地表臭氧(O₃)是一种普遍存在的光化学二次污染物和温室气体^[1]. 随着工业化与城市化的快速发展，化石燃料消耗持续增加、 氮肥大量使用以及汽车尾气排放急剧增加，从而导致O₃浓度随氮氧化合物及挥发性有机化合物(VOCs)等含量增加而升高^[2~4]. 近30年来，全球O₃浓度正以每年0.5%~2.0%的速度上升^[5]. 根据IPCC第五次评估报告^[6]显示，2015~2050年O₃浓度将会继续上升20%~25%，如果当前排放的前体物浓度不能得到有效控制，到2100年O₃浓度将继续上升40%~60%. 而我国O₃污染更为严重，特别是在经济发展迅速、 人口密集的地区. 研究表明，我国华北平原白天小时O₃浓度最大值已超过300 nmol ·mol^-1[7]，模型预测可知，至2020年夏季，中东部O₃浓度小时平均值可达到70 nmol ·mol^-1，华北平原甚至达到80~105 nmol ·mol^-1[8].

高浓度O₃能对植物产生氧化伤害，引起光合速率下降，生长缓慢，生产力下降，进而影响土壤微生物以及酶活性，影响营养元素吸收及其在植物体内的分配，从而表现为森林衰退，农作物减产^[9~14]. 光合作用是植物对O₃浓度升高较为敏感的生理过程. Wittig等^[15]发现工业革命后随着O₃浓度升高，树木叶片的光合速率与气孔导度分别下降11%和13%. 高浓度O₃引起的光合速率降低，多归因于气孔和非气孔限制的共同作用. 气孔是O₃进入植物并引起毒害作用的重要途径，气孔的关闭可减少进入到质外体的O₃通量，同时也会降低CO₂的进入，从而降低光合作用^[16]. 也有研究认为，O₃可直接作用于叶绿体，使光合能力下降，成为限制光合作用的非气孔因素^[17~21]，其中包括RUBP羧化和再生限制，植物体内O₃生成的活性氧自由基引发的光合器官结构与功能的破坏，以及细胞内物质和能量代谢的失调等.

杨树是地球中纬度平原地区栽培面积最大的速生用材之一，具有生长快、 成林早、 产量高和易于更新等特点，因而被广泛用于集约栽培. 我国具有丰富的杨树资源，天然种有50多种，广泛用于生态防护林和工业用材林. 天然林面积约300万hm²，人工林面积约700万hm^{2[22, 23]}. 杨树产业的发展，不仅有效缓解了中国用材供应的紧张状况，改善了中国森林资源结构，而且优化了农村产业结构，促进了广大农民增收. 但是，杨树对O₃极为敏感，随着O₃浓度的升高，会造成生长速率减慢，光合作用降低，生物量累积减少等^[24~27]. 而国内当前O₃浓度特别是北京地区已远远超过了树木生长的受害临界水平^{[28, 29]}，对杨树造成了明显的可见伤害^[30]，从而进行O₃对其生长以及生理影响的研究尤为重要.

当前，O₃对植物伤害的定量关系大多是建立在生长末期生物量以及产量的减少、 可见伤害症状与生长季累积的O₃浓度之间得到的^[31~34]，而根据生理指标进行敏感性评价及相应的O₃剂量关系研究尚少^{[35, 36]}. 考虑到树木生长缓慢，生长末期收获生物量在实际生产过程中很难实现，因此，本研究根据不同O₃处理下的3种杨树光合生理指标的响应，建立O₃浓度与光合指标的剂量关系，以期为大气O₃污染下杨树基因型筛选培育及保护杨树免受O₃伤害提供科学依据.

该实验区位于北京市昌平区马池口镇种子站(E116°13′，N40°19′)，属于大陆性季风气候，年降水量550 mm，年平均气温11.8℃，夏季平均气温24~26℃，年平均日照时数在2 000~2 800 h之间，全年无霜期180~200 d.

该实验采用中国林业科学研究院提供的3种不同基因型杨树(Populus)幼苗： ‘84 K’(Populus abla×P. glandulosa)，‘546’(P. deltoids cv. ‘55/56’×P.deltoides cv. ‘Imperial’)和‘90’(P. deltoids×P. cathayana cv. Senhai 2). 2014年4月将长势较为一致的幼苗统一移入20L的圆形花盆中，并全部移入开顶式气室，以适应气室内环境，10 d后进行O₃熏蒸处理.

本实验在6个开顶式气室(OTC)中进行，OTC为高2.0 m、 边长1.0 m的正八面柱体. 为减少外界气体对气室内气体的影响，在柱体顶端加了一个高1 m、 倾斜角为45°的收缩口. 气室由钢架和钢化玻璃组成. 实验处理共设置6个水平： CF(过滤大气,[O₃]＜40 nmol ·mol^-1)、 NF(环境大气[O₃])、 NF20(NF+20 nmol ·mol^-1[O₃])、 NF40(NF+40 nmol ·mol^-1[O₃])、 NF60(NF+60 nmol ·mol^-1[O₃])、 NF80(NF+80 nmol ·mol^-1[O₃]). 每个气室内每种树至少5株幼苗，并随机分布. 实验期间每3~5 d将OTC内植株随机移动，以消除气室内部间差异可能引起的影响. 每月将幼苗在OTC之间随机互换，同时相应OTC更换为植物之前对应的O₃熏蒸浓度，以消除罩子间的小气候差异带来的影响^[18].

实验期间各个罩子的O₃浓度由美国热电公司49i臭氧分析仪监测，O₃熏蒸时间为5月7日至9月29日. 每日熏气时间最长为9 h(08：30~17：30)，阴雨天停止熏气. 所有O₃处理的目标熏蒸浓度与实际监测的平均O₃浓度(24、 12和8 h)和AOT40(实验期间小时O₃浓度超过40 nmol ·mol^-1的累计值)详见表 1.

表 1 (Table 1)

表 1 2014年5月7日至9月29日实验期间O3浓度 Table 1 O3 concentrations during the experiments from May 7 to Sep.29,2014 目标 24 h平均/nmol ·mol-1 12 h平均/nmol ·mol-1 8 h平均/nmol ·mol-1 AOT40/μmol ·mol-1 ·h CF 25.7 28.1 28.0 15.1 NF 35.7 48.4 53.2 33.5 NF20 41.4 59.4 67.1 48.9 NF40 46.3 69.4 79.5 64.6 NF60 52.8 81.9 95.4 86.7 NF80 58.1 92.4 108.7 105.2

表 1 2014年5月7日至9月29日实验期间O3浓度 Table 1 O3 concentrations during the experiments from May 7 to Sep.29,2014

采用Li-6400便携式光合测定仪(美国LI-COR公司)测定叶片的气体交换参数和叶绿素a 荧光参数. 其中气体交换参数包括净光合速率(P_n)、 气孔导度(G_s)、 蒸腾速率(T_r) 和胞间CO₂浓度(c_i)； 叶绿素a 荧光参数包括： 电子传递速率(ETR)、 PSⅡ反应中心激发能捕获效率(F′ _v/F′_m)、 光化学猝灭系数(qP)、 PSⅡ实际光化学量子效率(PhiPS2). 具体测定方法： 晴天上午09：00~11：00，每处理每基因型选取4~5株作为待测植株，每株选取2~3片中部邻近健康叶片. 瞬时光合测定时设定的光强为1 200 μmol ·(m² ·s)^-1，CO₂浓度为380 μmol ·mol^-1，空气流速为0.5 L ·s^-1,气温控制在环境温度±1℃，相对湿度为45%±5%. 叶片的瞬时水分利用效率(WUE)由叶片的P_n/T_r 计算得到.

用0.36 cm²的打孔器将测定光合作用的叶片打孔2片，用体积分数为95%的乙醇提取，分别于664、 649与470 nm处测定吸光度，根据Lichtenthaler^[37]的修正公式计算叶绿素a(Chla)、 叶绿素b(Chlb)、 叶绿素总量(Chla+b)和类胡萝卜素(Car)含量.

实验数据先用Excel 2010进行初步整理，然后在SPSS 19.0进行双因素方差分析，采用Duncan法进行多重比较，进行不同处理之间的显著性结果分析，检验O₃、 基因型以及两者之间的交互作用对各指标的影响. P≤0.05 认为是处理间达到显著性差异. 运用Sigmaplot 10.0绘制光合作用特征指标与AOT40的线性关系图，并用Spearmans相关关系检验线性关系的显著性.

双因素方差分析结果表明，O₃处理显著影响了杨树的P_n、 c_i、 T_r和WUE，对G_s影响不显著(P=0.511)； 不同基因型杨树之间的各个参数均有显著性差异； 而不同基因型杨树对O₃的响应是一致的，因此表现出交互作用不显著(表 2). 具体来讲，随着O₃浓度的升高，3种基因型杨树的P_n均呈显著的线性下降趋势(P<0.01)，其下降斜率分别为-0.121 (‘546’)、 -0.104 (‘90’)和-0.105 (‘84K’)[表 3和图 1(a)]. 与CF相比，NF80处理下‘546’、 ‘90’和‘84K’的P_n分别降低75%、 69%和72%. 相反，3种基因型杨树c_i随着O₃浓度升高呈显著上升趋势(P<0.05) [图 1(c)]，但多重比较的结果表明不同O₃处理下各基因型杨树c_i无显著差异(表 2). 不同O₃处理下，基因型‘84K’的G_s和T_r呈显著线性下降趋势(P<0.01) [表 3、 图 1(b)和1(d)]，但多重比较结果显示不同O₃处理对3种基因型杨树G_s和T_r的影响不显著(表 2). 随着O₃浓度的升高，3种杨树WUE均呈线性下降(P<0.05)，从响应的斜率得出‘546’比‘90’和‘84K’对O₃浓度升高更为敏感(表 3和图 2). 其中，与CF相比，3种基因型杨树NF80处理的WUE显著降低62%(表 4和图 2). 总的来看，O₃对‘546’的气体交换参数的影响要显著大于‘90’和‘84K’(表 5).

表 2 (Table 2)

表 2 O3与基因型及其交互作用对杨树叶片气体交换、 叶绿素a 荧光参数和光合色素的双因素方差分析结果 Table 2 The P values of two-way ANOVA of O3 treatments,genotypes and their interactions on the gas exchange,chlorophyll a fluorescence and photosynthetic pigments of poplar 项目 Pn Gs ci Tr WUE F′v /F′m PhiPS2 qP ETR Chla Chlb Chla+b Car O3 <0.001 0.511 <0.001 0.011 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 genotypes <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001 0.001 <0.001 <0.001 O3×genotypes 0.063 0.939 0.907 0.424 0.902 0.647 0.261 0.400 0.262 <0.001 <0.001 <0.001 <0.001

表 2 O3与基因型及其交互作用对杨树叶片气体交换、 叶绿素a 荧光参数和光合色素的双因素方差分析结果 Table 2 The P values of two-way ANOVA of O3 treatments,genotypes and their interactions on the gas exchange,chlorophyll a fluorescence and photosynthetic pigments of poplar

图 1

Fig. 1

图 1 不同O3处理下3种基因型杨树气体交换参数变化 Fig. 1 Changes of gas exchange parameters of three poplar genotypes in different O3 treatments

表 3 (Table 3)

表 3 不同O3处理下3种基因型杨树气体交换参数、 叶绿素a 荧光参数和光合色素与AOT40的线性关系 Table 3 Linear equations between AOT40 and gas exchange,chlorophyll a fluorescence and photosynthetic pigments of three poplar genotypes of poplar in different O3 treatments 项目 ‘546’ ‘90’ ‘84K’ 方程 R2 P 方程 R2 P 方程 R2 P Pn Y=-0.121 0[AOT40]+15.4 0.961 <0.001 Y=-0.104 1[AOT40]+12.5 0.953 <0.001 Y=-0.105 2[AOT40]+11.8 0.960 <0.001 Gs Y=-0.000 2[AOT40]+0.5 0.039 0.707 Y=-0.000 5[AOT40]+0.2 0.473 0.131 Y=-0.0012[AOT40]+0.2 0.851 0.009 ci Y=0.560 4[AOT40]+321.5 0.948 0.001 Y=0.784 5[AOT40]+244.8 0.799 0.016 Y=0.639 8[AOT40]+235.6 0.843 0.010 Tr Y=-0.004 4[AOT40]+8.4 0.151 0.447 Y=-0.018 0[AOT40]+7.6 0.401 0.177 Y=-0.038 2[AOT40]+5.9 0.862 0.008 WUE Y=-0.014 9[AOT40]+1.9 0.989 <0.001 Y=-0.011 8[AOT40]+1.7 0.915 0.011 Y=-0.010 9[AOT40]+2.1 0.928 0.008 F′v /F′m Y=-0.002 2[AOT40]+0.5 0.975 <0.001 Y=-0.001 8[AOT40]+0.4 0.839 0.010 Y=-0.001 9[AOT40]+0.4 0.994 <0.001 PhiPS2 Y=-0.002 0[AOT40]+0.3 0.992 <0.001 Y=-0.001 9[AOT40]+0.3 0.814 0.014 Y=-0.001 6[AOT40]+0.2 0.975 <0.001 qP Y=-0.002 8[AOT40]+0.6 0.989 <0.001 Y=-0.003 0[AOT40]+0.7 0.768 0.022 Y=-0.002 6[AOT40]+0.5 0.950 <0.001 ETR Y=-1.032 1[AOT40]+142.8 0.992 <0.001 Y=-0.991 7[AOT40]+139.3 0.814 0.014 Y=-0.821 5[AOT40]+104.8 0.975 <0.001 Chla Y=-0.172 9[AOT40]+18.4 0.943 0.001 Y=-0.049 9[AOT40]+13.6 0.392 0.184 Y=-0.014 0[AOT40]+7.6 0.047 0.680 Chlb Y=-0.065 4[AOT40]+6.8 0.953 <0.001 Y=-0.017 0[AOT40]+4.8 0.421 0.163 Y=-0.003 2[AOT40]+2.9 0.018 0.801 Chla+b Y=-0.238 2[AOT40]+25.2 0.946 0.001 Y=-0.066 9[AOT40]+18.4 0.399 0.178 Y=-0.017 1[AOT40]+10.5 0.038 0.710 Car Y=-0.036 0[AOT40]+4.9 0.922 0.002 Y=-0.008 0[AOT40]+3.7 0.207 0.364 Y=-0.004 8[AOT40]+2.4 0.086 0.574

表 3 不同O3处理下3种基因型杨树气体交换参数、 叶绿素a 荧光参数和光合色素与AOT40的线性关系 Table 3 Linear equations between AOT40 and gas exchange,chlorophyll a fluorescence and photosynthetic pigments of three poplar genotypes of poplar in different O3 treatments

表 4 (Table 4)

表 4 不同O3处理下杨树气体交换参数、 叶绿素a 荧光参数的差异比较统计结果 Table 4 Results of multiple comparisons of gas exchange,chlorophyll a fluorescence of Poplar in different O3 treatments due to no significant interaction between O3 and Poplar genotypes 项目 Pn Gs ci Tr WUE F′v /F′m PhiPS2 qP ETR CF a a c ab a a a a a NF a a bc a a a a a a NF20 b a bc ab ab a a ab a NF40 c a b ab b b b bc b NF60 c a b b b bc bc cd bc NF80 d a a ab c c c d c 1)不同字母表示显著性差异P<0.05，下同

表 4 不同O3处理下杨树气体交换参数、 叶绿素a 荧光参数的差异比较统计结果 Table 4 Results of multiple comparisons of gas exchange,chlorophyll a fluorescence of Poplar in different O3 treatments due to no significant interaction between O3 and Poplar genotypes

表 5 (Table 5)

表 5 全部O3处理下3种基因型杨树的气体交换参数、 叶绿素a荧光参数和叶绿素的差异比较统计结果 Table 5 Results of multiple comparisons of gas exchange,chlorophyll a fluorescence and chlorophyll contents of three poplar genotypes across O3 treatments due to no significant interaction between O3 and Poplar genotypes Genotypes基因型 Pn Gs ci Tr WUE F′v /F′m PhiPS2 qP ETR ‘546’ a a a a b a a b a ‘90’ b b b b b b a a a ‘84K’ c b c c a c b c b

表 5 全部O3处理下3种基因型杨树的气体交换参数、 叶绿素a荧光参数和叶绿素的差异比较统计结果 Table 5 Results of multiple comparisons of gas exchange,chlorophyll a fluorescence and chlorophyll contents of three poplar genotypes across O3 treatments due to no significant interaction between O3 and Poplar genotypes

图 2

Fig. 2

图 2 不同O3处理下3种基因型杨树水分利用效率变化 Fig. 2 Changes of water use efficiency of three poplar genotypes in different O3 treatments

双因素方差分析结果显示，O₃处理和不同基因型杨树间的F′_v /F′_m、 PhiPS2、 qP和ETR均有极显著 差异(P<0.01)，但O₃与杨树的交互作用对叶绿素a荧光参数无显著影响(P>0.05，表 2). 随着O₃浓度升高，3种基因型杨树的F′_v /F′_m、 PhiPS2、 qP和ETR呈线性降低趋势(P<0.05，图 3). 与CF相比，NF40处理下 ‘546’和‘90’的F′_v /F′_m、 PhiPS2和ETR显著下降，分别降低19%与26%，34%与41%，34%与41%； 相比之下，qP分别在NF60 (‘546’) 和NF80 (‘90’)较CF显著降低. 而‘84K’则与‘546’和‘90’差异较大，其F′_v /F′_m在NF20，PhiPS2、 qP和ETR在NF60下与CF相比有显著下降. 从不同基因型的叶绿素a 荧光参数响应程度来看，‘84K’要小于‘546’和‘90’，但3种基因型杨树对O₃的响应是一致的(图 3和表 5).

图 3

Fig. 3

图 3 不同O3处理下3种基因型杨树叶绿素a 荧光参数变化 Fig. 3 Changes of chlorophyll a fluorescence parameters of three poplar genotypes in different O3 treatments

方差分析结果显示： O₃处理和不同基因型杨树以及二者的交互作用对光合色素均有极显著性的影响(P<0.01，表 2). 从图 4中可知，‘546’随着O₃浓度升高，其Chla、 Chlb、 Chla+b、 Car均呈极显著线性下降(P<0.01). 和CF相比，O₃浓度升高至NF20 (Chla、 Chla+b)、 NF40 (Chlb、 Car)已引起‘546’基因型杨树的相应光合色素指标显著降低(表 6). ‘84K’基因型杨树的各光合色素对O₃的响应不显著(图 4和表 6). 从各指标斜率上来看，O₃敏感性为‘546’>‘90’>‘84K’.

图 4

Fig. 4

图 4 不同O3处理下3种基因型杨树光合色素变化 Fig. 4 Changes of photosynthetic pigments of three poplar genotypes in different O3 treatments

表 6 (Table 6)

表 6 不同O3处理下3种基因型杨树光合色素的多重比较结果 Table 6 Results of multiple comparisons of photosynthetic pigments of three poplar genotypes in different O3 treatments 基因型 项目 Chla Chlb Chla+b Car CF cdefg abcdef cdefg abcde NF hi def hi e ‘84K’ NF20 fghi bcdef efghi de NF40 ghi cdef ghi de NF60 defgh bcdef defgh cde NF80 ghi bcdef fghi de CF bcd abcd bcd abcd NF bc abc bc abc ‘90’ NF20 abc abc abc abc NF40 efgh bcdef defgh cde NF60 bcde abcde bcde abcd NF80 defgh bcdef defgh bcde CF a a a a NF ab ab ab ab ‘546’ NF20 bcdef abcd bcdef abcd NF40 defgh bcdef defgh bcde NF60 i f i e NF80 hi ef hi de

表 6 不同O3处理下3种基因型杨树光合色素的多重比较结果 Table 6 Results of multiple comparisons of photosynthetic pigments of three poplar genotypes in different O3 treatments

光合作用是绿色植物利用光合色素，以CO₂和H₂O为原料，将吸收的光能同化为有机物，并释放O₂的生化过程. O₃可通过多种途径影响光合作用. 首先，O₃会引起植物叶片气孔部分关闭. 气孔关闭必然会限制CO₂的进入，从而减少光合作用对CO₂的吸收，使光合速率下降. 其次，O₃可氧化叶绿体膜，破坏光合组织使叶绿体受损或减少，因而光合作用对于O₃浓度升高极为敏感. 研究证明，随着O₃浓度的升高，植物的光合速率均普遍下降. 而不同物种对于O₃的敏感性是不同的^[38]，正如李秋静等^[39]研究发现随着O₃处理时间的延长，尖叶杜英、 米老排和藜蒴幼苗的净光合速率虽然会出现显著下降，但通过主成分分析可知三者的敏感性由于各自抗O₃胁迫能力不同有着显著的差异，其中尖叶杜英最为敏感，藜蒴其次，耐受能力最强的为米老排. 而同一物种的不同基因型也有很大区别^[31]，本研究结果与其结论一致，3种基因型杨树P_n均出现显著性降低，但从线性关系的斜率中可以看出其敏感性不同，‘546’最为敏感，随着O₃升高P_n降低更快. 从图 1(b)中可以看出随着O₃浓度升高，除‘546’外，其他2种基因型杨树G_s均出现下降趋势，但统计分析并未达到显著水平(P=0.511)，可能因为高浓度O₃已经导致基因型‘546’的气孔调控失灵. 但3种基因型之间存在显著差异(P<0.001)，其中‘546’本身气孔导度绝对值明显高于其他两基因型杨树，这表明‘546’气孔O₃吸收量较其他基因型要大得多，这与其对O₃较为敏感有关^[35]. Farquhar等^[40]认为，如果G_s下降，而c_i不变或者上升，则P_n下降应是由叶肉细胞同化能力降低等非气孔因素所致； 当G_s与c_i同时下降时才能说明P_n下降主要由气孔限制引起的. 因此从本研究结果可以看出，G_s下降而c_i上升，气孔限制并非光合速率下降的主要原因. 从表 3可知，3种基因型杨树水分利用效率与O₃浓度呈显著负相关，基因型‘546’的WUE下降最快，其O₃敏感性最强，与前面结论一致.

随着O₃浓度升高，3种基因型杨树的叶绿素a 荧光参数均出现显著下降，且均与O₃浓度存在显著线性关系(P<0.01)，说明随着O₃浓度不断升高，其光能利用效率显著降低. F′_v /F′_m下降说明植物的光能捕获能力下降，主要是叶绿素含量下降所致. PhiPS2、 qP、 ETR显著下降，一方面可能是植物将所吸收的光量子转化为热能而耗散的结果，另一方面可能是电子传递、 能量转化受阻，光合结构PSⅡ受损^[41]，这与王亮等^[42]在臭氧FACE平台下对小麦的研究结果一致.

叶绿素是衡量植物光合能力的又一重要指标，其含量的变化往往与叶绿体的生理活性、 植物对环境的适应性和抗性有关. 根据本实验中叶绿素指标也可看出，叶绿素含量均显著下降，且与O₃浓度之间存在负相关. 但只有‘546’的斜率最大，敏感性最强，且叶绿素指标与O₃浓度之间线性关系达到显著水平，因此其与光合作用显著降低相对应. 由于受到O₃伤害，叶绿素含量及其组成发生变化，导致植物的光合作用受阻，降低了植物体的光合作用以及其新陈代谢，促进了植物叶片的衰老. 这与Zhang等^[43]研究O₃影响水杉的叶绿素变化态势相一致.

综上所述，从绝大多数光合作用特征指标特别是光合色素的O₃剂量线性响应关系来看，由于受到O₃伤害，导致气孔受损，电子传递受阻，叶绿素含量下降，从而影响植物的生长. 其中基因型‘546’通常表现出最大的斜率，基因型‘90’次之，基因型‘84K’斜率最小，因而可得知随着O₃浓度升高，3种基因型杨树的O₃敏感性为‘546’>‘90’>‘84K’.

由于本研究仅对光合作用特征指标与O₃剂量之间的线性关系进行了分析，进一步对抗氧化系统进行定量化分析将是今后研究的重点. O₃对于植物的影响虽然是一个累积过程，这种变化可能需要更长时间来验证，但随着时间的延长植物可能又会产生一定的适应能力，所以未来开展多年的长期实验研究，对于科学评价O₃的生态效应具有重要意义.

杨树光合作用指标对O₃浓度升高极为敏感，基因型之间存在显著差异，其中‘546’对O₃较为敏感，‘90’次之，而‘84K’抗性较强. 研究结果对于筛选抗O₃的杨树基因型提供科学依据.