环境科学  2016, Vol. 37 Issue (7): 2570-2576   PDF    
引用本文
王振红, 张汉鹏, 罗专溪 . 不同磷源下铜绿微囊藻的生长差异及对砷酸盐的响应[J]. 环境科学,2016, 37(7): 2570-2576.
WANG Zhen-hong, ZHANG Han-peng, LUO Zhuan-xi . Response of Microcystis aeruginosa Growth to Arsenate Under Different Phosphorus Regimes[J]. Environmental Science,2016, 37(7): 2570-2576.
不同磷源下铜绿微囊藻的生长差异及对砷酸盐的响应
王振红1 , 张汉鹏1 , 罗专溪2     
1.闽南师范大学化学与环境学院, 福建省现代分离分析科学与技术重点实验室, 漳州 363000;
 2.中国科学院城市环境研究所, 中国科学院城市环境与健康重点实验室, 厦门 361021
收稿日期: 2015-10-31; 修订日期: 2016-01-07.
作者简介: 王振红(1979~),女,博士,副教授,主要研究方向为水环境微污染控制,E-mail:zhhwang1979@163.com
摘要: 为更好地认识和预测淡水环境中砷的生态风险,通过室内培养实验分析了铜绿微囊藻在溶解态无机磷(DIP)和有机磷[腺苷-5'-三磷酸二钠盐(ATP-P)、β-甘油磷酸钠(β-P)]这3种不同磷源下的生长差异,并探讨了不同磷源下藻细胞对砷酸盐[As(Ⅴ)]的胁迫响应.结果表明,该藻在不同磷源下均可进行生长繁殖,且在前5 d内无明显差异;之后与DIP相比,有机磷(DOP)源下的藻细胞增殖相对较差;培养7 d时β-P和ATP-P环境下藻体光密度(D)分别只有DIP的78.0%和75.4%.各磷源下藻体实际光能转化率(Yield)与叶绿素a(Chl-a)和D的负相关表明Yield不能作为藻体营养缺乏与否的稳定性衡量指标.不同磷源下藻体对As(Ⅴ)胁迫的响应因磷形态不同而表现出明显差异,Yield能很好地表征这种胁迫响应.由D、Yield和Chl-a得出铜绿微囊藻对As(Ⅴ)的96 h EC50均表现为DIP > β-P > ATP-P; β-P和ATP-P条件下其对As(Ⅴ)的耐受性较为接近,但与DIP相比差1~5个数量级.
关键词: 铜绿微囊藻      砷酸盐[As(Ⅴ)]      溶解态有机磷      无机磷      EC50     
Response of Microcystis aeruginosa Growth to Arsenate Under Different Phosphorus Regimes
WANG Zhen-hong1 , ZHANG Han-peng1 , LUO Zhuan-xi2     
1.Fujian Province Key Laboratory of Modern Analytical Science and Separation Technology, College of Chemistry and Environment and Fujian Province, Minnan Normal University, Zhangzhou 363000, China;
 2.Key Laboratory of Urban Environment and Health, Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China
Abstract: To better understand and then to predict the ecological risk of arsenic influenced by phosphorus regimes in freshwater environment, the growth differences of Microcystis aeruginosa (M. aeruginosa) as well as its responses to the toxic stress of arsenate [As(Ⅴ)]were investigated under orthophosphate (DIP) and dissolved organic phosphorous (DOP) [adenosine triphosphate (ATP-P) and β-sodium glycerophosphate (β-P)] culture conditions. The results showed that M. aeruginosa grew and proliferated without any differences under DOP and DIP conditions during the first 5 days, while slower growth rates were observed in DOP conditions. Herein, the cell optical density (D) of M. aeruginosa in β-P and ATP-P conditions was 78.0% and 75.4% of that under DIP condition respectively on the 7th day. The negative correlations between actual quantum yield (Yield) and Chlorophyll a (Chl-a) and D indicated that Yield should not be used as a stable index to reflect the nutrition conditions of algae. However, Yield was a sensitive index to exactly represent the responses of M. aeruginosa to As(Ⅴ) toxicity, which showed significant differences under different phosphorus regimes. Obtained by D, Yield and Chl-a, the 96h EC50 was in the order of DIP > β-P > ATP-P. The similar toxic tolerant abilities to As(Ⅴ) of M. aeruginosa under β-P and ATP-P conditions were lower than that of EC50 under DIP conditions by one to five orders of magnitude.
Key words: Microcystis aeruginosa      arsenate [As(Ⅴ)]      dissolved organic phosphorus      orthophosphate      EC50     

近年来水体富营养化问题普遍存在，水华暴发已成为紧缺淡水资源的严重威胁[1, 2]. 铜绿微囊藻(M. aeruginosa)被认为是世界范围内广泛存在的最为普遍的藻类之一，由其引发的藻类水华对动植物具有危害[3]. 铜绿微囊藻作为富营养化水体最常见的蓝藻水华优势藻种之一[4, 5]，其对极端环境的强抗逆性和原核细胞的特殊结构，使其不仅能维持极强的生命力和繁殖力，并且使得该藻对水环境中包含砷在内的多数金属离子具有高吸附性能和累积能力[6, 7].

砷(As)作为一种有毒的、 非必需类金属元素，已被国内外列为优先控制污染物[8, 9]. 砷酸盐[As(Ⅴ)]作为水环境中砷的主要形态存在[10, 11]，其与磷酸盐(PO43-)具有相似的化学性质，可通过磷转运通道进入植物细胞[12, 13]. As(Ⅴ)对天然水体中的群落结构具有显著效应[14]，其对浮游植物的毒性大小可由磷酸盐质量浓度调节[15]. 磷作为淡水水体的主要限制性营养元素，对藻类的生长繁殖有重要影响[14, 15]. 水体中磷常以正磷酸盐、 聚磷酸盐、 聚合磷酸盐和有机磷等多种形态存在. 水环境中有机磷主要由磷脂、 磷酸糖类、 磷酸酯和膦酸盐等组成[16, 17]. 局部水体中溶解态有机磷(DOP)质量浓度甚至比无机磷(DIP)质量浓度要高出一个数量级而成为营养物质的主要成分[18, 19]. 水体中溶解性磷质量浓度很低时，某些水华蓝藻能够利用有机磷大量繁殖[20]，从而使得有机磷化合物亦能促进特定藻类的增殖. 当前浮游藻类对As(Ⅴ)的转化及毒性响应研究主要关注无机磷环境，极少涉及有机磷环境时藻类对As(Ⅴ)胁迫的响应研究，不利于对藻类砷转化的全面认识. 腺苷-5′-三磷酸二钠盐(ATP-P)和β-甘油磷酸钠 (β-P)作为合成生物体内许多重要物质的原料和生命活动有关的最基本物质，与生物的生命活动有着密切关系，是生物体内包括蓝藻不可缺少的营养成分[17, 21]. 因此选取ATP-P和β-P为有机磷源、 PO43-为无机磷源，探讨不同磷源下铜绿微囊藻对水体中砷胁迫的响应，对于全面认识湖泊环境中砷的生物地球化学过程，预测其生态风险，保障湖泊生态系统健康和饮用水源安全，具有重要的理论价值和现实意义.

1 材料与方法 1.1 实验藻种的来源及培养

铜绿微囊藻FACHB-905购自中国科学院水生生物研究所国家淡水藻种库. 藻种于可控光温的培养箱中进行，培养条件如下： 温度为25℃，光暗比为16 h∶8 h、 光照强度为115 μmol·(m2·s)-1，每天振摇 3 次. 不同有机磷源的藻种培养分别采用腺苷-5′-三磷酸二钠盐(ATP-P)和β-甘油磷酸钠 (β-P)取代BG11培养基中的磷酸盐(TP质量浓度一致)进行，并于4℃保存备用(所用试剂均为分析纯). 所有工作在超净工作台进行.

1.2 藻的磷饥饿处理

取一定体积纯化的藻液，5000r·min-1离心15 min，弃掉上清液，用无菌水洗涤两次，再离心，弃去上清液以除去藻液中的磷酸盐，然后移至已灭菌的无磷BG-11培养液中，以上过程均在无菌条件下完成. 在无磷培养液中饥饿培养48 h，并认为该条件下的藻细胞为磷缺乏状态[22]. 另外，所有容器须在10% HNO3 溶液中浸泡24 h，以除去外界砷和磷的干扰，实验中所有容器及试剂需经灭菌处理，避免细菌对藻细胞的干扰，影响实验结果. 实验用水均为灭菌后超纯水.

1.3 有机磷源下藻的生长

将上述经磷饥饿培养后的藻体离心，经无菌去离子水洗涤两次后，分别转移至无机磷(DIP)和ATP-P、 β-P有机磷(DOP)培养液中连续培养7 d (分别设3个平行，其初始藻密度为1.0×106 cells·mL-1). 间隔24 h取样，分别测定其藻体生物量、 叶绿素荧光特性和培养介质中无机磷质量浓度(cDIP)变化.

1.4 藻细胞对As(Ⅴ)的胁迫响应

将质量浓度为20 g·L-1的含As(Ⅴ)储备液(Na3AsO4·12H2O)采用逐级稀释的方法分别投加至上述不同形态磷源下对数生长期的藻细胞溶液中(藻密度不低于1×106 cells·mL-1)，使其分别暴露于不同质量浓度As(Ⅴ)环境中96 h，观察其生长变化. As(Ⅴ)的质量浓度梯度为： 0、 2、 2×102、 2×103、 2×104、 2×105、 1×106、 2×106 μg·L-1 (皆以As 元素计)，均设3个平行. 间隔24 h取样，分别测定其藻体生物量和叶绿素荧光特性的变化.

与对照组各指标的比值所确定的比率作为生物终点来估算不同形态磷源下As(Ⅴ)对藻的效应. 计算结果用Sigma Plot 10 的S型剂量-响应曲线进行拟合[23]：

式中，e为生物响应，emax 和 emin 分别指最大和最小生物响应，cAs 指培养液中无机砷的质量浓度，EC50 是对应于抑制率为50%的半数效应质量浓度. Hillslope 是描述曲线倾斜度的斜率因子. 所有拟合取Hillslope值均为1.0.

1.5 测定方法 1.5.1 藻体生物量测定

取一定量新鲜藻液转移到10 mm石英比色皿中于682 nm波长处测其光密度(D). 藻细胞比生长率(μ)用公式： μ=ln(ct/c0)/t计算，式中，μ为细胞比生长率(d-1)； ct和 c0分别代表时间t和初始时的光密度； t为As(Ⅴ)添加下的暴露时间[24].

1.5.2 介质中无机磷质量浓度的测定

取2 mL新鲜藻液，经离心分离后，取上清液过0.45 μm的一次性醋酸纤维素注射器式过滤器，滤液经适当稀释后，用磷钼蓝分光光度法测定其溶解性无机磷(DIP)质量浓度(GB 17378.4-2007) .

1.5.3 叶绿素荧光特性测定

取新鲜藻液2 mL，经5 min暗适应后，通过高级浮游植物荧光分类仪(PHYTO-PAM，德国Walz)对藻液中的叶绿素a(Chl-a)和实际光能转化率(Yield)进行分析测定.

1.6 数据处理和分析

实验结果均为3次平行数据的平均值和标准差，实验数据采用统计软件IBM SPSS Statistics 21 进行单因素方差分析(ANOVA)和Pearson相关关系分析，采用GraphPad Prism 6.0 进行作图.

2 结果与讨论 2.1 不同磷源下铜绿微囊藻的生长特性

从不同磷源下铜绿微囊藻光密度(D)随时间的变化[图 1(a)]可见，初始的5 d内藻细胞增殖无明显差异(P>0.1) ，其细胞密度呈线性增加(DIP、 ATP-P和β-P源下比生长率μ分别为 0.101、 0.095和0.105 d-1)，β-P相对表现出较高的生长潜能. 有机磷(ATP-P和β-P)源下藻细胞在第5 d达到峰值，之后则表现出细胞增殖的相对停滞，而无机磷(PO43-)源下藻细胞比生长率则持续上升(0.15 d-1). 以上表明外界磷形态的变化对细胞增殖的影响在短时间内(5 d)不能充分体现，这可能是受胞内残留磷及DOP介质中亦有部分DIP存在的共同影响[25, 26]. 培养期内(7 d) β-P较ATP-P磷源下铜绿微囊藻较高的μ值说明该藻更容易吸收利用低分子量的磷形态. 第7d时ATP-P和β-P源下藻细胞密度分别为DIP源的78.0%和75.4%，说明磷作为制约藻类生长的限制性因子之一，其形态上的差异能影响藻类的繁殖，同时也说明铜绿微囊藻可单独以该两种形态的有机磷为磷源进行繁殖[21]. 这与先前研究所证实的Synechococcus和Trichodesmium可分别以ATP-P和β-P为唯一磷源相一致[21, 27]. DIP作为藻类生长需求的最佳磷源，其含量被耗尽或者不足时，浮游藻类可以通过水解酶的作用利用部分溶解态有机磷(DOP)进行生长繁殖[28~31].

图 1 不同磷源下藻细胞D值和Chl-a随时间变化 Fig. 1 Changes in algal cell optical density (D) and Chlorophyll a (Chl-a) of M. aeruginosa with time under different phosphorus regimes

Chl-a作为浮游藻类光合作用的重要产物，可有效反映藻体生物量和营养状态的变化.DIP、 ATP-P和β-P这3种磷源下Chl-a与D均显著正相关(P＜0.01)，其Pearson(双侧)相关系数分别为： 0.893、 0.568和0.851. 虽然不同磷源时Chl-a随时间也均呈增加趋势，但不同磷形态间则表现出较大差异[图 1(b)]. 可见，藻体Chl-a较D值更能直观地反映出不同形态磷源对铜绿微囊藻生长的影响. β-P条件下铜绿微囊藻的Chl-a相对较高[图 1(b)]，说明其较DIP和ATP在短时间内更有利于藻细胞Chl-a的合成. ATP-P条件下Chl-a在前5d相对较低，之后则表现出明显的增高，甚至高于DIP和β-P源下铜绿微囊藻的Chl-a. 这可能与先前研究曾指出的β-P可以被藻类直接吸收利用，而ATP-P则需要经过碱性磷酸酶水解后才能被吸收利用有关[29]. 以上说明铜绿微囊藻对DOP的适应性受其磷形态的影响而有所差异； 不同形态DOP对藻细胞Chl-a的合成在作用时间上也不尽相同. Fu等[21]研究指出集胞藻(Synechococcus CCMP 1334) ，在P限制状态时吸收ATP-P比DIP更快. 本实验中铜绿微囊藻Chl-a的增长则表现出相同的趋势.

Yield作为反映藻细胞生理的最核心指标，可以很好地反映藻细胞的“生长潜能”. 由不同P源下铜绿微囊藻Yield随时间变化(图 2)可知： 藻体Yield在前3 d没有明显差异，之后则表现出随时间增加Yield值降低的趋势，说明其生长潜能逐渐降低，但DIP源下藻体较DOP时则表现出相对较高的“生长潜能”，说明作为藻类必需营养盐——磷，其形态上的差异在影响藻体磷摄取的同时，也影响藻体对光能的转化. DOP为唯一磷源时不利于藻体对光能的转化，究其原因可能是DOP导致藻体磷营养受限而所致. 这和先前研究一致，即磷作为藻类发生光合作用的底物，其含量的缺乏或者限制会使得藻体Yield值降低[32].Kruskopf等[33]通过研究曾指出Yield不能作为藻体营养状态或相对生长率的一个稳定性指标，这与本实验中得到的不同磷源下藻体Yield值与Chl-a和D均呈负相关关系相一致，亦即Yield不能有效响应藻体的营养差异和细胞增殖及生物量的增加，其相关系数如表 1所示.

图 2 不同磷源下藻细胞Yeild随时间变化 Fig. 2 Changes in algal Yield of M. aeruginosa under different phosphorus regimes

表 1 不同磷源下Yield值与Chl-a和D的Pearson相关系数 Table 1 Pearson correlation coefficient between Chl-a and D with Yield under different phosphorus regimes

2.2 不同磷源下介质中DIP变化

铜绿微囊藻在不同磷源培养条件下，每天测得介质中DIP质量浓度变化如图 3所示. 可明显看出，DIP源下介质中DIP质量浓度呈线性急剧下降，培养7 d时介质中DIP减少25%，说明铜绿微囊藻对DIP具有很高的吸收、 储存能力，这与Li等[34]在不同DIP水平(0.1~4.0 mg·L-1)下得出的结果相一致. DOP源下介质中第1 d即测到DIP，且质量浓度随培养时间呈上升趋势，到第7 d时介质中磷基本以DIP形式存在，说明铜绿微囊藻具有将ATP-P和β-P转化为DIP的能力. ATP-P和β-P源下介质中DIP质量浓度在前2 d基本一致，从第3 d开始则表现出ATP-P源下介质中DIP质量浓度要高于β-P，说明藻体对淡水环境中这两种有机磷的转化，ATP-P相对更快. 有研究指出铜绿微囊藻胞内磷的缺乏，会导致其分泌磷酸产生的关键性化学物质——碱性磷酸酶[35]. 因此，铜绿微囊藻可通过碱性磷酸酶对DOP的持续水解，将DOP转变为DIP，从而提高对DOP进行利用[34]. 但也有研究指出浮游藻类对DOP的代谢并不受碱性磷酸酶的调节[25]. 可见，碱性磷酸酶并不是影响藻类利用DOP的唯一因素. 目前依然没有证据证明藻细胞可以直接吸收利用DOP，因而关于铜绿微囊藻对DOP的转化与代谢机制仍待深入研究.

图 3 不同磷源下介质中DIP质量浓度的变化 Fig. 3 Changes of DIP in M. aeruginosa culture media under different phosphorus regimes

由Pearson(双侧)检验得出： DIP源下介质中DIP与Chl-a显著负相关(P＜0.01) ，相关系数为-0.859，说明该磷源下藻细胞的增殖通过摄取介质中的无机磷实现，DIP是该体系初级生产力的支配因子. 而ATP-P和β-P源下介质中DIP质量浓度与Chl-a显著正相关(P＜0.05) ，相关系数为0.848和0.409，与藻体Yield值显著负相关(P＜0.01) ，相关系数分别为-0.849和-0.642，说明藻体增殖可加速介质中有机磷向无机磷转化，但这种转化并不利于藻体生长潜能(光能转化率)的提高，这可能是由于受限于外界磷形态的差异而导致. 藻细胞一方面可以将外界有机磷转化为无机磷，而另一方面外界磷形态的转化也影响着藻细胞磷的摄取与生长，具体表现为第5~7 d时藻细胞D值基本不变[图 1(a)]进入一个相对适应期.

2.3 砷酸盐对藻的生长胁迫

为确定不同磷源下As(Ⅴ)对铜绿微囊藻生长的胁迫特征，测定了各磷源下铜绿微囊藻对As(Ⅴ) 的96 h生长响应，并对结果进行S型剂量-响应曲线拟合以得出其96 h EC50 (图 4). 由D、 Chl-a和Yield分别所得出的96 h EC50及其相关系数(R2)如表 2所示，结果表明不同磷源下As(Ⅴ)对铜绿微囊藻的毒性数据均能够用S型剂量-响应曲线很好地进行拟合. 由D、 Chl-a和Yield这3个指标的方差分析得出铜绿微囊藻对As(Ⅴ)的无可观测效应质量浓度(NOEC)和最低可观测效应质量浓度(LOEC)一致，均表现为β-P和ATP-P源下两者相同(NOEC和LOEC分别为： 104 μg·L-1和105 μg·L-1)，而 DIP源要高出DOP源1个数量级(NOEC和LOEC分别为： 105 μg·L-1和106 μg·L-1)，说明对所选择的3种磷源而言藻体对As(Ⅴ)的毒性响应不受DOP形态差异的影响，仅与其摄取的磷源是有机还是无机形态有关； 无机形态磷可显著减轻铜绿微囊藻受As(Ⅴ)的胁迫.

图 4 不同磷源下As(Ⅴ)对铜绿微囊藻96h的生长胁迫及S型剂量-响应曲线拟合 Fig. 4 The M. aeruginosa 96h growth (D,Chl-a and Yield) dependence on As(Ⅴ) concentrations under different phosphorus regimes

表 2 不同磷源下各指标所得96h EC50/μg·L-1 Table 2 96h EC50 obtained from D,Chl-a and Yield under different phosphorus regimes/μg·L-1

尽管不同指标所得出的96 h EC50间存在较大差异，但不同磷源下藻体对As(Ⅴ)的耐受性均表现为： DIP>β-P>ATP-P (表 2).DIP为磷源时所得到的96 h EC50值以D指标为最高，其次是Chl-a； Yield指标则表现为最敏感，较Chl-a和D要低近3个数量级. 与此相反，β-P和ATP-P为磷源时的96 h EC50则表现为： D＜Chl-a＜Yield，说明藻体对As(Ⅴ)的毒性响应受磷源不同而表现为生理指标间存在较大差异. 各磷源下由D和Chl-a得出的96 h EC50数量级相一致，而由Yield值则表现出明显的不同，这与先前研究所证实的D和Chl-a具有很好相关性，而Yield并非藻体营养缺乏与否的较好衡量指标[36]相一致. Yield作为反映藻体生长潜能的重要指标，由其得出的不同磷源下藻体对As(Ⅴ)的96 h EC50间较D和Chl-a而言具有较好的区分度(表 2)，可很好地表征不同磷源下As(Ⅴ)对藻细胞的胁迫响应.

3 结论

(1) 以DOP为磷源的铜绿微囊藻生长较缓； 铜绿微囊藻可单独利用有机的β-P和ATP-P磷源进行生长，但更易吸收利用环境中低分子量的β-P，其在β-P磷源下生长相对更好.

(2) DOP磷源下介质中DIP质量浓度的增加证实铜绿微囊藻可将DOP进行磷酸化，且对介质中高分子量的ATP-P的磷酸化更快.

(3) Yield不能作为不同磷源下藻体营养缺乏与否的稳定性衡量指标，但其可以很好地表征As(Ⅴ)对藻细胞的胁迫响应.

(4) 不同磷源下铜绿微囊藻对As(Ⅴ)的耐受性均表现为： DIP>β-P>ATP-P，与其在不受As(Ⅴ)影响时的生长相一致. 由D、 Chl-a和Yield得出的96h EC50表明铜绿微囊藻对As(Ⅴ)的生长响应在DIP源下以Yield表现最敏感，而DOP磷源下D最为敏感.

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