2016, Vol. 37
水体富营养化所引起的蓝藻水华暴发已经造成很多的恶劣影响，水质的恶化已严重影响到淡水生态系统生态安全、 饮用水供给及经济可持续性发展[1, 2]. 蓝藻水华的暴发对水体的理化性质及水体中的微生物都存在影响. 首先，水华藻类合成或分解产生大量有机物，使水体中有机物含量骤增[3]. 其次，藻的光合作用及衰亡藻体降解会引发水体中溶解氧、 二氧化碳浓度、 pH以及氧化还原电位的改变[4-6]. 另外，水华暴发期间藻体在表层聚集，对水体中光线的遮挡影响下层水体中光合作用，也会对水生态系统的食物网产生影响[7, 8]. 而藻类产生的藻毒素等会对水体及沉积物中一些细菌产生抑制作用[9]，同时促进某些藻类(如微囊藻)成为优势种群[10]. 最后，藻体本身也为水体中的微生物提供避难所[11]. 在这些因素的共同影响下，水体中的微生物群落结构和数量在蓝藻水华暴发过程中发生明显变化[6, 12, 13]，进而影响到微生物所驱动的元素生物地球化学循环[14]. 有研究指出能够利用蓝藻暴发过程与水体中的氮循环微生物相互影响促进太湖水体中的氮去除[15]. 不过，目前关于蓝藻暴发过程对氮循环微生物具体影响的研究尚鲜见报道.
本研究通过在室内构建微宇宙模拟蓝藻水华的暴发，目的在于： ①蓝藻水华暴发过程中理化因子和不同形态氮浓度的变化； ②蓝藻水华暴发对氮转化微生物数量和功能的影响.
1 材料与方法 1.1 体系构建为了模拟太湖中的真实水体环境，从太湖梅梁湾湖区采集蓝藻水华和水样.所采样品在冰上保存并尽快运回实验室建立微宇宙. 参照蓝藻水华暴发时的微囊藻水华生物量(约108 cells ·L-1)，设置4组处理： ①高浓度组T1： 在第0 d添加微囊藻水华，使微囊藻水华生物量达108 cells ·L-1； ②高浓度水华重复暴发组T2： 在第0 d和第15 d添加微囊藻水华，使微囊藻水华生物量达108 cells ·L-1； ③低浓度组T3： 在第0 d添加微囊藻水华，使微囊藻水华生物量达106 cells ·L-1； ④对照组C： 正常水样，不添加微囊藻. 所有处理用10 L玻璃缸(直径30 cm，高40 cm)于恒温室中30℃条件下培养，光照/黑暗周期为12 h/12 h.
1.2 样品的采集在实验开始的第0、 1、 2、 4、 7、 10、 15、 16、 17、 19、 22、 25、 30 d采集水样，每次采样时间均为上午09：00左右，采样时原位测定pH和溶解氧(DO). 所采样品装入已灭菌的聚丙烯塑料容器中冷藏保存.
1.3 理化指标的测定溶解性有机碳(DOC)、 氨氮(NH4+-N)、 硝态氮(NO3--N)、 亚硝态氮(NO2--N)、 叶绿素a(Chl-a)的测定均采用文献[16]中的方法.
1.4 潜在硝化速率(PNR)的测定PNR的测定参照文献[17]方法. 将50 mL水样用孔径为0.22 μm的滤膜过滤，过滤后所得滤膜剪碎并加至含有20 mL PBS (8.0 g ·L-1 NaCl,0.2 g ·L-1 KCl,0.2 g ·L-1 Na2HPO4,0.2 g ·L-1 NaH2PO4； pH 7.4)的50 mL离心管中，向管中添加硫酸铵和氯酸钾使两者的终浓度分别达1 mmol ·L-1和10 mmol ·L-1. 将此悬浮液置于25℃摇床暗培养24 h. 然后悬浮液用5 mL KCl (2 mol ·L-1)浸提后用N-(1-基)乙二胺二盐酸盐法测定540 nm下的吸光度(UV 2450 spectrophotometer； Shimadzu,Japan). 最终的PNR结果用所测NO2--N含量计算并表示为μg ·(L ·d)-1.
1.5 DNA的提取和定量PCRDNA的提取参照文献[18]的方法进行. 定量PCR采用20 μL反应体系(10 μL SYBRPremix Ex TaqTM (Takara),100 nmol ·L-1 引物和1.5 μL模板 DNA). 细菌和古菌的amoA基因分别采用amoA1F/amoA2R-TC[19]和 Arch-amoAF/Arch-amoAR[20]，所用条件为： 94℃，2 min后进行40个循环扩增[94℃，20 s； 57℃ (AOB)，30 s 或者55℃ (AOA)，30 s； 72℃，30 s]. 反硝化基因nirK和nirS分别用引物为1F/5R[21]和cd3af/r3cd[22]. nirK扩增条件为： 94℃，2 min后进行40个循环扩增(94℃，15 s； 60℃，60 s)，nirS扩增条件为： 94℃，2 min后40个循环(94℃，30 s； 57℃，45 s； 72℃，45 s). PCR产物在65℃ 至 99℃进行熔解曲线中的荧光测定，数据用Rotor-Gene 6000(version 1.7)进行分析. 标准曲线的制备参照Chen等[23]的方法. 本实验AOB amoA扩增效率为87%~99% (R2 为0.992~0.999)； AOA amoA扩增效率为100%~109% (R2 为0.994~0.999)； nirK扩增效率为103%~109% (R2为0.992~0.993)； nirS扩增效率为105%~109% (R2为0.992~0.995).
1.6 统计分析定量PCR数据和水体理化指标用SPSS 13.0软件进行One-Way ANOVA(先采用Z score 将数据标准化，去除偏差较大值). 平均数的比较采用Fishers LSD检测.
2 结果与分析 2.1 理化指标的变化第0~2 d，添加高密度微囊藻颗粒的处理(T1和T2)Chl-a含量急剧下降(图 1)，在第2 d分别降至1724μg ·L-1和1649 μg ·L-1，说明藻华迅速降解，但仍远高于低藻组T3的357 μg ·L-1和对照组的67 μg ·L-1. 处理T2在第15 d添加藻后，第16 d Chl-a浓度又出现上升，而紧接着在第17 d急剧下降.
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图 1 各处理中叶绿素 a 的变化 Fig. 1 Changes of Chl-a in different groups |
添加高密度微囊藻颗粒的处理(T1和T2)的溶解氧(DO)在藻华降解过程中急剧下降(图 2)，在第2~7 d均维持在0.01 mg ·L-1的浓度； 到第10~15 d时，处理T1和T2的DO出现回升. T2的DO值在第15 d由于再次添加藻华而迅速下降. 与T1和T2相比，低浓度藻华组T3和对照组均在第2 d之后DO值呈波动上升.
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图 2 各处理中DO的变化 Fig. 2 Changes of DO in different groups |
在第0~4 d，添加高密度微囊藻颗粒的处理(T1和T2)中pH值在不断降低(图 3)，T3的pH值在不断升高. 自第7 d起，T1和T2的pH值与对照的差异逐步减小. 虽然T2的pH值于第15 d由于藻华的再次添加而明显降低，但随着藻华的降解，处理T1和T2的pH值不断上升，至第30 d时，T1的pH值(9.19)已高于对照(8.56)； 而T3的pH值在第10 d 时已高于对照.
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图 3 各处理中pH的变化 Fig. 3 Changes of pH in different groups |
如图 4所示，在第2 d时，添加高密度微囊藻颗粒的处理(T1和T2)的可溶性有机碳(DOC)含量分别达73.14 mg ·L-1和55.09 mg ·L-1，显著高于对照； 但随后T1和T2处理的DOC含量又出现下降. 与对照和低浓度T3相比，含高浓度藻华组的DOC含量波动更剧烈.
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图 4 各处理中可溶性有机碳(DOC)的变化 Fig. 4 Changes of DOC in different groups |
各浓度藻华处理的总氮(TN)总体呈下降趋势(图 5). 添加高密度微囊藻颗粒的处理(T1和T2)在第0~1 d的总氮含量降幅较大. 当在第15 d向处理T2中再次添加藻华后，其TN浓度再次升高，继而在第16~17 d时再次出现大幅降低，而在第17~19 d有小幅波动. T3处理中TN在实验过程中呈缓慢下降.
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图 5 各处理中总氮的变化 Fig. 5 Changes of TN in different groups |
添加高密度微囊藻颗粒的处理(T1和T2)的氨氮在第2~4 d出现大幅升高(图 6)，分别由3.19 mg ·L-1和2.78 mg ·L-1上升至12.53 mg ·L-1和14.17 mg ·L-1，而又在第7~10 d出现大幅降低，分别由17.94 mg ·L-1和16.56 mg ·L-1下降至5.40 mg ·L-1和4.04mg ·L-1. T2的氨氮含量在第15 d添加高浓度藻华后迅速降低，在第17 d又出现与第2 d相同的上升趋势，并于第25 d大幅降低，呈现出与第7 d相同的趋势. 与处理T1和T2相比，T3和对照的氨氮含量在整个培养过程中虽有波动，但变化不明显.
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图 6 各处理中铵态氮的变化 Fig. 6 Changes of ammonium in different groups |
添加高密度微囊藻颗粒的处理(T1和T2)的亚硝态氮含量在第1~2 d出现上升(图 7)，之后T1自16 d起持续上升； T2在第二次添加蓝藻水华之后的第15~17 d亚硝态氮含量出现上升，随后又在20~25 d呈现回落. T3的亚硝态氮含量自第4 d起上升，第15 d时达最大值，之后变化较小.
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图 7 各处理中亚硝态氮的变化 Fig. 7 Changes of nitrite in different groups |
与对照相比，添加藻华的处理中硝态氮的含量均较低(图 8). 添加高密度微囊藻颗粒的处理(T1和T2)的硝态氮浓度在第1~4 d逐渐降低. T1硝态氮含量在第17 d后波动上升，T2硝态氮含量在第15 d再次添加高浓度藻华后一直维持在0.1mg ·L-1以下. T3硝态氮含量除第1 d的大幅降低外，其余时间都在的0.15 mg ·L-1以下波动.
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图 8 各处理中硝态氮的变化 Fig. 8 Changes of nitrate in different groups |
由于0~15 d内只添加一次高密度微囊藻颗粒的处理(T1)与添加两次高密度微囊藻颗粒的处理(T2)的氮素变化趋势相同，在0~15 d仅测试了T2的PNR(图 9). T2的PNR在第4~15 d呈上升，在第15 d添加藻华后，出现短暂下降，在随后的第16~19 d逐渐上升，第19~20 d呈现小幅回落后又波动上升； 处理T1的PNR在第17~19 d出现大幅上升，继而在随后的第19~30 d内又逐渐下降，至第30 d时回落至实验初的水平. T3的PNR在第15 d起大幅上升，第19 d后回落，至第30 d时回落至对照水平.
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图 9 各处理中潜在硝化速率的变化 Fig. 9 Changes of the rate of potential nitrification in different groups |
由于T1和T2的理化指标在第0~15 d内变化一致，所以第0~15 d T1和T2的各基因丰度的定量均只取T2的样品来测定.
总体来看，添加藻华后，水体中细菌16S rRNA丰度在短期内都有显著升高，但随之出现下降，而后又呈现回升趋势(图 10)； 且添加藻华越多，丰度升高的时间持续得越久，但随之降幅也越大. 随着藻体的添加和衰亡，除T2外，其他处理和对照中细菌16S rRNA丰度均在下降后出现回升.
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图 10 各处理中细菌 16S rRNA 丰度随时间变化 Fig. 10 Changes of the abundance of bacterial 16S rRNA in different groups over time |
各处理中AOA和AOB的amoA基因相对丰度在添加藻华初期低于对照，但随着藻体的降解，在第15 d时，T1和T2中AOA和AOB的amoA丰度高于对照(图 11). 至第30 d时，T2中AOA和AOB的amoA相对丰度远高于其他处理，这也与第30 d时T2中仍有较高的PNR活性相一致(图 11). 同时，从AOA和AOB丰度的变化可以看到，在添加藻华 的体系中，氨氧化菌由AOA占优势逐渐演变为AOB占优势.
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图 11 各处理中 AOA amoA 和 AOB amoA 基因相对丰度随时间变化 Fig. 11 Changes of the relative abundance of AOA amoA and AOB amoA over time |
定量PCR的结果表明，添加藻华后nirK和nirS基因丰度在1 d内迅速上升，在经历短暂的下降后又呈现回升趋势(图 12). 且添加藻华密度越大，nirK和nirS基因丰度上升幅度越大. 与nirK相比，nirS基因丰度更高，在二次添加藻华的处理(T2)中，nirS的丰度甚至可高达细菌总数的29%.
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图 12 各处理中 nirK 和 nirS 基因相对丰度随时间变化 Fig. 12 Changes of the relative abundance of nirK and nirS over time |
在本研究中，重复高密度藻华处理T2的理化因子变化趋势在两次添加蓝藻水华后较一致，更表明水质受到蓝藻水华暴发的影响. 在含有高浓度藻的水体中，其总氮浓度约为含低浓度藻水体的8倍，说明由于高浓度藻体的输入，向水体中引入了大量的氮素. 而大量藻体输入后，藻细胞迅速死亡降解，表现为Chl-a 的含量在2天内剧烈下降至原来的约30% (图 1)，而低浓度藻组中，Chl-a 的含量仍有上升，说明在此浓度下，藻可以进行缓慢的生长. 随着藻体的降解，水体中的DO浓度也降至约0.01 mg ·L-1(图 2)，使水体处于缺氧的状态，有机质的缺氧降解产生的小分子有机酸造成水体中pH值的下降(图 3)，藻体中蛋白降解所脱下的氨基由于缺氧而不能被及时氧化，积累在水体中，造成氨氮浓度大幅升高(图 6)，对水质造成严重影响. 但低浓度藻的输入对水体的各项理化指标没有显著性的改变，说明水体对低浓度藻的输入具有缓冲自净作用. 在本研究中，高密度藻华处理T1的DO值在第10~15 出现上升，而在第2~15 d该处理中的Chl-a浓度维持在1500 μg ·L-1上下，表明在藻华暴发后衰亡过程中，藻体并未完全死亡，而是在一个较低的密度进行光合作用维持生长，消耗CO2并产生O2，这可能是导致水体中的pH值从第4 d起就开始缓慢上升的一个因素.
与对照相比，在微囊藻添加的处理组，总氮含量均降低，且添加微囊藻越多，总氮降低速率越快(图 5)，硝态氮的变化也呈现类似的趋势. Chen等[15]利用同位素标记技术进行室内模拟蓝藻水华堆积对太湖水体氮转化的影响，发现高密度(4×109cells ·L-1)微囊藻水华对水体中反硝化作用有促进作用，这与本研究的结果一致.
水体中氮的脱除通常是硝化-反硝化联合作用的结果. 藻华短期内的快速降解导致水体中氨氮浓度升高给驱动硝化过程中关键步骤——氨氧化过程的氨氧化微生物提供了底物，有利于其增殖. 同时，随着藻体的降解，DO逐步回升，相应地，添加高浓度藻华组中AOA和AOB的amoA基因丰度大幅提高(图 11)，表明水体中氨氧化微生物的丰度在逐渐恢复，与之相对应，水体中的氨氧化微生物活性在逐渐恢复，PNR逐步上升(图 9)，氨氮浓度大幅降低(图 6). Tuomainen 等[24]在丝状蓝藻Aphanizomenon sp.和Nodularia sp.的非聚集丝(non-aggregated filaments)中检测到细菌的amoA基因，但在聚集丝(aggregated filaments)中却未检测到. 与非聚集丝相比，聚集丝内的氧气含量极低[24]，表明DO是影响氨氧化微生物活性的原因之一. 在本研究中，AOB的丰度不断上升(图 11)，最终超越AOA而处于优势，在这一方面源于AOB群落对氧气具有更高的亲和力[25]，另一方面，如前面所讨论，水体中藻体的光合作用仍在产氧供利用，而并非完全的厌氧状态. 同时随着藻华降解，氨氮浓度的升高提供了充足的底物，有利于在高氨氮情况下AOB在较高的铵态氮下相较AOA更竞争优势的形成[26].
Zheng 等[18]对玄武湖中藻华消亡期细菌进行研究发现，游离和附生细菌都呈现快速增殖，其中大部分为Pseudomonas和Bacillus等可能具有反硝化功能的细菌. 衰亡藻体的降解为水体中提供了有机碳(图 4)，消耗了水体中的氧气(图 2)，为反硝化细菌的生长提供了良好的条件[27]. 通过定量PCR对反硝化功能基因nirS和nirK进行定量分析，发现在添加藻华后nirK和nirS基因丰度均上升(图 11)，且微囊藻密度越高，nirK和nirS基因丰度上升幅度越大，甚至可达起始值的100倍以上，表明藻华对反硝化微生物的增殖和活性具有促进作用，且高密度藻华强于低密度藻华. 主要原因在于水华藻类的堆积在短期内会形成高氮(图 5)、 低氧(图 2)和高DOC(图 4)的环境，适合反硝化菌的生长. 相关性分析也表明，nirK基因丰度与nirS基因丰度均与DOC呈正相关(nirK vs DOC： r=0.579,P=0.001,n=29； nirS vs DOC： r=0.656,P<0.001,n=29). 在T2处理中，重复添加藻华颗粒后(第17~19d)，nirK和nirS基因丰度均再次增加，且nirS增加幅度大于第一次(第1 d)，见图 11. 与第一次添加藻华相比，第二次添加后的T2处理经历了DO值在第1~19d内好氧-厌氧-复氧-厌氧的大幅波动(图 2)，这种含氧量波动的环境对反硝化更有利[28]； 同时，藻华的反复暴发所引起水体中DOC浓度的升高也可能促进反硝化细菌的增殖. 在藻华降解的过程中，水体中含氧量逐渐回升(图 2)，但nirK和nirS基因丰度在第2~15 d以及第17~19 d内并未下降，而出现上升(图 12)，这可能与反硝化微生物在好氧条件下依然能保持较强的代谢活动有关[29]. 本研究的结果表明，藻华暴发有利于氨氧化细菌和反硝化细菌丰度的提高，促进了藻华过程中氮从水体中大量去除.
4 结论蓝藻水华暴发对水体中的理化因子造成严重影响，TN、 氨氮、 TOC浓度的快速升高和DO的急剧降低，使水体处于缺氧状态. 但在蓝藻水华衰亡过程中，太湖水体中氨氧化菌的数量逐渐由AOA占优势演变为AOB占优势，氨氧化活性在缺氧情况下也能逐渐恢复，对水体中氨氮的去除有贡献. 水华的暴发造成的缺氧和高有机碳含量有利于太湖水体中反硝化菌的数量和功能活性的增加，在一定程度上有利于太湖水体中氮的去除.
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