环境科学  2016, Vol. 37 Issue (6): 2276-2283   PDF    
引用本文
黄雪娇, 杨冲, 倪九派, 李振轮 . 1株高效去除氨氮的红假单胞菌的分离鉴定及特性[J]. 环境科学,2016, 37(6): 2276-2283.
HUANG Xue-jiao, YANG Chong, NI Jiu-pai, LI Zhen-lun . Isolation, Identification and Characteristics of a Rhodopseudomonas with High Ammonia-nitrogen Removal Efficiency[J]. Environmental Science,2016, 37(6): 2276-2283.
1株高效去除氨氮的红假单胞菌的分离鉴定及特性
黄雪娇 , 杨冲 , 倪九派 , 李振轮     
西南大学资源与环境学院, 土壤多尺度界面过程与调控重点实验室, 重庆 400715
收稿日期: 2015-10-20; 修订日期: 2016-01-18.
基金项目:国家科技支撑计划项目(2013BAJ11B03)
作者简介: 黄雪娇(1991~),女,硕士研究生,主要研究方向为土壤微生物E-mail:1548217611@qq.com
通讯联系人, 李振轮,lizhlun4740@sina.com
摘要: 从云南某一沼泽地中分离筛选出1株可降解氨氮的光合细菌psb1,细胞形态及活细胞特征吸收光谱与红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)基本一致.光合细菌16S rDNA特异引物扩增序列比对结果表明,菌株psb1与Rhodopseudomonas sp.同源性达99%,且细菌叶绿素Y亚基的蛋白质序列比对结果表明,菌株psb1与Rhodopseudomonas palustris 相似性最大,为99%.但生理生化特征及其主要脂肪酸分析发现菌株psb1与Rhodopseudomonas palustris 有较大差异,菌株psb1不能利用葡萄糖和甘露醇等,且含特定脂肪酸C18:1ω6c.单一因素实验结果表明:菌株psb1最适生长温度和pH分别为40℃和7.0,最优生长氮源为酵母膏;初始pH为6.0~7.0, 30℃条件下厌氧光照培养,投加0.4%的psb1菌剂对模拟废水中氨氮的去除率达99%以上.说明光合细菌psb1为Rhodopseudomonas属的一个新菌,能高效去除氨氮,在景观水体水质调控中具有重要应用前景.
关键词: 红假单胞菌      分离      鉴定      特性      氨氮     
Isolation, Identification and Characteristics of a Rhodopseudomonas with High Ammonia-nitrogen Removal Efficiency
HUANG Xue-jiao , YANG Chong , NI Jiu-pai , LI Zhen-lun     
Key Laboratory of Soil Multiscale Interface Process and Control, College of Resources and Environment, Southwest University, Chongqing 400715, China
Abstract: A strain of photosynthetic bacterium named psb1 capable of ammonia-nitrogen degradation was isolated from a swamp in Yunnan. The psb1 was similar to Rhodopseudomonas sp. according to its cell morphological properties and absorption spectrum analysis of living cells. The alignment result of 16S rDNA amplification sequence with specific primers of photosynthetic bacteria showed that the homology between strain psb1 and Rhodopseudomonas sp. was 99%, and the alignment results of protein sequences of bacterial chlorophyll Y subunit showed that the strain psb1 and Rhodopseudomonas palustris were the most similar, with a similarity of 99%. But there was a great difference in the biological properties of the strains psb1 and Rhodopseudomonas palustris according to physiological biochemical characteristics and main fatty acid analysis. For example, strain psb1 could not utilize glucose and mannitol as carbon source, and had specific fatty acid C18:1ω6c. The results of single factor test showed that:the optimal growth was obtained at pH 7.0 and 40℃, the optimal nitrogen source was yeast extract. The optimal conditions for ammonia nitrogen biodegradation were as following:anaerobic, light, initial pH 6.0-7.0, temperature 30℃, inoculation volume 0.4%. Under that cultural condition, the degradation rate of ammonia nitrogen in wastewater could reach 99%. The results indicated that strain psb1 might be a novel bacterium in genus Rhodopseudomonas with high ammonia removal efficiency, and can be applied in the bioremediation of polluted landscape water.
Key words: Rhodopseudomonas sp.      separation      identification      characteristics      ammonia nitrogen     

近年来，随着社会发展和人们生活水平的提高，用于美化城市环境的景观水体已成为现代城市的核心组分. 然而 景观水体具有水域面积小、 自净能力低、 流动性差等特点[1, 2]，通常水体中氧气含量不高，在微生物作用下，水体中有机氮易转化成NH4+，而NH4+易引起景观水体富营养化而发臭，因此景观水体中NH4+含量是景观水体质量控制的重要污染指标[3]，控制水体中氨氮的含量对防治景观水体富营养化具有重要意义. 景观水体净化的方法有引水换水、 疏浚底泥、 循环过滤、 混凝沉淀、 投加杀藻剂、 曝气充氧等[4~9]，这些方法效果明显，但成本较高，且有些方法还会对水中的生物造成危害，因此难以大规模实施.

目前，一种行之有效的处理方法是 污染水体生物处理法，该处理方法能有效去除污水中有机污染物，降低污染物总量，使水体得到彻底净化，在污水及微污染水处理中已得到广泛应用[10~12]. 光合细菌(photosynthetic bacteria，PSB)是一类能进行光合作用而又不产氧的特殊菌群，可在高有机负荷的污水中正常生长，并在进行光合代谢的同时吸收并消解有机物质[13]，能降解水中氨氮，起到净化水质的作用，具有无毒、 低投入、 污染物去除率高且能回收利用资源的优点[14]. 目前报道的主要是用于处理生活污水[15]、 水产养殖污水[16~18]及工业废水[19~21]的光合细菌，而景观水体污染物含量和成分与生活污水、 水产养殖污水和工业废水不同，因此，筛选并研究适宜于防控景观水体污染的光合细菌具有重要的现实意义.本文从云南省某一沼泽地中筛选具有很强生物活性的光合细菌菌株，通过优化温度、氮源及pH值等条件，对已分离出的光合细菌进行快速培养，并进一步研究其对模拟氨氮废水中氨氮的去除效果，以期为光合细菌在景观水体水质净化中的应用提供技术资料.

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品来源

用于菌株分离的水样采自云南某一沼泽地.

1.1.2 培养基

富集培养基： 酵母膏 1.5g ·L-1，乙酸钠 3.3 g ·L-1，氯化铵 0.6 g ·L-1，磷酸氢二钾 0.9 g ·L-1，硫酸镁 0.5 g ·L-1，碳酸氢钠 0.2 g ·L-1，补蒸馏水到1000 mL，pH 7.0. 分离纯化培养基(双层固体培养基)： 在富集培养基中分别加入1.3%(上层)、 1.8%(下层) 的琼脂. 以上培养基121℃下灭菌25 min.

1.1.3 氨氮废水制备

氯化铵 0.02g ·L-1，磷酸氢二钾 0.09g ·L-1，硫酸镁 0.05g ·L-1，乙酸钠 0.34g ·L-1，补超纯水到 1000 mL，灭菌后备用.

1.2 菌株的分离、 纯化

取1 mL云南某一沼泽地中的水样接种于装满 PSB富集培养液的厌氧瓶中，光照厌氧培养约7 d，直至出现红色培养物. 取1 mL红色培养物接种于第2瓶富集培养基中继续培养，重复 3~4 次得到深红色培养液[22]，利用连续划线分离法[23]将富集得到的菌液进行分离、 纯化，得到供试菌株，命名为 psb1.

1.3 菌株的鉴定 1.3.1 形态观察及生理生化鉴定

用 PSB双层固体培养基培养 7 d后观察菌落形态，革兰氏染色显微观察菌体的个体形态，根据文献[24, 25]鉴定菌株生理生化特性. 并用扫描电镜观察菌株 psb1的细胞形态.

1.3.2 活细胞吸收光谱测定

取 1.5 mL菌株 psb1的 7 d培养液，用 0.9%的生理盐水 8000 r ·min-1离心洗涤 3次，将菌体置于 60% 蔗糖溶液中，摇匀，在紫外可见分光光度计上于 300~900 nm范围内扫描[26].

1.3.3 菌株分子生物学鉴定

提取菌株基因组 DNA，利用关大伟等[27]设计的光合细菌 16S rDNA特异引物 PPF2/PPR2 (正向引物fwd： 5′-CTGGAAGTCTTGAGTATGGC-3′； 反向引物rev： 5′-AGTAAACCCACTAACGGCTG-3′) 进行 PCR扩增. 反应体系为： PCR Mix 25 μL，超纯水16 μL，正向引物fwd (1μmol ·L-1)4 μL，反向引物rev (1 μmol ·L-1)4 μL，模板(90.34mg ·L-1)1 μL. 扩增程序为： 95℃预变性5 min； 95℃变性40 s； 60℃退火40 s； 72℃延伸30 s； 扩增30个循环； 最后72℃ 延伸10 min. Yutin等[28]研究发现不产氧光合细菌均会合成细菌叶绿素(BChls)，而叶绿素酸酯氧化还原酶(chlorophyllide oxidoreductase，POR)是 BChls生化合成途径中至关重要的中间产物，也是唯一一种广泛存在于不产氧光合细菌中，但不存在于产氧光合细菌中的酶. 通过比对分析发现 POR中由 BchY基因编码的 Y亚基中只含有两个保守区域，因此 BchY基因被作为不产氧光合细菌的普遍通用的基因标记. 因而本研究同时采用Yutin等[28]设计的一对适用于不产氧光合细菌的特异性简并引物： Primer 1(5′-CCNCARACNATGTGYCCNGCNTT-3′)和Primer 2(5′-GGRTCNRCNGGRAANATYT CNCC-3′)进行 PCR扩增. 反应体系与上述反应体系一致. 扩增程序为： 95℃预变性5 min； 94℃ 变性 30 s； 50℃ 退火 40 s； 72℃延伸1 min； 扩增30个循环； 最后 72℃延伸 7 min. 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，回收克隆，阳性克隆送公司测序. 测序结果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov的数据库中比对分析，并构建系统发育树.

1.4 菌株脂肪酸的测定

将40 mg psb1菌株纯培养物进行提取、 皂化、 甲基化、 萃取以及碱洗涤后获得上机样品，用 Agilent 6850气相色谱仪(FID 检测器)分析磷脂脂肪酸(PLFA)的成分. 色谱条件为： HP-5柱(25.0 m×200 μm×0.33 μm)，进样量1 μL，分流比10 ∶1，载气(H2)，尾吹气高纯N2，助燃气空气，流速0.8 mL ·min-1； 汽化室温度250℃、检测器温度300℃，柱前压10.0 psi (1psi=6.895 kPa)，质谱全扫描范围30~600 m/z； 二阶程序柱温170℃(5 min)→260℃→310℃，维持1.5 min.

1.5 菌株生长条件的优化

以PSB富集培养基为基础，分别设置pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和 10.0的实验组，观察不同pH 对菌株 psb1生长的影响； 分别设置培养温度为10、20、30、35、40、45、50和 60℃，测定其生长温度范围. 氮源测定是以终浓度为 0.262g ·L-1的不同种类氮源取代PSB富集培养基中的氮源. 接种量均为 0.4%，培养 48 h后，测定菌悬液D600值.

1.6 菌株对氨氮的去除效果

取对数期psb1菌剂，离心收集菌体细胞，用灭菌无氮水洗涤2次，制成菌悬液.接种至配制好的氨氮模拟废水(pH7.0)中，改变接菌比例(0、0.2%、0.4%、0.6%)、培养温度(10、20、30、35、40、45、50℃)、培养基的初始 pH值(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，研究不同因素对菌株去除氨氮的影响. 每个处理3个重复，隔3 d测定一次水体氨氮、 硝氮及 亚硝态氮，所有指标均按照地表水水质指标分析国家标准进行测定[29].

2 结果与讨论 2.1 菌株的鉴定 2.1.1 菌株的形态学特征

从富集样品中筛选纯化得到1株光合细菌，命名为psb1. 该菌在富集培养基中光照厌氧条件下的液体培养物呈红色； 不能在黑暗厌氧条件下生长. 光照厌氧条件下的菌落呈粉红色，圆形，边缘整齐，光滑湿润，直径为1 mm左右. 油镜下观察到其细胞在酸性培养基上呈球状，在碱性培养基上呈细杆状(图 1)，革兰氏染色为阴性. 电镜观察发现该菌的繁殖方式为裂殖生殖，大小为(0.7~0.8) μm×(1.2~1.5) μm(图 2).

图 1 光学显微镜下菌株psb1的细胞形态(10×100) Fig. 1 Morphology of the strain psb1 under optical microscope

图 2 扫描电镜下菌株psb1的细胞形态(20000×) Fig. 2 Morphology of the strain psb1 under electron microscope

2.1.2 吸收光谱

菌株psb1在380、 490、 530、 590、 830 nm处 有特征吸收峰，其中在 830 nm左右的特征吸收峰最明显. 而 380 nm和590 nm 处为细菌叶绿素 a的特征吸收峰，490 nm 处为类胡萝卜素的特征吸收峰[26, 30]. 表明菌株psb1含有细菌叶绿素a及类胡萝卜素，即 psb1具有光合细菌典型吸收特性.

2.1.3 分子生物学鉴定

利用光合细菌 16S rDNA的 特异性引物PPF2/PPR2和光合细菌 BchY基因简并引物进行 扩增分别得到长度为 203bp和507bp 的PCR产物. 将 507bp的 BchY基因转换成 168aa的蛋白质序列，并将 203bp和168aa序列在 NCBI网站进行序列同源性比较，发现两序列分别与 Rhodopseudomonas sp.和Rhodopseudomonas palustris的序列最相似，同源性分别为 99%和99%. 从 GenBank 基因数据库中下载与菌株 psb1 序列相似性 较大的各菌株的16S rDNA或BchY蛋白质序列，用psb1的序列和下载的序列通过 ClusrerW 进行聚类分析后，利用 MEGA311 软件以Neighbor-Joining 计算方式生成系统发育进化树，如图 3、 图 4所示. 从图 3中可看出菌株psb1与Rhodobacter sphaeroides的系统发生地位最近，从图 4中可看出菌株psb1与Rhodopseudomonas palustris 的系统发生地位最近，说明菌株 psb1属于红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)，并且有可能为Rhodopseudomonas palustris.

图 3 基于16S rDNA 基因序列同源性的psb1系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree of psb1 strain based on the 16S rDNA gene homology

图 4 基于BchY 蛋白质序列同源性的psb1系统发育树 Fig. 4 Phylogenetic tree of psb1 strain based on the BchY protein homology

2.1.4 菌株生理生化特征

生理生化特征见表 1，微生物对碳源的利用范围因种而异，是种的分类依据之一，见表 2. 在厌氧光照条件下，菌株psb1不能利用葡萄糖以及甘露醇，不能水解淀粉，可产生吲哚. 而Ramana等[31]和Girija等[32]研究发现与菌株psb1同源性最近的Rhodopseudomonas faecalis、 Rhodopseudomonas palustris 及Rhodobacter sphaeroides 可利用葡萄糖和甘露醇. 说明菌株psb1与亲缘关系最近的红假单胞菌属的几个模式种在对碳源利用上存在一定差异.

表 1 菌株psb1 的生理生化特性 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain psb1

表 2 菌株 psb1对碳源的利用特性 Table 2 Utilization of carbon source by strain psb1

2.1.5 磷脂脂肪酸分析

用 Agilent 6850气相色谱仪(FID 检测器)分析菌株psb1的磷脂脂肪酸(PLFA)成分，一共检测出十几种脂肪酸.其中脂肪酸C18:1 ω7c占的比例最高，达到33.55%. 通过将菌株psb1与系统发育树中邻近的3株红假单胞菌属模式菌株进行比较，发现菌株psb1与3株模式菌株体内所含的主要脂肪酸种类基本一致，但含量相差较大，且菌株psb1含特有脂肪酸C18：1 ω6c[31, 32]，说明菌株psb1与另外3种菌株不同(见表 3).

表 3 菌株psb1与邻近红假单胞菌属模式菌株细胞内的脂肪酸含量1)/% Table 3 Cellular fatty acid profiles of strain psb1 and closely related species of the genus Rhodopseudomonas/%

经过细胞形态结构及特征吸收光谱扫描发现该菌株的主要特征符合红假单胞菌属的特性，初步鉴定该菌株为红假单胞菌(Rhodopseudomonas sp.). 同源性分析发现利用特异性引物PPF2/PPR2扩增得到的psb1序列与Rhodopseudomonas sp.最相似，同源性为99%. 利用光合细菌BchY基因简并引物进行 PCR 扩增得到的序列与Rhodopseudomonas palustris 同源性最高，为99%. 生理生化特征及主要脂肪酸分析发现，菌株psb1与同源性相近的红假单胞菌属的其他模式菌株在生物学性质上有较大差异，菌株psb1具有较低的脂肪酸含量，且含特定脂肪酸C18：1 ω6c； 不能利用葡萄糖和甘露醇等，说明光合细菌psb1为Rhodopseudomonas属的一个新菌.

2.2 菌株生长条件的优化 2.2.1 pH对菌株生长的影响

菌株psb1在pH 值为6.0~8.0范围内生长较好，其中在pH 7.0时生长效果最佳. 当pH低于5.0以及pH高于9.0时，菌株的生长受到抑制. 结果表明菌株psb1生长适应性较广，在微酸性至微碱性条件下均能生长(图 5)，这与陈慧等[33]的研究结果一致.

图 5 pH对菌株psb1生长的影响 Fig. 5 Effect of pH on growth of the strain psb1

2.2.2 温度对菌株生长的影响

菌株psb1在10~60℃内均能生长，其中在20~50℃之间生长较为适宜. 在10℃以下，菌株几乎不生长，当培养温度从10℃上升到40℃时，菌株的生长速度明显加快，当培养温度超过40℃时，菌株的生长速度下降，由此得出： 菌株psb1的最适生长温度在40℃左右，且对外界温度的抵抗力较强(图 6). 而已报道的红假单胞菌属菌株的最适温度为25~38℃[33~36]，均不超过40℃，说明菌株psb1是1株耐高温光合细菌.

图 6 温度对菌株psb1生长的影响 Fig. 6 Effect of temperature on growth of the strain psb1

2.2.3 氮源对菌株生长的影响

不同种类的氮源对菌株生长的影响不一致，铵态氮中草酸铵最适合菌株psb1的生长，硝态氮中硝酸钾最适合菌株psb1的生长，有机氮中酵母膏最适合菌株psb1的生长. 综合比较发现酵母膏为菌株生长的最优氮源(见图 7).

图 7 不同氮源种类对菌株psb1生长的影响 Fig. 7 Effect of nitrogen source on growth of the strain psb1

2.3 菌株对氨氮的去除效果 2.3.1 接菌比例对菌株去除氨氮的影响

生物量大小严重影响微生物的除氮能力. 接种量不足或过多均会导致环境氮素含量去除不明显，适当的接种量有助于提高菌株除氮效率. 本实验对接种量研究结果如图 8所示，菌株 psb1可有效去除废水中的氨氮，不同处理组废水中氨氮的下降量不同. 接菌比例为 0.4%和 0.6%的废水中氨氮浓度在前 3 d内显著下降，其中接菌比例为 0.6%的处理组中氨氮下降量更为显著，与 D600的变化趋势一致，之后 2个处理组中氨氮浓度持续下降，分别于第 9 d和第 6 d降至最低值(0.01mg ·L-1)； 而接菌比例为 0.2%的废水中氨氮浓度呈持续下降趋势，于第 12 d降至 0.01mg ·L-1，说明添加菌株 psb1的量越多，氨氮的去除效果越明显. 考虑成本问题，实际应用中建议采用 0.4%的接菌比例. 整个实验阶段模拟废水中硝氮及亚硝氮含量变化较小，且各处理间差异不大，说明菌株 psb1通过吸收模拟废水中氨氮，并用于自身生长繁殖，从而达到去除废水中氨氮的效果. 0.4%比例的菌株 psb1在第9 d时对模拟废水中氨氮的去除率高达 99.8%，而刘洋等[37]分离Rhodovulum sp.菌株GHJ-2对污水中氨氮的去除率为67.5%，远远低于菌株psb1的去除率 99.8%，可见菌株 psb1能高效降解氨氮，这为该菌在实际应用中提高效率、 节约成本打下基础.

图 8 菌株比例对模拟废水中氨氮浓度的影响 Fig. 8 Effect of different amount of the strain psb1on ammonia concentration in the water

2.3.2 温度对菌株去除氨氮的影响

温度对菌株psb1去除氨氮效果的影响见图 9. 当温度低于30℃时，前3 d内，模拟废水中氨氮浓度随温度的升高而急剧下降，之后缓慢下降，于第6 d趋于稳定； 温度为30~45℃的废水中，前3 d氨氮浓度降低速度较慢，之后急剧下降，于第9 d趋于平稳； 50℃废水中氨氮浓度在整个实验过程中缓慢下降，这可能是高温破坏或抑制酶催化反应过程，从而抑制菌株psb1去除氨氮的能力. 温度为30℃时，菌株psb1对氨氮的去除效果最好，第3 d时就可将氨氮由初始的5.97mg ·L-1降到0.1mg ·L-1,之后水体氨氮浓度缓慢下降，最低降至0.03mg ·L-1,对氨氮的去除率高达99.5%. 而在菌株最适生长温度40℃条件下(图 6)，菌株psb1对氨氮的去除效果比30℃和35℃条件下差，且生长量也较30℃和35℃条件下低. 说明菌株生长的最优温度并不一定是菌株去除氨氮的最优温度，还需考虑水体营养元素成分. 废水中硝氮及亚硝氮含量在整个实验过程均无显著变化，且各处理组无显著差异，说明菌株psb1并没有将氨氮转化为硝氮和亚硝氮，而是通过自身吸收利用，从而去除废水中的氨氮.

图 9 培养温度对模拟废水中氨氮浓度的影响 Fig. 9 Influence of culture temperature on ammonia concentration in the water

2.3.3 初始pH对菌株去除氨氮的影响

环境中氢离子浓度与微生物的生命活动以及新陈代谢紧密相关. 不同pH值对微生物的影响效果不同. 改变模拟废水的初始pH，考察初始pH对菌株psb1去除氨氮效果的影响，结果如图 10. 在pH 4.0~10.0范围内，不同模拟废水中氨氮均呈不同程度下降. 说明菌株psb1对氨氮具有一定的去除效果. pH为4.0时，水体氨氮缓慢下降，12 d后由初始的5.97 mg ·L-1降至5.31 mg ·L-1，下降率仅为11.1%. 当pH由5.0~7.0时，水体氨氮下降速率及下降量逐渐增大，其中pH 7.0的下降速率最大. 12 d后pH 6.0和7.0的模拟废水中氨氮均降至0.02mg ·L-1，下降率为99.7%. 当pH大于7.0小于10.0时，水体氨氮下降速率有所减小，12 d后氨氮的去除率也有所降低，但去除率仍可达99.3%. 当pH为10.0时，水体氨氮下降速率进一步减小，12 d后氨氮的去除率降为82.1%. 可见菌株psb1在微酸到微碱条件下对氨氮的去除效果较好，最佳去除氨氮pH为6.0~7.0.

图 10 初始pH对模拟废水中氨氮浓度的影响 Fig. 10 Influence of initial pH value on ammonia concentration in the water

3 结论

(1)从云南某一沼泽地中分离筛选出1株可降解氨氮的光合细菌，命名为 psb1. 经过研究发现菌株 psb1为Rhodopseudomonas属的一个新菌.

(2)菌株psb1的最适生长温度为 40℃，是1株耐高温光合细菌； 最适pH为7.0； 最优生长氮源为酵母膏.

(3)不同环境因素条件下对菌株psb1去除氨氮效果研究实验表明，在初始pH为6.0~7.0，培养温度为30℃条件下，投加比例为 0.4%时，菌株 psb1对模拟废水中氨氮的最高去除率可达 99%以上，说明菌株 psb1能高效降解氨氮，这为该菌在实际应用中提高效率、 节约成本打下基础.

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