环境科学  2016, Vol. 37 Issue (6): 2353-2358   PDF    
引用本文
尹乃毅, 都慧丽, 张震南, 蔡晓琳, 李泽姣, 孙国新, 崔岩山 . 应用SHIME模型研究肠道微生物对土壤中镉、铬、镍生物可给性的影响[J]. 环境科学,2016, 37(6): 2353-2358.
YIN Nai-yi, DU Hui-li, ZHANG Zhen-nan, CAI Xiao-lin, LI Ze-jiao, SUN Guo-xin, CUI Yan-shan . Effects of Human Gut Microbiota on Bioaccessibility of Soil Cd, Cr and Ni Using SHIME Model[J]. Environmental Science,2016, 37(6): 2353-2358.
应用SHIME模型研究肠道微生物对土壤中镉、铬、镍生物可给性的影响
尹乃毅1,2 , 都慧丽1,2 , 张震南1,2 , 蔡晓琳1,2 , 李泽姣1,2 , 孙国新2 , 崔岩山1,2     
1.中国科学院大学资源与环境学院, 北京 101408;
 2.中国科学院生态环境研究中心, 北京 100085
收稿日期: 2015-12-28; 修订日期: 2016-01-18.
基金项目:国家自然科学基金项目(41271493)
作者简介: 尹乃毅(1988~),男,博士研究生,主要研究方向为土壤重金属对人体的健康风险,E-mail:yinnaiyi12@mails.ucas.ac.cn
通讯联系人, 崔岩山,E-mail:cuiyanshan@ucas.ac.cn
摘要: 为了研究人体肠道微生物对土壤中Cd、Cr、Ni生物可给性的影响.本文采集我国一些地区的5种土壤,利用in vitro方法(PBET和SHIME联用)研究了这些土壤中Cd、Cr、Ni在胃、小肠、结肠阶段的生物可给性及其对人体的健康风险.结果表明,土壤中Cd、Cr、Ni在胃阶段的生物可给性分别为4.3%~94.0%、6.4%~21.6%、11.3%~47.3%;小肠阶段,土壤中Cr和Ni的生物可给性与胃阶段一致或有一定升高,但Cd的生物可给性降低了1.4~1.6倍(土壤2除外);胃肠阶段,Cd的平均生物可给性较高,而Cr的较低.结肠阶段,土壤中Cr和Ni的生物可给性均升高,是小肠阶段的1.3~2.4倍和1.0~2.1倍,分别达到了17.6%~38.7%和25.4%~56.0%;而Cd的生物可给性也升高(土壤3和4除外); Ni的平均生物可给性最高.由此可见,肠道微生物可以促进土壤中Cd、Cr、Ni的溶出释放,提高了三者的生物可给性,可能增大了人体的健康风险.
关键词: 土壤      金属生物可给性      人体肠道微生物      PBET方法      SHIME模型     
Effects of Human Gut Microbiota on Bioaccessibility of Soil Cd, Cr and Ni Using SHIME Model
YIN Nai-yi1,2 , DU Hui-li1,2 , ZHANG Zhen-nan1,2 , CAI Xiao-lin1,2 , LI Ze-jiao1,2 , SUN Guo-xin2 , CUI Yan-shan1,2     
1.College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 101408, China;
 2.Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China
Abstract: The influence of human gut micobiota on bioaccessibilities of soil Cd, Cr, and Ni were investigated in this study. Five soil samples were collected from some sites of China, and the bioaccessibilities of soil Cd, Cr, and Ni in the gastric, small intestinal, and colon phases were determined using the PBET method (physiologically based extraction test) combined with SHIME model (simulator of human intestinal microbial ecosystem). The results showed that the bioaccessibilities of Cd, Cr, and Ni in the gastric phase were 4.3%-94.0%, 6.4%-21.6%, and 11.3%-47.3%, respectively. In the small intestinal phase, the bioaccessibilities of Cr and Ni were either congruent or slightly increased, while for Cd, the values were reduced by 1.4-1.6 folds except for soil 2. In the gastric and small intestinal phases, the mean bioaccessibility of Cd was higher but that of Cr was lower. In the colon phase, the bioaccessibilities of Cr and Ni were 1.3-2.4 and 1.0-2.1 times higher than those in the small intestinal phase. Furthermore, the bioaccessibility of Cd also increased except for soil 3 and 4. Human gut micobiota could induce Cd, Cr, and Ni release from soils and increase their bioaccessibilities, which may result in high risk to human health.
Key words: soil      metal bioaccessibility      human gut microbiota      PBET method      SHIME model     

土壤重金属污染已成为全球最为严重的环境问题之一，受到国内外极大的关注，其中镉、 镍、 铬均被收录在2015年有害物质优先处理清单中[1]. 土壤中重金属进入人体的途径包括食物链、 无意口部摄入、 呼吸和皮肤接触等[2~4]； 而无意口部摄入，尤其是儿童，对体内有害金属摄入量的贡献率越来越高，甚至成为主要途径. 在人体健康风险评价中，主要有体内实验(in vivo，测定生物有效性，指被人体吸收后进入血液，并在体内重新分布的污染物或营养物的含量)和体外实验(in vitro，测定生物可给性，指在模拟胃肠条件下，介质中的污染物溶解到消化液中的部分)两种方法，而in vitro方法具有操作简单、 快速、 费用较低等优点，并受到国内外研究者的广泛关注[5~9]. 目前，in vitro方法主要有PBET(physiologically based extraction test)、 UBM(unified bioaccessibility research group of Europe method)、 SBRC(solubility bioaccessibility research consortium assay)、 IVG(in vitro gastrointestinal extraction method)和DIN(German standard bioaccessibility methodology)等. 影响土壤中金属生物可给性的主要因素有土壤pH、 有机质、 黏粒、 铁锰氧化物、 in vitro pH、 固液比、 停留时间等.

这些体外方法主要探究胃和小肠阶段土壤中金属的生物可给性，不太全面地评价其对人体的健康风险. 通常认为，小肠是人体主要的吸收器官，土壤中金属在小肠阶段溶出后基本会被吸收； 但是依附于土壤固相上的金属会到达人体的大肠，即结肠阶段，这里寄生着丰富的肠道微生物，有很强的代谢能力[10~13]. SHIME模型(simulator of human intestinal microbial ecosystem)是一种在体外条件下重现人体胃肠及微生物生态系统的模拟实验方法[10]. 在已有的报道中，SHIME模型主要探究了肠道微生物对土壤和食物中砷的代谢[11~13]，但是国内外有关肠道微生物对土壤中Cd、 Cr、 Ni的溶出影响的研究报道几乎没有. 同时，由于饮食习惯、 性别、 年龄和地域等不同[14~16]，人体肠道微生物的结构及活性是有差异的. 目前有少量报道关于中国人群肠道微生物对土壤污染物代谢的研究，本研究是第一次报道中国人群肠道微生物对土壤中Cd、 Cr、 Ni的代谢作用，并应用于人体健康风险评价. 本研究将采集我国一些地区的污染土壤，利用改进的PBET方法和SHIME模型分析胃肠及结肠阶段3种金属元素(Cd、 Cr、 Ni)的生物可给性，并初步探讨肠道微生物对土壤中金属生物可给性的影响. 本研究结果将对更全面地进行无意口部摄入的重金属污染土壤的人体健康风险评价起到一定的推动作用，并对土壤中金属在我国人群胃肠系统中消化吸收的研究也起到一定的推动作用.

1 材料与方法

研究所用的5个土壤采自我国广西区和湖南省，土壤样品风干后，过20目、 100目筛用于基本理化性质分析，具体的测试方法详见文献[17]； 过60目筛后用于in vitro实验. 所采集的土壤的基本理化性质和土壤中金属元素的含量有很大的变化范围(表 1). pH值范围为2.2～7.6. 土壤中铁、 锰、 铝氧化物(FeO、 MnO、 AlO)的含量分别为0.8～50.2、 0.1～0.5、 0.5～1.5 g ·kg-1. 土壤中Cd、 Cr、 Ni的含量范围分别为4.8～332.9、 18.5～66.8、 8.1～32.0 mg ·kg-1.

表 1 土壤的基本性质 (n=2) Table 1 Basic characteristics of the soils (n=2)

1.1 SHIME模型

SHIME模型包括胃、 小肠、 升结肠、 横结肠和降结肠这5个阶段. 之前关于SHIME模型的研究中选用了一名志愿者[11, 12]，因此本研究中选用了一名28岁的男性健康寄主(在过去一年里未食用抗生素之类的药物). 新鲜粪便采集后，接种微生物于3个结肠阶段. 每天输入3次食物液以保证结肠微生物消化的营养. SHIME模型自动调整pH，磁力搅拌器进行搅拌，通过恒温水浴箱模拟人体37℃的恒温效果，每天通入氮气15 min以保证厌氧环境. 经过3～4周的培养，微生物群落达到稳定期可用于后续实验. SHIME模型各项稳定参数见文献[13].

1.2 in vitro实验

本研究使用的in vitro实验方法主要结合PBET方法[4]和SHIME模型，由3个连续的阶段组成，即胃阶段、 小肠阶段和结肠阶段，具体操作步骤如下.

(1)胃阶段 配制模拟胃液(内含NaCl、 柠檬酸、 苹果酸、 乳酸、 冰乙酸、 胃蛋白酶等，并用浓盐酸将pH值调为1.5)，将过60目筛的土壤样品(0.3 g)及模拟胃液(30 mL)以1 ∶100的比例混合于50 mL离心管内，每种土壤2个平行. 置于37℃，150 r ·min-1的恒温振荡仪中. 在1 h时，吸取5 mL反应液，过0.45 μm滤膜，4℃保存待测.

(2)小肠阶段 胃阶段后，用NaHCO3粉末将胃反应液pH调至7.0，加入胰酶、 胆盐，继续置于37℃，150 r ·min-1的恒温振荡仪中. 在4 h时吸取5 mL反应液，过0.45 μm滤膜，4℃保存待测.

(3)结肠阶段 将小肠液转移至100 mL厌氧血清瓶内，从SHIME模型的降结肠阶段吸取等量的反应液加入，土液比为1 ∶200. 迅速通入氮气20～30 min以保证厌氧条件. 继续置于37℃，150 r ·min-1的恒温振荡仪中. 在48 h后，吸取5 mL反应液，过0.45 μm滤膜，-80℃保存待测. 各阶段生物可给性的计算方法详见文献[7].

1.3 数据分析方法

采用SPSS 18(IBM)和OriginPro 8对数据进行分析.

2 结果与分析 2.1 胃肠阶段土壤中重金属的溶解态含量及其生物可给性

土壤中金属元素的溶解态含量及其生物可给性变化很大(表 1). 胃阶段，土壤中Cd、 Cr、 Ni的溶解态含量分别为2.3～14.2、 3.4～5.0、 3.1～4.4 mg ·kg-1，而其生物可给性分别为4.3%～94.0%、 6.4%～21.6%、 11.3%～47.3%. 从胃阶段到小肠阶段，土壤中Cr和Ni的生物可给性与胃阶段基本一致或有一定的升高，其中升高的最大倍数分别是2.2倍和1.5倍. 而土壤中Cd在小肠阶段的生物可给性降低了1.4～1.6倍(除了土壤2有轻微升高). 土壤中Cd在胃肠阶段平均生物可给性均最高，分别达到40.6%和28.5%； 而Cr的生物可给性较低，仅12.1%和16.5%. 此外在胃肠阶段，土壤1和2中Ni的生物可给性较高，Cd的生物可给性较低； 但土壤3～5呈现出Cd较高的和Cr较低的生物可给性.

2.2 结肠阶段土壤中金属元素的生物可给性

结肠阶段(表 2和图 1)土壤中Cd、 Cr、 Ni的溶解态含量分别为1.4～91.1、 7.1～15.5、 4.5～8.1 mg ·kg-1. 土壤中Cr和Ni的生物可给性是小肠阶段的1.3～2.4倍和1.0～2.1倍，分别达到了17.6%～38.7%和25.4%～56.0%. 土壤Ni结肠阶段的平均生物可给性最高(36.6%). 从小肠阶段到结肠阶段，除了土壤3和4外，土壤中Cd的生物可给性也升高了1.9～3.9倍. 同时，土壤1、 2、 5中3种金属元素在结肠阶段的生物可给性均升高了. 结果显示，肠道微生物促进了土壤中Cr和Ni的溶出释放.

表 2 土壤中金属元素在结肠阶段的溶解态含量及生物可给性1) (n=2) Table 2 Dissolved concentrations and bioaccessibility of soil metals in the colon phase (n=2)

图 1 土壤中Cd、 Cr、 Ni在胃、 小肠和结肠阶段的生物可给性 Fig. 1 Bioaccessibility of soil Cd,Cr and Ni in the gastric,small intestinal and colon phases

2.3 各因素间关系分析

对土壤样品的基本理化性质、 土壤中3种金属元素在结肠阶段的溶解态含量及其生物可给性进行相关性分析，各因素相关系数见表 3. 可见，铁氧化物、 土壤总Fe与Cr、 Ni的生物可给性、 溶解态浓度呈正相关性； 土壤总Cr、 Ni与其生物可给性呈负相关性； 土壤pH与Ni的溶解态浓度呈正相关性. 此外，土壤中总Cd与其溶解态浓度呈正相关性.

表 3 各因素之间的相关性分析 1) (n=5) Table 3 Correlations matrix for the factors (n=5)

3 讨论 3.1 胃肠阶段金属元素生物可给性

不同土壤中Cd、 Cr、 Ni的生物可给性差异很大. 本研究中，土壤中Cd的生物可给性在胃阶段较高，而小肠阶段的生物可给性降低； 对于Cr和Ni，小肠阶段的生物可给性接近或高于胃阶段. 此外，土壤中Cd在胃肠阶段平均生物可给性均最高，但Cr的生物可给性较低. 这些结果与之前关于土壤中金属的生物可给性研究发现相似[7~9,17,18]. 土壤中金属元素在胃肠阶段生物可给性的差异主要与土壤理化性质(土壤pH、 黏粒、 有机质、 铁锰铝氧化物等)和in vitro参数(in vitro pH、 固液比、 停留时间等)等影响因素有关.

有研究显示，有较高有机质含量的酸性土壤可能会增加Ni的移动性[18]，这可能是土壤1中Ni生物可给性最高的原因. Ni的生物可给性与土壤总Ni、 铁锰铝氧化物呈负相关性[18]. Cr的移动性与其形态有很大关系，土壤中Cr(Ⅵ)的移动性和毒性均强于Cr(Ⅲ)[19]. 此外，土壤中有机质逐渐溶出，导致土壤中有机质含量降低，其对Cr、 Ni的吸附能力降低[20]. Cd的溶解性与pH有很大的关系，从胃阶段到小肠阶段，in vitro pH从1.5升高到7.0，在较高pH时，共沉淀的作用使Cd的溶解性降低[8]. 这可能导致小肠阶段Cd的生物可给性较低.

3.2 结肠阶段金属元素的生物可给性

本研究中，土壤Cd、 Cr和Ni在结肠阶段的生物可给性分别为1.3%～62.5%、 17.6%～38.7%、 25.4%～56.0%； 所有生物可给性均高于小肠阶段，除了土壤3和4中Cd的生物可给性略低外，结果表明肠道微生物可以促进3种金属元素从土壤固相上的释放. 这是第一次报道肠道微生物土壤Cd、 Cr、 Ni生物可给性的影响. 土壤中金属氧化物的吸附与解吸作用影响着Cd、 Cr、 和Ni的移动性. 结肠阶段是厌氧环境，肠道微生物的还原作用使Fe(Ⅲ)转化为Fe(Ⅱ)，可能增加Fe的释放，进而降低了铁氧化物对金属元素的吸附能力，这可能导致了Cd、 Cr和Ni的溶出增加[8, 21]. 在之前的研究中，Van de Wiele等[12]和Yin等[13]发现肠道微生物可以将As(Ⅴ)还原为As(Ⅲ)，笔者推断肠道微生物可能会将Cr(Ⅵ)还原为Cr(Ⅲ). 形态分析在准确评估土壤暴露下人体健康风险评价中的作用越来越重要，Cr形态变化值得进一步研究. 此外，土壤中金属元素的赋存形态与其溶出有很大的关系[22, 23]. 结肠阶段的pH为7.0左右，Fe、 Al氢氧化物可能会生成[24]； 结肠环境中含有大量的有机物质[13]，这些都可能会对Cd、 Cr和Ni有一定的吸附固定作用. 土壤中铁氧化物和黏粒表面的负电荷增加，对Cd2+的专性吸附增强[25]，以上作用可能导致了某些土壤中Cd的生物可给性降低. 土壤中金属的生物可给性可能是受多种因素共同作用的结果.

4 结论

(1)土壤中Cd、 Cr、 Ni在胃肠阶段的生物可给性有明显差异. Cd的平均生物可给性均最高，而Cr的生物可给性较低. 与胃阶段相比，Cd的生物可给性在小肠阶段降低了； 对于Cr和Ni，小肠阶段的生物可给性接近或高于胃阶段.

(2)结肠阶段，土壤中Cd、 Cr、 Ni的生物可给性高于小肠阶段，这表明肠道微生物可以促进Cd、 Cr、 Ni的释放，这可能增加了3种金属元素对人体的健康风险.

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