随着工农业的发展，重金属铜在土壤中的积累日益增加，对生态环境和人体健康产生了严重威胁. 研究表明土壤铜污染已经导致部分地区如北京、 天津、 西安、 沈阳、 济南、 长春、 郑州、 宁波、 武汉、 成都和上海等地的农产品铜含量超过国家食品卫生标准^[1]. 铜元素会对种子的萌发、 土壤中酶的活性、 微生物的数量和种类产生影响. 此外，铜元素对于抑制植物根系生长方面也比其他元素要强^[2]. 土壤中铜的迁移转化受诸多因素的影响，例如铜的形态和土壤的理化性质. 其中，土壤有机质作为重要的因素之一对铜的毒性和形态有显著影响^{[3, 4]}.

溶解性有机质(DOM) 是在自然状态下能由土壤固相进入到水相且分子直径小于0.45 μm的有机组分，是一系列相对分子质量大小不同而结构相似的混合物^{[5, 6]}. DOM是土壤的重要组成部分之一，虽然其含量占土壤有机质的比例不高，但却是土壤中最活跃的部分之一. 有研究表明，土壤环境中大部分的溶解性重金属都处于和DOM的络合状态，其对重金属的形态和生物有效性有着重要影响^[7]. 但DOM分子结构复杂，且具体的成分组成不易确定，同时，不同来源的DOM相对分子质量组成差异较大，这些因素都会影响其和重金属的结合以及生物有效性，因此研究DOM的化学组成结构及相对分子质量分布对理解DOM与重金属相互作用的机制，量化重金属的环境化学行为具有重要意义. 近年来学者针对DOM组成也作了一些研究. 王春艳等^[8]在研究DOM和重金属络合特征过程中认为按照HA和FA均占DOM的50%准确性最好. Dwane等^[9]则在研究中假设40%~80%的DOM来自HA和FA，然而在实际情况中，进行简单的比例假设不能充分表现出实际过程中DOM成分的复杂性. 基于这种考虑，Inaba等^[10]不仅考虑到低分子量有机酸(柠檬酸、 苹果酸和草酸)，也考虑到了螯合剂乙二胺四乙酸(EDTA)和二乙烯三胺五乙酸(DTPA)以及腐殖酸在土壤溶液中共存对生物有效性和毒性的复合影响. 随着化学分析技术的发展，近年来，一些学者将三维荧光光谱应用在可溶性有机质的结构分析上. 傅平青等^[11]利用三维荧光光谱法研究DOM与汞的相互作用，并研究DOM中不同荧光基团与汞的配位作用. 近年来一些研究尝试利用分割相对分子质量来研究有机质的性质，De Zarruk等^[12]利用叶堆肥、 鸡粪、 甘蔗酒糟模拟有机质分段透析研究得出不同分子段有机质含量及其铜络合能力，较好地量化了不同来源DOM相对分子质量和铜络合能力之间的关系，但这些方法和技术很少用于土壤中天然的DOM.

土壤有机质的来源很多，对于农田土壤，畜禽粪便是其重要的来源之一. 其中，鸡粪作为我国养鸡业规模不断扩大的副产物，对其进行微生物堆肥无害化处理，进而作为农家肥添加到农田中是我国对于鸡粪的一种常规处理方式. 同时，有研究表明鸡粪中的DOM与重金属具有较强的络合能力^[13]，因此，其常被作为人为来源土壤DOM的模式研究物质之一^{[12, 13]}. 基于此，本研究选取了暗棕壤、 褐土、 黑土以及泥炭土这4种土壤类型，同时选择了有机质含量较高的腐熟鸡粪，尝试分析不同有机质来源土壤中DOM的相对分子质量分布、 光谱特征及其与铜的络合能力，以期为理解土壤中重金属与有机质相互作用的机制，揭示土壤中重金属的环境化学行为提供理论依据.

暗棕壤和褐土采自北京雾灵山、 黑土采自黑龙江海伦，泥炭土和腐熟鸡粪肥购于江苏省宿迁市沭阳县瑞铭花卉园艺场.

土壤DOM的提取： 按照土水比1 ∶5与蒸馏水混合，连续振荡24 h后过滤，将滤液在7 000 r ·min^-1，4℃的条件下离心30 min，上清液通过0.45 μm滤膜，将最终获得的滤液低温保存^[9].

土壤DOM相对分子质量分割： 根据实验所得出的样品相对分子质量分布范围(22~765 026)，以及各样品所集中的相对分子质量段，采用连续透析法对样品进行相对分子质量分段透析^[12]，以便针对不同相对分子质量DOM进行特征分析. 透析采用标准级再生纤维素透析膜Spectra/Por4(M_r 12 000~14 000)和生物技术级纤维素酯透析膜(M_r 500~1 000). 透析前将膜管剪裁成合适长度以容纳20 mL提取物，浸泡在去离子水中过夜消除甘油和叠氮钠后用蒸馏水冲洗干净，然后将膜管底部用配重膜夹密封，顶部用非配重膜夹封闭，以确保膜管悬浮在透析液中. 透析过程在1 L烧杯中加入900 mL去离子水，避光低温(4℃)下透析24 h，透析膜管外即为相对分子质量小于500的提取物，膜管内物质继续进行下一步透析. 最终获得M_r<500~1 000、 500~1 000<M_r<12 000、 M_r>12 000这3个相对分子质量段的DOM. 该公司生产透析膜管经其检测截获量至少达到90%. 同时，为了检验采用这种提取方法膜管内不会吸附DOM，将使用过的膜管浸泡在去离子水中，测定其TOC含量. 结果显示DOM残留<5%.

应用水相凝胶色谱测定土壤DOM相对分子质量的分布特征. 测定采用日本Shimadzu公司凝胶渗透色谱Prominence系列系统，包括输液泵(LC-20AD)、 示差折光检测器(RID-10A)、 自动进样器(SIL-20A)、 柱温箱(CTO-20A)等单元. 色谱柱Shodex生产硅胶基质填料水溶性色谱柱kw802.5. 配制好的标准品室温放置24 h进行平衡，使用前缓慢水平摇动样品瓶，使样品浓度均匀，且瓶壁无气泡. 使用APSC公司出品的葡聚糖标准品作为标样进行校正，相对分子质量分别为1 000、 12 600、 21 000、 44 000、 60 600，分别按照药品标准进行浓度配制. 将样品流动相以1 mL ·min^-1进行输送，输入样品体积为50 μL. 依据标准相对分子质量物质的洗脱体积和相对分子质量对数之间的线性关系，在同一实验条件下根据实际样品的洗脱体积计算得出样品的相对分子质量. 样品的数均分子量(M_n)、 重均分子量(M_w)和分散系数ρ计算如下^{[14, 15]}：

式中，n为样品的分子数量，h_i表示样品洗脱体积为i时检测器的峰值，M_i为洗脱体积为i时样品的相对分子质量.

以往研究中多以X轴为洗脱时间，Y轴为检测响应信号制作图谱，比较各DOM样品的相对分子质量分布情况^[16~18]. 不同相对分子质量物质的分布比例通过软件LCsolution GPC计算.

通过高灵敏度荧光光谱分析仪(Hitachi F-4500)进行样品三维荧光光谱测定. 激发光源为150W氙弧灯； 激发波长(E_x)=5 nm，发射波长(E_m)=10 nm； 扫描速度1 200 nm ·min^-1； 激发发射波长范围为E_x=200~400 nm，E_m=300~550 nm. 作为土壤、 底泥和堆肥底料提取的DOM，其浓度较高可能发生荧光内滤效应，为了消除内滤效应的干扰，所有样品DOM均稀释至10 mg ·L^-1后进行分析检测. DOC浓度测定采用德国Analytikjena公司multiN/C2100总有机碳/总氮分析仪.

取20 mL DOM样品滴加0.01 mol ·L^-1 Cu(NO₃)₂溶液，使Cu²⁺浓度分布于0~110 μmol ·L^-1 之间，并用HNO₃和NaOH溶液调节体系保持pH=6.0±0.05^[19]. 加入的酸碱试剂总量不超过100 μL，忽略浓度稀释效应. 公式如下^[12]：

式中，F₀代表蒸馏水荧光光强； Y_max代表与铜的最大猝灭程度； K_L表示金属阳离子亲和力. 进一步计算金属络合常数通过公式：

式中，K_mb表示金属络合常数. pH测定采用美国Spectrum公司pH Meter IQ150. 铜的浓度测定采用原子吸收光谱仪(AAS，WFX2100).

为了证实对DOM样品进行分段分析的可行性，分析了各DOM样品的分散系数. 各样品DOM总体及各峰分散系数如表1. 各样品总体分散系数ρ>1，是多分散性的有机物，其中鸡粪ρ=1.44×10¹⁸远超过其他DOM样品. 根据各样品相对分子质量所集中的平均分子量划分峰，各峰分散系数介于1和2之间. 由此证明虽然DOM是在相对分子质量上具有连续性的混合物，但也可以根据其在相对分子质量分布上存在相对集中的现象进行峰的划分.

表 1 (Table 1)

表 1 各样品多分散系数 Table 1 Average polydispersity index of each sample 样品 暗棕壤 褐土 黑土 泥炭土 鸡粪 总体 68.04 89.39 93.27 164.56 1.44×1018 峰1 1.02 1.02 1.04 2.39 1.13 峰2 1.04 1.04 1.01 1.02 1.71 峰3 1.41 1.37 1.05 1.39 1.17 峰4 —1) — 1.34 1.91 1.16 峰5 — — — — 1.20 峰6 — — — — 1.23 1)“—”表示未检出

表 1 各样品多分散系数 Table 1 Average polydispersity index of each sample

以4种土壤及鸡粪样品DOM中所占比最高的峰值为100%，比较各样品相对分子质量积分面积，结果如图1. 鸡粪DOM相对分子质量积分面积为2 141 684，远高于其他样品，泥炭土次之为780 865. 暗棕壤、 褐土和黑土较低，仅为鸡粪积分面积的4.5%~5%. 由此可以看出鸡粪中DOM含量远高于其他样品. 由图1可知，鸡粪不同分子量表现出高(100 032)、 中(1 813)和低(432)这3个峰值. 其中鸡粪在中分子量段(500~1 000<M_r<12 000)积分面积约占总物质的34.1%，低分子量段(M_r<500~1 000)和高分子量段(M_r>12 000)分别约占41.7%和24.2%. 表现出鸡粪DOM在不同分子量段上有机物含量的分布差异. 泥炭土DOM主要的相对分子质量分布范围为391~126 755. 泥炭土高分子量段所占比较高，可能是降解时间相对较短，多为新近生物活动产生，可能存在着共轭双键结构和较高的苯环结构^[20].

图1中显示暗棕壤、 褐土以及黑土的相对分子质量主要集中在20、 190、 13 669这3个相对分子质量峰附近. 暗棕壤在低分子量段积分面积占总物质的比例较高，约为84.8%. 褐土和黑土的低分子量所占比约为暗棕壤的92%. 在中分子量段，黑土所占比例相对褐土和暗棕壤分别高6%、 10%. 而高分子量段，黑土出现了峰值为M_r=7 457和M_r=11 477的“双峰”现象. 暗棕壤DOM中小分子含量较高可能是因为其有机质来源主要是以针叶林为主，在土壤微生物降解作用下，产生较多的小分子物质^[21].

图 1

Fig. 1

图 1 各样品相对分子质量分布 Fig. 1 Relative molecular mass distribution of all DOM samples

为了进一步研究各样品DOM的组成和结构特征，分别对各样品DOM进行三维荧光光谱分析. 如图2，各样品均出现类蛋白荧光峰(E_x/E_m=240~270/300~350 nm)以及各自独特的荧光峰. 鸡粪DOM中出现了类色氨酸荧光峰a (E_x/E_m=280/350 nm)，这与Arndt等^[22]的研究结果较为吻合. 他认为畜禽粪便中15%～25%为蛋白质类，其中20%左右的氮与酪氨酸和色氨酸有关. 鸡粪同时出现了和黑土类似的紫外区类富里酸峰b(E_x/E_m=240/425 nm)，这种荧光峰被认为与腐殖质结构中的羰基和羧基有关，Coble等^[23]研究表明其源于木质素和蛋白质的降解产物. 此外，鸡粪出现了和泥炭土相同的荧光峰c(E_x/E_m=325/420 nm)，Baker^[24]在建立污泥污水荧光特征模型的过程中得出该荧光峰属于可见光区类富里酸荧光.

图 2

Fig. 2

图 2 各DOM样品三维荧光光谱图 Fig. 2 Fluorescence excitation-emission spectra of dark brown soil,cinnamon soil,black soil,peat soil and chicken manure

分别对各DOM样品透析提取结果进行三维荧光光谱分析，从而进一步了解各样品DOM物质结构和组成的特征在相对分子质量分布上的差异，结果如图3.各样品荧光峰随相对分子质量变化产生消失、 红移等现象. 鸡粪独特的类色氨酸荧光峰a(E_x/E_m=280/350)在中分子量段(500<M_r<12 000)强度减弱，未能形成独立的峰值，可见该类色氨酸荧光峰相对分子质量分布范围主要集中在低分子量和高分子量两部分. 在相对分子质量分布测定中，鸡粪的中分子量段积分面积仅占34.1%，相对而言，低分子量段和高分子量段约占65.9%为主体部分. 因此，鸡粪独特的类色氨酸荧光峰存在于占物质主体部分并起主导作用的低分子量段和高分子量段. 所以作为鸡粪DOM主体部分的类色氨酸荧光峰可能对鸡粪的化学性质起到主导作用.

在暗棕壤按照相对分子质量分段透析提取的DOM样品中，占总物质84.8%的低分子量段(M_r<500~1 000)有明显的紫外区类富里酸峰(E_x/E_m=240/425 nm)，但在中分子量段(500~1 000<M_r<12 000)以及高分子量段(M_r>12 000)样品中这种荧光峰消失，并且荧光强度降低. Senesi等^[25]关于土壤及土壤相关物质提取腐殖酸和富里酸进行荧光光谱分析的研究中认为，部分有机质荧光峰集中在短波长，物质分布在中低分子量，存在芳香缩聚程度较低以及腐殖化较低的可能性. 黑土和泥炭土在低分子量段出现独立荧光峰(E_x/E_m=220/395 nm)，中分子量段在保留该荧光峰的同时在其短波长方向出现荧光现象. 虽未形成独立的荧光峰，但形成了类似于两个峰值之间鞍部状态. 这种鞍部构造，可能是由于DOM中酚类物质相对增加，形成微小的红移现象而产生的. Helms等^[26]认为样品红移现象与DOM的理化性质有关. Chen等^[27]则更进一步认为是样品中酚类物质增加和碳水化合物的减少可能引起荧光峰的红移，以及荧光光强的减弱.

图 3

Fig. 3

图 3 暗棕壤、 褐土、 黑土、 泥炭土和鸡粪不同相对分子质量段DOM三维荧光光谱图 Fig. 3 Fluorescence excitation-emission spectra of different relative molecular mass fractions of soil,cinnamon soil,black soil,peat soil and chicken manure

DOM对土壤中重金属等污染物的生态环境效应产生一系列的重要影响. 为了研究各样品DOM与重金属铜的相互作用，采用荧光猝灭滴定法结合区域面积积分法对各DOM样品与铜的络合能力进行分析. 结果显示，暗棕壤、 褐土、 黑土、 泥炭土和鸡粪与铜的络合常数分别为2.10、 2.98、 3.10、 4.13以及6.66. 除泥炭土达到4.13外，黑土、 褐土和暗棕壤这3种土壤的络合稳定常数仅为3.10、 2.98和2.10.

鸡粪呈现较大的金属结合能力，与铜的络合常数达到6.66. 可能的原因是鸡粪有机物含量较高，这在相对分子质量积分面积中已被证实. 此外，上述表征鸡粪DOM化学结构中，鸡粪的三维荧光光谱中具有独特的类色氨酸荧光峰，以及紫外区类富里酸荧光峰和可见光区类富里酸荧光峰，这两种荧光峰所表征的物质中可能含有羧基和酚羟基类含氧基团对金属结合能力也会产生影响. 在以往研究中，铜与酚羟基络合常数达到7.95^[28]. 另外，也有研究表明，鸡粪中含有的巯基也会影响其多铜的吸附. 但三维荧光光谱技术还无法获取巯基的信息，因此，这还需要在之后的研究中引入其他分析技术获得更加全面而深入的结果.

(1)鸡粪DOM相对分子质量积分面积远高于其他样品，表现出其具有较高的有机物含量，泥炭土次之. 暗棕壤、 褐土和黑土较低，仅为鸡粪积分面积的4.5%~5%. 鸡粪在中分子量段积分面积约占总物质的34.1%，低分子量段和高分子量段分别约占41.7%和24.2%.

(2)各样品均出现类蛋白荧光峰(E_x/E_m=240~270/300~350 nm)，在此基础之上鸡粪在分别出现了和黑土类似的紫外区类富里酸峰，以及和泥炭土类似的可见光区类富里酸荧光峰之外，还出现了一类独特的类色氨酸荧光峰.

(3)各样品荧光峰随相对分子质量变化产生消失、 红移等现象. 暗棕壤在低分子量(M_r<500)时存在的荧光峰在中、 高分子量段(M_r>500)消失，黑土和泥炭土在中、 高分子量段(M_r>500)荧光峰产生红移现象. 鸡粪独特的类蛋白质荧光峰在中分子量段(500<M_r<12 000)消失.

(4)鸡粪呈现较大的金属结合能力，与铜的络合常数达到6.66. 除泥炭土达到4.13外，其他3种土壤的络合稳定常数相对较低.