环境科学  2016, Vol. 37 Issue (7): 2563-2569   PDF    
引用本文
卢思丹, 孙寓姣, 赵轩, 王蕾, 郑丹阳 . 降水对沣河水质和水体微生物的影响[J]. 环境科学,2016, 37(7): 2563-2569.
LU Si-dan, SUN Yu-jiao, ZHAO Xuan, WANG Lei, ZHEN Dan-yang . Impact of Precipitation on Fenghe River Water and Aquatic Microorganisms[J]. Environmental Science,2016, 37(7): 2563-2569.
降水对沣河水质和水体微生物的影响
卢思丹 , 孙寓姣 , 赵轩 , 王蕾 , 郑丹阳     
北京师范大学水科学研究院, 北京 100875
收稿日期: 2015-11-11; 修订日期: 2016-03-04.
基金项目:国家自然科学基金项目(51178048,51378064);北京师范大学自主科研基金项目(2014KJJCB22)
作者简介: 卢思丹(1992~),女,硕士研究生,主要研究方向为环境微生物,污水处理,E-mail:1554619997@qq.com
通讯联系人, 孙寓姣,E-mail:sunyujiao@bnu.edu.cn
摘要: 沣河作为重要的饮用水源地,其水质条件问题一直受到关注,除了通过化学方法探究沣河水体的污染状况外.微生物的群落结构等信息也能在一定程度上反映水体污染情况,并且通过了解微生物群落结构随水质的变化,可以更深入地了解水污染与微生物的响应关系.通过化学检测研究降水变化(丰水期与枯水期)造成的沣河水质改变,并借助Illumina高通量测序方法的结果,发现微生物群落的优势种属是不动杆菌属(Acinetobacter)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、假单胞菌属(Pseudomonas)和埃希式杆菌属(Escherichia)等,且丰水期优势菌属相比于枯水期出现了与人类活动相关的肠杆菌属和黄杆菌,表明丰水期河水受到更多的人类活动的影响;枯水期的沣河整体水质较丰水期较差,但是枯水期的微生物群落结构更稳定,多样性条件也更好.
关键词: 沣河      降水      水质      微生物      Illumina测序     
Impact of Precipitation on Fenghe River Water and Aquatic Microorganisms
LU Si-dan , SUN Yu-jiao , ZHAO Xuan , WANG Lei , ZHEN Dan-yang     
College of Water Sciences, Beijing Normal University, Beijing 100875, China
Abstract: In view of that the Fenghe River water pollution has become more and more serious, nitrogen and organic matter pollution were put forward as the important study targets. Community structure of the microorganisms could reflect the water pollution condition to a certain degree. By investigating the correlation between the water condition changes and the microbial community variation, it make possible to look upon river pollution from different perspectives. By the use of Illumina high-throughout sequencing, we found that the dominant genera were Acinetobacter, Comamonadaceae, Pseudomonas and Escherichia in Fenghe River aquatic environment. Flavobacterium and Enterobacteriaceae which are known as bacteria closely related to human activities, were found to account for larger percentages in the wet season than in the dry season, thus showing that the river was more influenced by anthropogenic activities in the wet season. The water quality was better in the wet season, while the microbial community structure was more stable and the diversity condition was better in the dry season. From the aspect of chemical pollution and microbe, this research helps to carry out planning for protection of drinking water sources and improvement of water environmental condition.
Key words: Fenghe River      precipitation      water pollution      microbe      Illumina sequencing     

沣河地处西安市西南部，属于渭河右岸的一级支流，西安市第三大河流. 自1998年至今，沣河及其支流被列为西安市地表饮用水源地，国内河流的普遍污染现状与人们对饮用水源地水质安全的关注，使沣河的污染状况在近些年得到更多研究[1, 2].

造成沣河污染的两大因素. 首先是降水和地表径流对河水水质条件的影响： 近年来，人们生活、 生产中的燃煤燃气及燃油量不断增加，导致居住区、 工厂等人类活动区排放的废气、 粉尘等严重污染了人们生存的大气环境[3]，同时由于降雨过程的发生，空气中的粉尘颗粒物、 可溶性的气体随雨水降落至地面,对沣河河水造成污染. 有研究表明，随着降雨的进行，河流水体中COD、 NO3--N 等参数有明显下降趋势，随后此类污染物浓度随着降雨引起的流量增大而上升，最后随降雨量减小，地表径流也相应减小，水质恢复至正常； 而河流水体中的NO3--N、 TN、 TP参数从降雨开始一直增大，至降水最大流量时达最大值，随后这些参数随河流流量降低而下降[4]. 有研究发现，地表径流造成水质变化的原因，是由于降雨冲刷裸露土壤，使土壤颗粒中的污染物如化肥、 农药、 牲畜的粪便等被雨水径流携带至水体中，对水质造成污染，导致河水水质发生变化[5]. 由此可见，雨水降水量可以影响沣河枯水期与丰水期的变化. 造成河流污染的另一个因素是土地利用方式[6, 7]，国内外许多资料表明，土地利用方式对流域水环境具有强烈的影响[8]，人类在集水区内的一切活动，如果未在适宜的土壤保育措施下进行，都可能对水环境产生影响[8].

微生物代谢作用是实现河流中很多污染物的循环的主要方式. 比如，环境中的氮素污染物，是通过硝化细菌与反硝化细菌等生物作用得到降解. 硝化细菌以氨氮为底物，氨氮浓度较低时难以满足硝化细菌的需求，但浓度过高时又可能会抑制硝化细菌，所以水体氨氮浓度对硝化细菌群落结构影响较大[9, 10]. 对于其他降解有机物与氮污染物的细菌，河流水体的污染物类型和浓度对微生物群落也造成很大的影响[11]. 河水中微生物的群落结构是对水质条件的良好反映[12]，通过了解微生物在河流上下游与枯丰水期的优势种群分布及典型特征，也可以帮助更深入了解河流污染，从而改进现有的饮用水源地治理保护方法[13, 14].

为了得到沣河水体中微生物的信息，了解更多的河流污染与响应情况，用Illumina 测序方法进行细菌的测序来了解河水中微生物的名称、 群落结构、 多样性等信息[17]. Illumina 是目前最新的高通量测序方法之一，高通量测序(HTS)技术又称“下一代”测序(NGS)技术，能一次并行对几百万到上千万条DNA 分别进行测序. 自2005年Roche、 Illumina 和ABI 等公司推出下一代高通量测序仪以来，基因组测序变得通量高、 测序时间和成本不断下降，使得NGS 技术被广泛应用于基因组学、 测全序、 表观基因组学以及功能基因组学中

1 材料与方法 1.1 研究断面的设置

样品采集尽量考虑在河流每个分支设置采样点，分别于丰水期和枯水期在沣河上下游干流和部分支流处设置了12个采样断面，其分布情况见图 1.

图 1 沣河水样采样点示意 Fig. 1 Twelve sampling sites of Fenghe River

1.2 水样采集

用有机玻璃采样器采集水深0.m左右处水样，用于水体微生物基因组DNA提取的水样，注入洗净灭菌后的玻璃瓶中低温带回. 其它水样用预先洗净的聚乙烯采样瓶采集，低温带回实验室检测.

1.3 水质监测

现场监测获得了部分水质指标，对于不能现场快速监测的项目，即TN(总氮)、 NH4+-N(氨氮)、 NO3--N(硝氮)、 NO2--N(亚硝氮)、 COD(化学需氧量)、 BOD(生化需氧量)、 TP(总磷)等，将水样送往检测中心，采用纳氏试剂光度法测水中氨氮，所用试剂为纳氏试剂； 采用酚二磺酸光度法测定硝酸盐氮，所用试剂为氢氧化钠(NaOH，分析纯)，酚二磺酸等； 用N-(1氨基)-乙二胺光度法测定亚硝酸氮，所用试剂为α-萘乙二胺试剂. 其它可能需要如： 碘化钾(KI，分析纯)； 磷酸(H2PO4，分析纯)； 氨水(NH3H2O，分析纯)； 高锰酸钾(KMnO4，分析纯)； 草酸钠(Na2C2O4，分析纯)等试剂. 对水体pH、 温度、 溶解氧(DO)、 电导率等也进行了检测.

1.4 DNA提取

水样于24h 内经0.22 μm 醋酸纤维素滤膜过滤，浓缩生物样品. 滤膜放置-20℃ 保存. 使用Omega Water DNA Kit(快速水质DNA 提取试剂盒)按其操作说明提取水体微生物的总DNA. 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测结果,用NanoDrop仪器检测DNA浓度.

1.5 16S PCR(聚合酶链式反应)及Illumina测序

使用带有12个barcode的引物515F (5′-GTGC CAGCMGCCGCGGTAA-3′) 和 909R (5′-CCCCG YCAATTCMTTTRAGT-3′)来扩增V4高变区的16S rDNA基因，PCR的混合物为25μL，其中以1 μL DNA样品为模板，PCR 扩增体系含有： 2×Mix Master 12.5 μL，1.0 μmol·L-1上下游引物各1 μL，无菌水补齐至25 μL. PCR的扩增程序： 94℃/3 min； 94℃/40 s，56℃/1 min，72℃/1 min，30个循环，72℃/10 min. 使用无菌水替代DNA 模板作为阴性对照. PCR 产物用1.0%琼脂糖电泳进行检测，并切胶回收. 最后建库，Illumina 仪器上机测序，对于测序结果，根据每个样品引物上的Barcode 识别双末端测序的原始序列,去除引物，得到16S rRNAV6 片断，质量控制. 将得到的干净序列用UCHIME筛选嵌合体并去除嵌合体序列，采 用 分 阶 段 聚 类 算 法 (TSC)将去除了嵌合体的序列聚类成操作分类单元(OTUs)，最后对OTUs 进行分类.

2 结果与分析 2.1 沣河水质特征

降水量在河流的丰水期和枯水期有很大的不同，丰水期的河流水量受到直接降水和雨水汇流等补给而增大，枯水期由于降水较少，地表径流汇入也少，所以水量较丰水期小. 通过分析河流水质，如表 1所示，从采样点1~12，即从沣河上游到下游，各水质指标(氨氮、 硝氮、 亚硝态氮、 化学需氧量与生化需氧量)呈现持续增加的规律，枯水期COD的平均浓度在22mg·L-1，而在丰水期的浓度都<10mg·L-1，丰水期的浓度明显小于枯水期. 氨氮等指标也均在丰水期小于枯水期. 可见丰水期的污染情况较枯水期更轻. 这可能是因为自然降水受到流域气候和周围地区污染状况的影响，降水中携带污染物质，污染物质进入河流，对水质产生污染[15, 16].

表 1 沣河河水的氮指标与有机物含量 Table 1 Indexes of nitrogen pollution and contents of organic matter in Fenghe River

沣河的源头是陕西省长安区喂子坪乡鸡窝子以南的秦琳北侧，源头至丰裕口全段长为20km,源头处的河床为大块砾石，水质清澈. 结合国内研究结果，分析沣河流域遥感图可以得出，流域内以上游地区的林地最多，其次是耕地面积，再其次是建设用地，而草地、 水域和未利用地面积所占比重很小[18, 19]. 在沣河下游，土地利用程度增加，建设用地等所占比例增大[20]. 这和水质数据上的氨氮等变化趋势相符合.

2.2 微生物多样性

从沣河的上游到下游地区，Illumina测序得到的结果表明(如表 2)，测出OTU数4 370个，多样性和检出的物种数目分别都有变化，但在大体上呈增加的趋势，并且丰水期的各项多样性及种类数平均都小于枯水期. 其中枯水期的Chao1指数最大是4 161.18，丰水期的最大Chao1指数是3 365.33，明显小于枯水期. 多样性指数的变化幅度枯水期大于丰水期，种数变化幅度在丰水期稍大于枯水期. 这说明枯水期的各项生物多样程度较丰水期更好，而微生物的多样性既体现了生物之间及环境之间的复杂关系，又体现了生物资源的丰富性，因此可见枯水期的群落结构也更稳定.

表 2 微生物多样性指数、 丰富度指数及种分类水平的个数 Table 2 Diversity indexes,sequences per sample and observed species of microorganisms

3 讨论 3.1 稀释度曲线

稀释度曲线是采用对测序序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与它们所能代表OTU的数目构建曲线，即稀释性曲线. 当曲线趋于平坦时，说明测序数据量合理，更多的数据量对发现新OTU的边际贡献很小； 反之则表明继续测序还可能产生较多新的OTU. 如图 2，结果中的大部分曲线在尾部的上升趋势均趋于平缓，当每个样品的序列达到4 000时，检测出的细菌种类大都停留在1 300个左右，说明本次测序的数据量合理，结果可靠. 但是结果中丰水期的微生物种类数量平均约767个，枯水期约916个，枯水期的细菌种类平均值更高.

图 2 丰水期沣河水中微生物群落结构 Fig. 2 Microbial community structure of the Fenghe River water in the wet season

3.2 微生物群落结构

由测序结果(N-5数据缺失)得到，枯水期微生物群落结构中，如图 3，埃希式杆菌属(Escherichia)、 不动杆菌属(Acinetobacter)、 丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、 假单胞菌属(Pseudomonas)和 罗尔斯通菌属(Ralstonia)是占总菌群的比例最大的优势菌属，它们构成沣河在枯水期的基本群落结构. 自上游到下游，埃希式杆菌和不动杆菌的数量明显减少，丛毛单胞菌科的数量也有小幅的减小，鞘脂杆菌相关细菌在下游增多并占较大比，这可能与难降解有机物在下游逐渐地降解相关，可见上下游的微生物群落发生规律性变化

图 3 枯水期沣河水中微生物群落结构 Fig. 3 Microbial community structure of the Fenghe River water in the dry season

在丰水期(图 4)，沣河的微生物群落结构相比枯水期没有很大的变动： 不动杆菌属(Acinetobacter)、 黄杆菌属(Flavobacterium)、 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、 假单胞菌属(Pseudomonas)和丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)占细菌比例最大，丰水期与枯水期群落结构的区别是各个优势菌属的优势地位有所变化： 在枯水期最多的埃希式杆菌属被丰水期的不动杆菌代替.

图 4 丰水期沣河水中微生物群落结构 Fig. 4 Microbial community structure of the Fenghe River water in the wet season

对比枯水期可发现，丰水期出现了相比在枯水期中更优势的黄杆菌属与肠杆菌科细菌，并占较大比例. 黄杆菌纲主要存在于水生环境中，也会在食物中存在. 肠杆菌科包括无芽孢、 周身鞭毛或无鞭毛的革兰氏染色阴性直杆菌，化能有机营养，兼营呼吸代谢和发酵代谢，部分种属可寄生人体，属于和人类活动有密切关系的细菌. 可见丰水期由于降水量的增加，降水或者径流携带污染汇入河流，使沣河间接受到更多人类活动的干扰.

3.3 统计分析

通过PCA(主成分分析)可以发现，枯水期与丰水期的沣河水中微生物群落分别呈显著的聚集分布，而两个时期的微生物群落结构有明显区别： 丰枯水期分别聚类在图 5中的左侧与右侧，这个结果表明，由于降水的影响，沣河上游到下游的微生物群落结构均发生了改变，而且相比于上下游的地理位置差异等因素造成的差异，降水对群落结构的影响更加显著. PCA分析的结果也佐证了图 3、4的结果.

图 5 基于沣河水中微生物群落结构的PCA分析 Fig. 5 PCA analysis of the microbial community structures of the Fenghe River water

4 结论

沣河枯水期微生物群落的优势种属是埃希式杆菌属(Escherichia)、 不动杆菌属(Acinetobacter)、 丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)、 假单胞菌属(Pseudomonas)和 罗尔斯通菌属(Ralstonia)等，丰水期的优势种属是不动杆菌属(Acinetobacter)，黄杆菌属(Flavobacterium)、 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、 假单胞菌属(Pseudomonas)和丛毛单胞菌科(Comamonadaceae). 不同时期的沣河水中微生物群落结构明显不同： 枯水期的水质较差，但微生物群落结构稳定，多样性条件也更好. 丰水期由于降水使河水受到更多的人类影响，尽管丰水期由于水量的稀释作用，水体质量得到保持甚至更好，可是丰水期的生物多样性变差，优势菌属结构中不动杆菌，黄杆菌优势更明显，同时与人类活动干扰密切相关的种属(肠杆菌)在丰水期的数量增加、 占比明显增大.

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