环境科学  2016, Vol. 37 Issue (6): 2271-2275   PDF    
引用本文
吴义诚, 贺光华, 郑越, 陈水亮, 王泽杰, 赵峰 . 基于高通量测序解析碳化温度对麻秆电极微生物群落影响[J]. 环境科学,2016, 37(6): 2271-2275.
WU Yi-cheng, HE Guang-hua, ZHENG Yue, CHEN Shui-liang, WANG Ze-jie, ZHAO Feng . Influence of Carbonization Temperature on Bacterial Community of the Biological Carbon Electrode Based on High-throughput Sequencing Technology[J]. Environmental Science,2016, 37(6): 2271-2275.
基于高通量测序解析碳化温度对麻秆电极微生物群落影响
吴义诚1,2 , 贺光华3 , 郑越2 , 陈水亮2,3 , 王泽杰4 , 赵峰2     
1.厦门理工学院环境科学与工程学院, 厦门 361024;
 2.中国科学院城市环境研究所, 厦门 361021;
 3.江西师范大学化工学院, 南昌 330022;
 4.中国科学院青岛生物能源与过程研究所, 青岛 266101
收稿日期: 2015-12-06; 修订日期: 2016-01-19.
基金项目:福建省中青年教师教育科研项目(JA15372);国家自然科学基金青年科学基金项目(51208490)
作者简介: 吴义诚(1984~),男,博士,主要研究方向为研究方向为水污染治理,E-mail:ycwu@xmut.edu.cn
通讯联系人, 赵峰,E-mail: fzhao@iue.ac.cn
摘要: 采用Solixa高通量测序技术比较了1000℃和1800℃碳化麻秆制备电极OCP-1000和OCP-1800在生物电化学系统运行过程中形成的生物膜微生物群落结构差异.测序分别获得OCP-1000和OCP-1800附着生物膜16S rRNA基因V3区优化序列4231和5263条,经过97%相似度归并后获得OTUs数量分别为1187和1338个. α多样性指数(Chao、Shannon指数)分析表明碳化温度越低,电极生物膜微生物多样性越丰富.电极OCP-1000和OCP-1800生物膜中优势菌群均为Proteobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes,这3个门的细菌在OCP-1000生物膜含量分别为66%、10%和9%,但在电极OCP-1800生物膜中含量分别为71%、7%和9%.不同碳化温度制备的麻秆电极在生物电化学系统运行过程形成的生物膜不仅存在共有细菌种类,也含有独特菌种,说明电极制备过程碳化温度影响电极生物膜微生物群落结构.
关键词: 麻秆      碳化温度      生物电化学系统      微生物群落结构      高通量测序     
Influence of Carbonization Temperature on Bacterial Community of the Biological Carbon Electrode Based on High-throughput Sequencing Technology
WU Yi-cheng1,2 , HE Guang-hua3 , ZHENG Yue2 , CHEN Shui-liang2,3 , WANG Ze-jie4 , ZHAO Feng2     
1.School of Environmental Science and Engineering, Xiamen University of Technology, Xiamen 361024, China;
 2.Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen 361021, China;
 3.Department of Chemistry and Chemical Engineering, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China;
 4.Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266101, China
Abstract: Microbial diversity of anodic biofilm in bioelectrochemical systems with hemp rod carbonized at 1000 and 1800℃ as anode was investigated using Solexa high-throughput sequencing technology. The results showed that a total of 4231 and 5263 optimized 16S rRNA gene sequences were gained from the electrode biofilm on the hemp rod carbonized at 1000 and 1800℃, respectively. At the level of 97% similarity, 1187 and 1338 OTUs were obtained for electrode biofilm carbonized at 1000 and 1800℃, respectively. The result of α diversity analysis showed that microbial diversity increased with decreasing carbonization temperature. Dominant phylum for both biofilms were Proteobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes, which accounted for 66%, 10% and 9%, respectively for 1000℃, while 71%, 7% and 9%, respectively for 1800℃. Beside the coexisting phylum, some unique species were also discovered, demonstrating that carbonization temperature did not only influence the electrode structure, but also affected the microbial community structure.
Key words: hemp rod      carbonization temperature      bioelectrochemical system      microbial community structure      high-throughput sequencing     

生物电化学系统(bioelectrochemical systems，BESs)是一类利用微生物在电极表面促进反应物进行氧化还原反应的装置，是微生物、 反应物、 电极互相作用的体系，能实现污染物的资源化，在能源与环境领域具有广阔的应用前景[1, 2]. 电极材料直接影响BESs的性能和造价，石墨棒、 石墨板、 碳毡、 碳纸、 碳布等传统的碳基材料具有稳定性强、 导电率高的特点，但是过高的成本限制了其在BESs领域的规模化应用和推广.

麻秆是一种常见的农作物，其高温碳化制备的多孔碳材料具有成本低、 导电性好、 可持续性和环境友好等特点[3]. 碳化温度影响基于植物制备的多孔碳材料的理化性能以及元素组成. Chen等[4]研究表明纤维素纸盒800℃碳化制备的电极元素组成包括C、 O、 Na、 Mg、 Al、 Si、 S、 Ca 等，但碳化温度升高到1800℃，其主要元素仅为C、 O、 Al、 Si、 Ca 等，且随着温度的升高，获得的碳化材料石墨化程度也越高. 张文标等[5]发现碳化温度影响竹炭的比表面积，碳化温度为600~800℃时，随着温度升高，竹炭比表面积逐渐增大，但碳化温度升高至1000℃，竹炭的比表面积却迅速减少. 江兰兰等[6]采用金属-有机骨架结构制备多孔碳材料时发现随着碳化温度升高，多孔碳材料的比表面积先增大后减小，而孔容则不断增大. 电极材料结构差异在一定程度上影响BESs中营养物质的传递，进而影响微生物在电极表面的生长. Chen等[7]研究表明BESs领域应用碳化植物制备的电极之所以能够获得较大电流密度，在一定程度上取决于电极表面微生物种类，而不仅仅与电极材料物理性状有关.

电极作为电化学活性微生物生长和电子转移场所，电极的材料结构能够直接影响产电微生物的富集进而影响BESs的性能[8]. 产电微生物是BESs的核心，也是其功能实现的关键，比较不同碳化温度制备的麻秆生物电极在BESs运行过程中电极生物膜微生物群落结构差异，有助于加深碳化温度对基于麻秆制备的电极电化学性能影响机制认识. 高通量测序技术无需采用微生物分离培养等传统、 繁琐的微生物群落分析技术，且具有较高的测序深度，可以较全面地反映样品微生物群落结构[9]. 因此，本研究采用Solexa高通量测序技术分析了1000℃和1800℃碳化麻秆制备的电极OCP-1000和OCP-1800在BESs运行过程形成的生物膜微生物群落结构差异，有助于全面深入地了解碳化温度对基于麻秆制备的电极电化学性能影响机制认识.

1 材料与方法 1.1 电极材料制备与表征

麻秆干燥后置于碳化炉，氮气保护下以10℃ ·min-1的升温速率至100℃，保温30 min； 以5℃ ·min-1的速率分别升到1000℃和1800℃，保温1 h； 自然降温至室温即制得电极材料OPC-1000和OPC-1800.

电极生物膜50 mmol ·L-1磷酸盐缓冲溶液(pH 7.08)洗涤后，加入2.5%(体积比)戊二醛4℃固定12 h； 依次用40%、 60%、 80%、 90%和100%的乙醇脱水，每个浓度脱水10 min，室温条件下自然晾干待观察.

1.2 BESs结构、 启动及运行

实验采用的三电极体系由100 mL 广口瓶制成，以石墨板为对电极，分别以碳化麻秆OPC-1000 和OPC-1800为工作电极，Ag/AgCl电极为参比电极，广口瓶用橡胶塞密封以保证体系厌氧，对电极和工作电极用钛丝引出，与参比电极一起固定于橡胶塞.

三电极体系接种污泥采自厦门集美污水厂，接种量为6.0 g，加入人工废水[10]，电池测试系统(Maccor，美国)设置三电极体系电位为0.2 V(vs. Ag/AgCl). 输出电流降低至0.1 mA·cm-2时，更换人工废水，依此步骤，直到获得稳定输出平台电流即为启动成功.

1.3 Solexa高通量测序 1.3.1 电极生物膜DNA提取

待电池启动后，取出工作电极，磷酸钠盐缓冲液(50 mmol ·L-1，pH 7.0)洗涤后采用环境样品总DNA提取试剂盒(百泰克，北京)提取生物膜基因组DNA.

1.3.2 PCR扩增

以提取的生物膜总DNA为模板进行PCR扩增，引物为27F和533R，其中引物533R作为测序端，其5′添加标签序列[11]. PCR扩增程序为： 95℃，预变性5 min； 95℃ 40 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，25个循环； 72℃，5 min； 4℃保存.

1.3.3 PCR产物定量及微乳液PCR

PCR产物纯化后采用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统(Promega)定量后，按比例混合进行微乳液PCR，获得的PCR产物上机测序.

1.3.4 序列分析

使用QⅡME 1.5.0软件去除包括质量低于25、 模糊碱基数大于0以及长度短于200 bp的序列； 将相似度在97%以上的序列划分到一个OTU，使用Shannon、 Chao1等指数表征各样品群落多样性； 主要OTU序列上传至GenBank数据库，登录号为KU373084-KU373116.

2 结果与讨论 2.1 麻秆碳化电极的表征

麻秆表皮去纤维高温碳化后呈黑色[如图 1(a)]，扫描电镜照片显示麻秆经高温碳化获得的碳材料具有多层次的大孔结构，其横截面存在不同孔径大小的孔隙，小孔直径约为25 μm，大孔直径约为60 μm，分布有序，孔隙相互之间连通，这种多孔的碳材料非常适合产电微生物的生长和附着.

图 1 碳化麻秆制备电极及其电镜图 Fig. 1 Scanning electron microscopy images of hemp rod through carbonation

2.2 高通量测序分析细菌群落多样性 2.2.1 测序质量评价

采用高通量测序技术对电极OCP-1000和OCP-1800生物膜细菌16S rRNA基因V3区序列分析，结果如表 1所示. 从中可知，电极OCP-1000生物膜共获得4623条原始序列，优化序列4231条，测序覆盖深度为0.80，97%相似度聚类分析产生OTUs 1187个； 电极OCP-1800生物膜菌群共获得原始 5712 条，优化后序列5263条，测序覆盖深度为0.83，经过97%相似度聚类分析产生OTUs 1338个. 高通量测序获得的微生物群落信息远高于传统DGGE和克隆文库等分析方法[12, 13].

表 1 Solexa 高通量测序及多样性统计 Table 1 Solexa high-through sequencing and diversity statistics

2.2.2 细菌多样性评价

电极OCP-1000和OCP-1800生物膜微生物群落多样性指数如表 1所示，从中可知，虽然本次测序Coverage指数没有达到理想的满库容，但测序结果能够大致描述电极生物膜菌落构成，从整体水平反映出电极OCP-1800和OCP-1000生物膜菌落结构差异. OCP-1800电极生物膜 Chao指数和Shannon 指数均大于OCP-1000电极生物膜，说明OCP-1800电极生物膜菌群的丰富度和多样性较高.

2.3 菌群分类学和群落结构分析

电极OCP-1000和OCP-1800生物膜菌群在门分类水平上统计结果如图 2所示. 结果表明两电极生物膜菌落组成表现出了较高的多样性，在OCP-1000电极生物膜中，相对含量超过1%的门有6个，而在电极OCP-1800生物膜相对含量超过1%的门有7个. 两电极生物膜菌落在门分类水平最明显差异在于Proteobacteria、 Firmicutes和Bacteroidetes 在各自群落中所占比例的不同，这3个门的细菌总和分别占总序列数的85%(OCP-1000)和87%(OCP-1800). 其中Proteobacteria在各两个样品中含量最为丰富，在OCP-1000和OCP-1800电极生物膜的含量分别为66%和71%. 目前绝大多数已知产电菌(如Geobacter和Shewanella等)和所有产电光合细菌都属于Proteobacteria，说明BESs运行过程中电极对电化学活性细菌具有一定的择选性富集. Bacteroidetes是样品中含量第二多的门，在电极OCP-1000生物膜中含量为10%，在OCP-1800电极生物膜中含量较低(7%). Firmicutes在OCP-1000和OCP-1800电极生物膜中含量都为9%.

图 2 电极OCP-1000和OCP-1800生物膜细菌在门分类水平组成 Fig. 2 Distribution of bacterial communities on electrodes OCP-1000 and OCP-1800 at the level of phylum

电极生物膜细菌在纲分类水平含量差异如图 3所示. 电极生物膜所含细菌主要分布于α-、 β-、 γ-、 δ-Proteobacteria以及 Bacteroidia等纲. β-Proteobacteria在OCP-1000电极生物膜中含量为10.5%，略高于OCP-1800电极生物膜的8.7%，目前该纲已知的电化学活性菌只有Comamonas denitrificans[14]和Rhodoferax ferrireducens[15]. 而δ-Proteobacteria在电极OCP-1000和OCP-1800生物膜中含量都非常高，分别为49.8%和42.8%，已知的产电菌如Desulfuromonas[16]、 Desulfovibrio[17]、 Geobacter[18]、 Geopsychrobacter[19]等都属于δ-Proteobacteria，在BESs运行过程中，麻秆碳化电极可能对产电微生物具有定向富集性能.

在属分类水平上菌群结构分析如表 2所示，两电极生物膜中含量大于0.5%的属共有15个(表 2)，这些属的细菌在OCP-1000和OCP-1800电极生物膜含量分别为38.79%和45.00%，两种碳化温度下制备电极其生物膜内菌群包含相似种类构成，但各个菌属的含量差异较大，如地杆菌Geobacter在OCP-1800电极生物膜中含量为35.88%远大于OCP-1000的19.91%. Geobacter属的很多细菌可以产电,是一类重要的产电菌，包括 Geobacter sulfurreducens[20]、 Geobacter metallireducens[16]等，其中G. sulfurreducens基因组测序已经完成，是目前了解最清楚的产电菌，在微生物燃料电池运行过程中，其库仑效率甚至能达到 99%，产电是获取能量的主要途径[21]. 麻秆在两种温度下碳化获得的电极生物膜中产电微生物Geobacter含量的差异，可能与碳化温度的升高改变了碳化电极结构和性能，进而影响了电极对细菌的选择性富集有关.

图 3 电极OCP-1000和OCP-1800生物膜细菌在纲分类水平含量 Fig. 3 Distribution of bacterial communities on electrodes OCP-1000 and OCP-1800 at the level of class

表 2 生物膜细菌在目、 科和属分类水平上菌群统计 Table 2 Distribution of bacterial communities in biofilms at the level of order,family and genus

3 结论

(1)Chao1和Shannon 指数表明OCP-1800电极生物膜内菌群的丰度和多样性均高于OCP-1000电极生物膜.

(2) 麻秆不同碳化温度下制备的电极在BESs运行过程中形成的生物膜在细菌构成和含量方面具有一定的差异性. δ-Proteobacteria在电极OCP-1000和OCP-1800生物膜中含量都非常高，但是δ-Proteobacteria中的地杆菌Geobacter在两电极生物膜含量差别较大.

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