环境科学  2016, Vol. 37 Issue (6): 2158-2163   PDF    
引用本文
王执伟, 刘冬梅, 张文娟, 崔福义 . 溴酸盐对普通小球藻的生长以及生理特性的影响[J]. 环境科学,2016, 37(6): 2158-2163.
WANG Zhi-wei, LIU Dong-mei, ZHANG Wen-juan, CUI Fu-yi . Effects of Bromate on the Growth and Physiological Characteristics of Chlorella vulgaris[J]. Environmental Science,2016, 37(6): 2158-2163.
溴酸盐对普通小球藻的生长以及生理特性的影响
王执伟1,2 , 刘冬梅1,2 , 张文娟1,2 , 崔福义1,2     
1.哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室, 哈尔滨 150090;
 2.城市水资源开发利用(北方)国家工程研究中心, 哈尔滨 150090
收稿日期: 2015-12-06; 修订日期: 2016-01-04.
基金项目:国家自然科学基金项目(50808052);国家水体污染控制与治理科技重大专项(2012ZX07403-001)
作者简介: 王执伟(1986~),男,博士研究生,主要研究方向为水污染控制,E-mail:wangzw13@163.com
通讯联系人, 刘冬梅,E-mail:mei18@hit.edu.cn
崔福义,E-mail:hit_cuifuyi@hotmail.com
摘要: 在静态暴露的条件下,利用流式细胞术等检测技术,考察了不同浓度的溴酸盐对普通小球藻的生长以及生理特性的影响,并对溴酸盐的毒性作用机制进行了初步的探索.结果表明,当溴酸盐浓度达到8 mmol·L-1,持续暴露96 h时,能够引起普通小球藻比生长率显著降低、细胞膜完整性显著降低、酯酶活性显著升高、线粒体膜电位显著升高、活性氧水平显著增加.扫描电镜可直观表明细胞膜受到损伤.由此说明,由于溴酸盐毒性的持续作用,使得活性氧在藻细胞内积累,普通小球藻自身的调节功能不能及时消除过多的活性氧,从而引起细胞膜完整性、酯酶活性和线粒体膜电位出现异常情况,藻细胞生理功能出现紊乱,藻细胞结构遭到破坏,最终导致普通小球藻生长受到抑制或死亡.
关键词: 溴酸盐      普通小球藻      流式细胞术      生理特性      致毒机制     
Effects of Bromate on the Growth and Physiological Characteristics of Chlorella vulgaris
WANG Zhi-wei1,2 , LIU Dong-mei1,2 , ZHANG Wen-juan1,2 , CUI Fu-yi1,2     
1.State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China;
 2.National Engineering Research Center of Urban Water Resources, Harbin 150090, China
Abstract: The effects of bromate on the growth and physiological characteristics of Chlorella vulgaris were investigated via the static exposure experiments and tested by flow cytometry. The results showed that when Chlorella vulgaris was continuously exposed to bromate for 96 h at 8 mmol·L-1, the specific growth rates and cell membrane integrity decreased significantly, while the esterase activity, mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species (ROS) increased significantly. The membrane-damaged cells could be found from the scanning electron microscopy analysis. It could be identified that ROS were overproduced in presence of bromate, which could not be eliminated by Chlorella vulgaris in time through self-regulation. The excess ROS could lead to abnormal situation of cell membrane integrity, esterase activity and mitochondrial membrane potential, disorder of physiology function and damage of cell structure. It could be concluded that Chlorella vulgaris died or their growth was inhibited by the existence of bromate.
Key words: bromate      Chlorella vulgaris      flow cytometry      physiological characteristics      toxicity mechanism     

溴酸盐是一种比较常见的氧化剂，在食品加工(我国已经禁用)、 黄金提取和羊毛生产等领域中都有广泛的应用[1]. 同时溴酸盐也是一种典型的饮用水臭氧消毒副产物. 由于溴酸盐能够诱发试验动物肾脏细胞肿瘤、 腹膜间皮肿瘤和甲状腺滤泡细胞肿瘤而被人们广泛关注[2~5]. 国际癌症研究机构将溴酸盐归为2B类致癌物. 我国生活饮用水卫生标准规定在使用臭氧时，水质溴酸盐含量的限值为0.01 mg ·L-1.

有研究表明，溴酸盐一旦进入水体则具有高度的稳定性，常规水处理工艺很难将其去除[6]，而其他针对溴酸盐去除或控制的工艺和技术正在开发和研究阶段[1]，这使得人类活动产生的溴酸盐对自然水体存在潜在的健康风险. Genuino等[7]研究发现菲律宾马尼拉自来水中溴酸盐含量为7~138 μg ·L-1，河流中平均溴酸盐浓度为15~80 μg ·L-1，地下水和废水样品中溴酸盐含量高达246 μg ·L-1和342 μg ·L-1. 在我国，Wu等[8]调研发现上海水样的溴酸盐浓度最高可达28.4 μg ·L-1. 由此可知，溴酸盐已经对某些国家和地区的自然水体造成了污染，但是有关溴酸盐对水生生物的影响还不确定，对溴酸盐的毒性作用机制还没有系统地报道.

藻类是水生生态系统食物链中的初级生产者[9]，进入水体中的污染物对其产生的毒性效应将影响水生食物链的能量传递，进而影响高营养级生物及整个水生生态系统[10]. 同时藻类具有个体小、 繁殖快、 对毒物敏感等特点而广泛地应用于水体安全评价[11]. 普通小球藻(Chlorella vulgaris)是一种典型绿藻，在淡水环境中广泛存在，并且在生态毒理学研究中是一种很好的模式生物[12]，在纳米材料[13]、 金属离子[14]、 农药[15]以及一些新兴污染物[16]的毒性研究中都有广泛的应用. 流式细胞术是一种在液流系统中观测细胞的技术，它可以在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析[17]，并且具有简单、 快速、 准确等特点，近年来也逐渐应用到藻类毒性检测的研究中[18].

本研究以普通小球藻为试验对象，通过流式细胞术等检测技术，考察在不同浓度的暴露过程中，溴酸盐对藻细胞的生长以及生理特性的影响，探讨溴酸盐对藻细胞的毒性作用机制，以期为溴酸盐潜在的生物健康风险提供理论依据.

1 材料与方法 1.1 主要试剂

溴酸钾(Potassium bromate，KBrO3)，购于国药集团化学试剂有限公司，分析纯. 用超纯水配制成250 mmol ·L-1的储备液，4℃保存. 碘化丙啶(Propidium iodide，PI)购于Sigma公司，用超纯水配制成1 mmol ·L-1的储备液，4℃保存. 荧光素二乙酸酯(Fluorescein diacetate，FDA)购于Sigma公司，用丙酮配制成1 mmol ·L-1的储备液，-20℃保存. 罗丹明123(Rhodamine 123，Rh123)购于Sigma公司，用超纯水配制成1 mmol ·L-1的储备液，4℃保存. 2′,7′-二氯荧光素二乙酸酯(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，H2DCFDA)购于Sigma公司，用乙醇配制成1 mmol ·L-1的储备液，-20℃保存.

1.2 藻种与培养

普通小球藻(Chlorella vulgaris)，购于中国科学院水生生物研究所淡水藻种库，编号FACHB1068. 培养条件为： 温度25℃±1℃，光照强度约3 000 lx，光暗比为12 ∶12，在无菌条件下用BG11培养基进行培养，每天定时人工振荡若干次.

1.3 溴酸盐暴露试验

在无菌条件下，选取生长状态良好并处于对数生长期的普通小球藻进行溴酸盐静态暴露试验. 试验设置溴酸盐浓度分别为0、 0.5、 1、 2、 4、 8 mmol ·L-1，初始藻密度为12.5×105 cells ·mL-1. 试验连续进行4 d，分别于0、 24、 48、 72、 96 h测定相应指标.

1.4 藻细胞比生长速率的测定

用紫外-可见分光光度计(T6系列，普析通用)测定藻液在680 nm下的光密度，通过藻细胞血球计数板显微计数与光密度之间的线性方程计算藻细胞密度，进而计算藻细胞的比生长速率. 计算公式如下：

(1)

式中，μ为时间0~t之间的比生长速率； N0、 Nt分别为0和t时刻的藻细胞数.

1.5 流式细胞仪检测

试验采用流式细胞仪(FACSCalibur型，BD公司)检测藻细胞各个荧光参数.

参照Liu等[19]的方法，用PI染色方法对普通小球藻细胞膜完整性进行检测. 染色时，取1 mL藻液，加入PI储备液使PI终浓度为60 μmol ·L-1，室温避光孵育20 min，经筛网过滤后上流式细胞仪，用FL2通道检测.

参照Shi等[20]的方法，用FDA染色方法对普通小球藻酯酶活性进行检测. 染色时，取1 mL藻液，加入FDA储备液使FDA终浓度为25 μmol ·L-1，室温避光孵育8 min，经筛网过滤后上流式细胞仪，用FL1通道检测.

参照Liu等[19]的方法用Rh123染色方法对普通小球藻线粒体膜电位进行检测. 染色时，取1 mL藻液，加入Rh123储备液使Rh123终浓度为26 μmol ·L-1，室温避光孵育30 min，染色后用PBS清洗3次细胞，经筛网过滤后上流式细胞仪，用FL1通道检测.

参照Yu等[21]的方法，用H2DCFDA染色方法对普通小球藻细胞内活性氧水平进行检测. 染色时，取1 mL藻液，加入H2DCFDA储备液使H2DCFDA终浓度为100 μmol ·L-1，室温避光孵育60 min，染色后用PBS清洗藻细胞，经筛网过滤后上流式细胞仪，用FL1通道检测.

以相对荧光强度表示各个指标测试水平.

(2)
1.6 藻细胞微观形貌观察

将藻液于5000 r ·min-1条件下离心5 min，倒掉上清液收集藻细胞，用PBS清洗3次，然后将藻细胞悬浮于2.5%的戊二醛中固定，离心后用PBS清洗3次，经系列乙醇脱水、 干燥、 喷金后，用扫描电子显微镜(Helios Nanolab600i，FEI公司)观察藻细胞表面的微观形态.

1.7 数据处理

试验数据中试验组和对照组之间的显著性差异采用SPSS 20.0统计分析软件中的单因素方差分析方法进行统计分析，以P<0.05表示差异具有统计学意义.

2 结果与讨论 2.1 溴酸盐对普通小球藻比生长速率的影响

经不同浓度的溴酸盐暴露后，对普通小球藻比生长速率的影响如图 1所示. 从中可以发现，当溴酸盐浓度小于2 mmol ·L-1时，普通小球藻的比生长速率与空白组相比没有明显区别，而当溴酸盐浓度为4 mmol ·L-1和8 mmol ·L-1时，则比生长速率有明显的下降，分别为空白组的87.8%和83.7%. 由此说明，当溴酸盐的浓度达到一定程度时，普通小球藻的生长会受到抑制作用，并且溴酸盐浓度越高抑制作用越明显. 除比生长速率外，其他能够反映藻细胞生理特性的检测指标也非常重要，有利于考察溴酸盐毒性作用机制.

图 1 溴酸盐对普通小球藻比生长速率的影响 Fig. 1 Effect of bromate on the specific growth rate of Chlorella vulgaris

2.2 溴酸盐对普通小球藻细胞膜完整性的影响

细胞膜往往是细胞抵御外界伤害的第一道屏障[19]，细胞膜的完整性对于藻细胞正常生理代谢有着十分重要的意义，因此细胞膜完整性是反映藻细胞生理特性的一项重要指标. PI是一种核酸染料，当细胞膜受损时，PI可以进入细胞内与核酸结合，同时发出红色荧光； 而当细胞膜结构完整时，则PI染料不能进入细胞内部从而不显荧光[22]. 因此，通过流式细胞仪检测PI荧光信号可以分析藻细胞膜的完整性，PI荧光强度越强说明细胞膜受损越严重.

溴酸盐对普通小球藻细胞膜完整性的影响如图 2所示. 从中可以看出，在溴酸盐暴露24 h时，浓度小于2 mmol ·L-1的溴酸盐对细胞膜完整性的影响不大，与空白组相比没有显著性差别. 而当浓度为4 mmol ·L-1和8 mmol ·L-1时，PI相对荧光强度与空白组相比有显著性增强，表明细胞膜完整性受到损伤. 但是随着暴露时间的延长，增加到48 h和72 h时，所有试验组PI相对荧光强度与空白组相比均无显著性差异. 由此可以说明，当普通小球藻暴露于溴酸盐24 h内，大于4 mmol ·L-1的溴酸盐能够引起细胞膜受到损伤，但随着暴露时间的延长，细胞逐渐适应溴酸盐毒性的影响，藻细胞自身的修复作用使得受损细胞膜得到修复. 当溴酸盐暴露96 h，浓度为2、 4和8 mmol ·L-1时，PI相对荧光强度再次显著增强，达到129.1%、 134.6%和172.5%. 说明此时藻细胞自身的修复能力已经无法抵挡溴酸盐的毒性作用，导致细胞膜完整性受到破坏. 藻细胞膜在毒性胁迫下受到损伤的现象在很多毒理学研究中都有报道[23~25].

图 2 溴酸盐对普通小球藻细胞膜完整性的影响 Fig. 2 Effect of bromate on the cell membrane integrity of Chlorella vulgaris

2.3 溴酸盐对普通小球藻酯酶活性的影响

酯酶活性可以反映细胞的新陈代谢活性[20]，在毒理学的研究中是比较敏感的指标. FDA能够透过细胞膜进入细胞内部，但本身不发荧光，经细胞内的酯酶水解产物可以发出荧光. 因此，通过检测相应的荧光信号可以分析藻细胞的酯酶活性[26].

图 3为溴酸盐对普通小球藻酯酶活性的影响. 从中可知，当溴酸盐暴露时间为24 h时，各个试验组对普通小球藻酯酶活性没有显著性影响. 随着暴露时间的延长，溴酸盐浓度越高，酯酶活性越大. 尤其是暴露96 h时，有非常明显的剂量-效应关系，当溴酸盐浓度为2、 4、 8 mmol ·L-1时，FDA相对荧光强度为144.1%、 167.3%、 184.5%. 酯酶活性的升高表明细胞的新陈代谢活性增加，一方面藻细胞保持较高的酯酶活性可能是一种修复策略，通过提供更多的能量来维持酶和化合物的合成以及基因的表达[27]，避免藻细胞死亡，另一方面可能是溴酸盐的毒性作用使得藻细胞代谢功能紊乱，不利于藻细胞生长繁殖. Liu等[19]的研究表明，全氟烷酸能够引起斜生栅藻细胞内FDA荧光强度的增强，并且认为此时的细胞膜通透性增强，细胞膜的选择透过性减弱.

图 3 溴酸盐对普通小球藻酯酶活性的影响 Fig. 3 Effect of bromate on the esterase activity of Chlorella vulgaris

2.4 溴酸盐对普通小球藻线粒体膜电位的影响

除细胞膜完整性和酯酶活性外，线粒体膜电位的变化也是表征细胞生理特性的重要指标. 线粒体是细胞生成ATP的主要地点，是一种具有高负电性膜电位的细胞器[28]，其功能的异常对细胞的能量代谢有重要的影响. Rh123是一种可透过细胞膜的阳离子荧光染料，能够与线粒体结合，其荧光强度可以反映线粒体膜电位大小[29]. 通过分析线粒体膜电位变化可以判断线粒体功能是否正常，进而分析细胞的生理状态.

图 4是溴酸盐对藻细胞线粒体膜电位的影响. 从中可以看出，在溴酸盐暴露24 h时，浓度为4 mmol ·L-1和8 mmol ·L-1的溴酸盐使线粒体膜电位显著升高，但随着暴露时间延长到48 h和72 h时，线粒体膜电位重新回到正常水平. 因此可以说明暴露24 h时，线粒体膜电位的升高是由于溴酸盐的毒性作用引起的应激反应. 此外，从图 4中还可以看出，在试验所考察的96 h内，浓度低于2 mmol ·L-1的溴酸盐始终都未能引起线粒体膜电位出现明显异常，说明在此浓度范围内，普通小球藻通过自身调节可以抵抗溴酸盐的毒性作用，使线粒体保持正常的生理功能. 但当暴露时间为96 h，浓度为8 mmol ·L-1的溴酸盐会再次引起线粒体膜电位显著升高，相对荧光强度达到172.4%. 说明此时已经超出藻细胞自身的调节能力，线粒体功能出现紊乱，能量代谢受到影响，进而影响藻细胞繁殖，使藻细胞生长受到抑制作用. 线粒体膜电位升高的现象在Cu2+对月牙藻[28]和全氟烷酸对斜生栅藻[19]的影响中也有报道.

图 4 溴酸盐对普通小球藻线粒体膜电位的影响 Fig. 4 Effect of bromate on the mitochondrial membrane potential of Chlorella vulgaris

2.5 溴酸盐对普通小球藻细胞内活性氧水平的影响

H2DCFDA是检测细胞中ROS水平的有效试剂，进入细胞后原来无荧光的H2DCFDA经一系列反应，会被ROS氧化生成能够产生绿色荧光的物质[30]. 在藻细胞的正常生理代谢过程中，叶绿体和线粒体等细胞器均可能产生ROS[31]. 正常生长的藻细胞内ROS的产生和清除处于动态平衡状态，不会对藻细胞产生严重损伤. 但当藻细胞处于逆境中时，活性氧水平会增多[32]，如果超过生物体内在的防御能力，就会造成藻细胞的损伤.

图 5是溴酸盐对普通小球藻细胞内ROS水平的影响. 从中可以看出，在所考察的暴露时间内，当溴酸盐的浓度小于2 mmol ·L-1时，藻细胞内ROS与空白组相比无显著性差别，说明此时细胞内在的防御体系(例如超氧化歧化酶，过氧化氢酶等抗氧化酶)可以抵抗溴酸盐的毒性作用. 而随着溴酸盐浓度的升高，暴露时间的延长，ROS水平增多，并且远高于空白组ROS水平. 暴露96 h时，浓度为4 mmol ·L-1和8 mmol ·L-1的溴酸盐使相对荧光强度达到175.4%和196.0%. 说明此时藻细胞自身的防御能力无法抵抗高浓度溴酸盐的毒性作用. 过多的ROS可以引起细胞膜发生膜脂过氧化，酶抑制，DNA和蛋白质损伤[33]，从而抑制藻细胞生长或造成藻细胞死亡.

图 5 溴酸盐对普通小球藻 ROS 水平的影响 Fig. 5 Effect of bromate on the levels of reactive oxygen species of Chlorella vulgaris

2.6 溴酸盐对普通小球藻微观形态的影响

图 6是溴酸盐暴露96 h后对普通小球藻微观形态的影响. 从中可以看出，空白组藻细胞表面光滑且个体饱满. 当溴酸盐浓度为2 mmol ·L-1时，细胞表面出现褶皱，但细胞大小变化不大，细胞膜和细胞壁仍保持完整状态. 当溴酸盐浓度为8 mmol ·L-1时，藻细胞细胞膜出现破损现象，并且藻细胞体积变大. 这表明在溴酸盐的毒性作用下，藻细胞的细胞结构已经出现损伤，藻细胞生理功能将受到影响，藻细胞生长受到抑制或死亡.

图 6 暴露96 h 后溴酸盐对普通小球藻微观形态的影响 Fig. 6 Effect of bromate on the microstructure of Chlorella vulgaris after 96 h exposure

通过对试验结果的分析和讨论可以发现，由于藻细胞自身的调节作用，短时间内能够抵抗溴酸盐的毒性作用，使藻细胞生理功能维持正常水平. 但随着溴酸盐的持续作用，自身调节能力不足以抵抗高浓度溴酸盐的毒性作用，使得ROS在细胞内积累，增多. 过多的ROS导致细胞膜完整性、 线粒体膜电位和酯酶活性出现异常情况，藻细胞生理功能发生紊乱，细胞结构遭到破坏，最终抑制藻细胞生长繁殖或导致细胞死亡. 因此，溴酸盐引起藻细胞产生过多活性氧导致藻细胞生理功能异常是其重要的毒性作用机制.

3 结论

(1)高浓度溴酸盐能够引起普通小球藻生长受到抑制，并且溴酸盐浓度越高抑制作用越明显.

(2)溴酸盐毒性作用能够引起普通小球藻细胞结构遭到破坏，新陈代谢功能紊乱，线粒体功能紊乱，活性氧水平增加.

(3)溴酸盐引起藻细胞产生过多活性氧导致藻细胞生理功能异常是其重要的毒性作用机制.

致谢： 感谢哈尔滨工业大学城市水资源与水环境国家重点实验室李哲煜老师在流式细胞仪的使用与数据处理方面所给予的帮助.

参考文献
[1] Butler R, Godley A, Lytton L, et al. Bromate environmental contamination:review of impact and possible treatment[J]. Critical Reviews in Environmental Science and Technology,2005,35 (3) : 193–217 .
[2] Ahlborn G J, Delker D A, Roop B C, et al. Early alterations in protein and gene expression in rat kidney following bromate exposure[J]. Food and Chemical Toxicology,2009,47 (6) : 1154–1160 .
[3] Arai T, Kelly V P, Minowa O, et al. The study using wild-type and Ogg1 knockout mice exposed to potassium bromate shows no tumor induction despite an extensive accumulation of 8-hydroxyguanine in kidney DNA[J]. Toxicology,2006,221 (2-3) : 179–186 .
[4] Crosby L M, Morgan K T, Gaskill B, et al. Origin and distribution of potassium bromate-induced testicular and peritoneal mesotheliomas in rats[J]. Toxicologic Pathology,2000,28 (2) : 253–266 .
[5] Kurokawa Y, Takayama S, Konishi Y, et al. Long-term in vivo carcinogenicity tests of potassium bromate, sodium-hypochlorite, and sodium-chlorite conducted in Japan[J]. Environmental Health Perspectives,1986,69 : 221–235 .
[6] 刘润生, 张燕. 饮用水中溴酸盐的去除技术[J]. 环境科学与技术,2010,33 (12) : 66–70.
[7] Genuino H C, Espino M P B. Occurrence and sources of bromate in chlorinated tap drinking water in Metropolitan Manila, Philippines[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology,2012,62 (3) : 369–379 .
[8] Wu Q, Zhang T, Sun H W, et al. Perchlorate in tap water, groundwater, surface waters, and bottled water from China and its association with other inorganic anions and with disinfection byproducts[J]. Archives of Environmental Contamination and Toxicology,2010,58 (3) : 543–550 .
[9] Xiong B, Zhang W, Chen L, et al. Effects of Pb(Ⅱ) exposure on Chlorella protothecoides and Chlorella vulgaris growth, malondialdehyde, and photosynthesis-related gene transcription[J]. Environmental Toxicology,2014,29 (11) : 1346–1354 .
[10] 徐冬梅, 王艳花, 饶桂维. 四环素类抗生素对淡水绿藻的毒性作用[J]. 环境科学,2013,34 (9) : 3386–3390.
[11] 雷静静, 冯佳, 谢树莲. 纳米氧化镍对3种绿藻的毒性效应[J]. 中国环境科学,2013,33 (10) : 1842–1849.
[12] Liu J Q, Sun Z Q, Lavoie M, et al. Ammonium reduces chromium toxicity in the freshwater alga Chlorella vulgaris[J]. Applied Microbiology and Biotechnology,2015,99 (7) : 3249–3258 .
[13] Zhou H, Wang X J, Zhou Y, et al. Evaluation of the toxicity of ZnO nanoparticles to Chlorella vulgaris by use of the chiral perturbation approach[J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry,2014,406 (15) : 3689–3695 .
[14] Ouyang H L, Kong X Z, Lavoie M, et al. Photosynthetic and cellular toxicity of cadmium in Chlorella vulgaris[J]. Environmental Toxicology and Chemistry,2013,32 (12) : 2762–2770 .
[15] Liu L, Zhu B, Wang G X. Azoxystrobin-induced excessive reactive oxygen species (ROS) production and inhibition of photosynthesis in the unicellular green algae Chlorella vulgaris[J]. Environmental Science and Pollution Research,2015,22 (10) : 7766–7775 .
[16] Pablos M V, García-Hortigüela P, Fernández C. Acute and chronic toxicity of emerging contaminants, alone or in combination, in Chlorella vulgaris and Daphnia magna[J]. Environmental Science and Pollution Research,2015,22 (7) : 5417–5424 .
[17] 李超, 韩金路, 王玉刚, 等. 流式细胞仪的工作原理及应用[J]. 中国实用医药,2009,4 (20) : 235–236.
[18] Suman T Y, Rajasree S R R, Kirubagaran R. Evaluation of zinc oxide nanoparticles toxicity on marine algae Chlorella vulgaris through flow cytometric, cytotoxicity and oxidative stress analysis[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety,2015,113 : 23–30 .
[19] Liu W, Chen S, Quan X, et al. Toxic effect of serial perfluorosulfonic and perfluorocarboxylic acids on the membrane system of a freshwater alga measured by flow cytometry[J]. Environmental Toxicology and Chemistry,2008,27 (7) : 1597–1604 .
[20] Shi X L, Kong F X, Yu Y, et al. Survival of Microcystis aeruginosa and Scenedesmus obliquus under dark anaerobic conditions[J]. Marine and Freshwater Research,2007,58 (7) : 634–639 .
[21] Yu Y, Kong F X, Wang M L, et al. Determination of short-term copper toxicity in a multispecies microalgal population using flow cytometry[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety,2007,66 (1) : 49–56 .
[22] 苏文, 孔繁翔, 于洋, 等. 水稻秸秆浸泡液对铜绿微囊藻生理特性的影响[J]. 环境科学,2013,34 (1) : 150–155.
[23] Wang Z Y, Li J, Zhao J, et al. Toxicity and internalization of CuO nanoparticles to prokaryotic alga Microcystis aeruginosa as affected by dissolved organic matter[J]. Environmental Science & Technology,2011,45 (14) : 6032–6040 .
[24] 冯政, 郑新梅, 刘红玲, 等. 全氟辛酸对斜生栅藻细胞膜特性影响研究[J]. 生态毒理学报,2010,5 (4) : 537–542.
[25] Xia B, Chen B J, Sun X M, et al. Interaction of TiO2 nanoparticles with the marine microalga Nitzschia closterium:growth inhibition, oxidative stress and internalization[J]. Science of the Total Environment,2015,508 : 525–533 .
[26] Vigneault B, Percot A, Lafleur M, et al. Permeability changes in model and phytoplankton membranes in the presence of aquatic humic substances[J]. Environmental Science & Technology,2000,34 (18) : 3907–3913 .
[27] Hong Y, Hu H Y, Li F M. Physiological and biochemical effects of allelochemical ethyl 2-methyl acetoacetate (EMA) on cyanobacterium Microcystis aeruginosa[J]. Ecotoxicology and Environmental Safety,2008,71 (2) : 527–534 .
[28] Machado M D, Lopes A R, Soares E V. Responses of the alga Pseudokirchneriella subcapitata to long-term exposure to metal stress[J]. Journal of Hazardous Materials,2015,296 : 82–92 .
[29] 岳磊, 张垚, 张楠曦. 流式细胞仪检测线粒体膜电位方法的研究[J]. 哈尔滨商业大学学报(自然科学版),2015,31 (4) : 393–397.
[30] Saison C, Perreault F, Daigle J C, et al. Effect of core-shell copper oxide nanoparticles on cell culture morphology and photosynthesis (photosystem Ⅱ energy distribution) in the green alga, Chlamydomonas reinhardtii[J]. Aquatic Toxicology,2010,96 (2) : 109–114 .
[31] Apel K, Hirt H. Reactive oxygen species:metabolism, oxidative stress, and signal transduction[J]. Annual Review of Plant Biology,2004,55 (1) : 373–399 .
[32] Liu W H, Au D W T, Anderson D M, et al. Effects of nutrients, salinity, pH and light:dark cycle on the production of reactive oxygen species in the alga Chattonella marina[J]. Journal of Experimental Marine Biology and Ecology,2007,346 (1-2) : 76–86 .
[33] Dat J, Vandenabeele S, Vranová E, et al. Dual action of the active oxygen species during plant stress responses[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2000,57 (5) : 779–795 .