反应器中NOB无明显的富集，且其活性受到了有效地抑制.
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图 3 反应器各单元格氮素变化及去除率 Fig. 3 Profile of nitrogen and nitrogen removal in each compartment of the reactor |
电导率是评价生物系统处理性能的重要指示参数，与废水中微生物群落的主要组成存在显著的线性关系[18]，与厌氧氨氧化活性关系密切[19]. 反应器沿程电导率监测结果如图 4(a)所示，由进水的2.77 mS·cm-1沿着水流方向逐步降至2.48 mS·cm-1，尤以第1个单元格下降最为明显，与沿程NH4+-N下降趋势相一致，这说明电导率与NH4+-N浓度之间有着一定的线性关系[20]. 相同的情况也出现在先前的研究中，即氮的去除量与电导率的差值成比例下降[21~23]. 因此，可根据进、 出水电导率的差值来衡量反应器运行效果的好坏.
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图 4 反应器各单元格内参数变化 Fig. 4 Variations of parameters in each compartment of the reactor |
pH值作为自养脱氮系统的一个重要影响因素[24]，不仅可以通过影响细胞内电解质的平衡来直接影响微生物的活性甚至决定其能否存活，甚至还能通过影响基质或抑制物的浓度来间接影响微生物的活性. 对于ANAMMOX反应而言，进出水pH差值(ΔpH)在一定程度上受ANAMMOX菌数量和活性的影响[25]，其运行效能与ΔpH值和流量的乘积(ΔpH×Q)具有较为显著的线性关系[22]，故可以通过ΔpH的变化来推断反应器内是否进行ANAMMOX反应[26]. 因此，根据亚硝化和ANAMMOX反应的最佳pH值范围，本实验将进水pH值控制在7.7±0.2之间. 反应器沿程各单元格中pH值的变化如图 4(b)所示. 由于ANAMMOX反应属于嗜酸释碱过程，因此沿程中pH值的不断上升可以证实反应器各单元格中均存在厌氧氨氧化反应. 在沿程中出现了两次明显的pH值上升： 一次是第1个单元格的出水pH显著高于进水pH，说明此时ANAMMOX过程为主反应，ANAMMOX反应产生的碱大于亚硝化过程产生的酸； 另一次是第4个单元格的出水pH高于第3个单元格的出水pH，此时好氧段结束，缺氧段开始，不利于AOB的生长，亚硝化过程受到抑制，而ANAMMOX反应继续进行.
为分析反应器沿程各单元格内生物量的变化，在反应器稳定运行期间测定各单元格内的MLSS浓度. 由图 4(c)可以看出，反应器中不同单元格的MLSS浓度在5200～3200 mg·L-1之间，沿程中MLSS的浓度伴随着NH4+-N浓度的下降呈现出逐渐降低的变化趋势，这是由于水中基质浓度与微生物的生长变化密切相关. NH4+-N作为AOB和AnAOB共同的基质，在其含量相对较高且进行曝气的第1、2个单元格中MLSS浓度为5000 mg·L-1左右，明显高于其他单元格，即充足的营养物质和适宜的DO浓度使得微生物快速生长富集. 而在其他单元格中，随着营养物质的降低，MLSS稍有下降，但仍维持在相对稳定的水平，在3500 mg·L-1左右的范围内波动， 这说明经过长期驯化成功的微生物已适应反应器内环境，整体上其生长与衰亡达到动态平衡.
2.3 生物膜形态及空间结构分析由于第1个单元格具有突出的脱氮性能，因此选其作为分析微生物种群形态结构及空间分布的研究对象具有代表性，故对第1个单元格中的生物膜进行扫描电镜及FISH分析.
AOB和AnAOB种类形态多样，污水处理系统中经常出现的AOB主要是Nitrosococcus (亚硝化球菌属) 和Nitrosomonas (亚硝化单胞菌属)，其形态分别呈球状和短杆状，AnAOB属于圆形和椭圆形的革兰氏阴性菌[27]，成簇聚生，直径约0.8-1.1 μm. 由图 5可知，反应器内存有结构紧致的菌胶团，与先前的CANON反应器研究结果相似[28]，成簇生长的球形和椭球形菌为生物膜上的优势菌种，直径在0.2-0.8 μm，由此推断其中的球形菌可能为Nitrosococcus和AnAOB，数量较少的短杆菌则可能为Nitrosomonas.
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图 5 污泥样品扫描电镜照片 Fig. 5 SEM images of the sludge sample |
为研究生物膜内微生物的空间分布，通过AOB 和AnAOB的特异性探针对生物膜进行FISH分析，结果如图 6所示，其群落分布情况与已知的研究结果一致[29~31]，AOB和AnAOB两种微生物同时存在于污泥样品中，AnAOB趋向于分布在内侧，AOB则更趋于分布于外侧. 这一结果验证了前面的推断，AOB 和AnAOB的协同作用保证了CANON反应器良好的脱氮效果. 由于氧饱合常数不同以及传质限制等因素，使得AOB和AnAOB具有特定的空间分布特征. AOB属好氧菌，易聚积生长于生物膜的表面，适宜的DO促进AOB的生长代谢，淘汰NOB，将NH4+-N转化为NO2--N，为AnAOB提供基质，DO在向生物膜内层扩散过程中不断被消耗掉，故在生物膜内层出现了利于AnAOB生长的缺氧或厌氧区域.
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图 6 反应器内生物膜FISH结果 Fig. 6 FISH results of biofilm in the reactor |
(1) 经过89 d的连续运行，新型HABR反应器实现了CANON工艺的快速启动，并能持续稳定运行至187 d. 稳定运行阶段，出水NH4+-N和 TN 浓度分别在2 mg·L-1和10 mg·L-1以下，去除率分别达到96%和83%以上，NRR达到0.15 kg·(m3·d)-1，证实了新型HABR是一种高效、 稳定的脱氮反应器.
(2) 稳定运行阶段，NH4+-N与TN浓度沿程逐渐降低，沿程中pH值的波动变化与DO密切相关，电导率、 MLSS的变化与NH4+-N浓度的变化具有正相关性.
(3) SEM和FISH分析结果表明，AOB与AnAOB为反应器内的优势菌种，AOB位于生物膜外层，AnAOB分布于缺氧或厌氧的生物膜内层，二者的协同作用保证了反应器良好的脱氮效果.
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