磺胺类抗生素是最早得到应用的抗生素之一. 尽管目前有效的抗生素很多，但磺胺类药在控制各种细菌性感染的疾病中仍有其重要价值，依旧是目前人类和动物最常用的抗生素. 据统计，磺胺类药是全球销售总量最大的兽用抗生素之一，年销售量仅次于四环素^{[1, 2]}. 然而，动物体对抗生素的吸收有限，30%-80%的抗生素及其代谢产物最终会随粪便等排泄物排出体外，影响生态环境及人类健康^[3]. 在目前常用的几类兽用抗生素中，磺胺类抗生素具有较大的生态毒性和环境持久性^{[4, 5]}. 此外，抗生素污染最可怕还是其对抗性基因和抗性菌的选择. 事实上，越来越长的超级细菌清单表明，可怕的病原菌正在通过水平基因转移积累着越来越多的耐药基因^[6]. 磺胺抗性基因是目前环境中检出频率和检出丰度均较高的抗性基因之一^{[7, 8]}. 因此,探索降低畜禽粪便磺胺抗生素残留，减少其抗性基因储存量，控制其向土壤环境扩散的风险迫在眉睫.

堆肥是目前处理畜禽粪便最普遍的方式之一. 在堆肥化过程中，抗生素与微生物相互作用，能被微生物降解，同时也能影响微生物的活性^{[9, 10]}. 粪便中残留抗生素会诱导抗性基因和抗性菌传播^[11]，但近期研究者也发现抗性基因扩散能通过堆肥得到遏制^[12]. 目前已有较多国内外研究报道证实^{[10, 13]}，好氧堆肥方式可以有效降低多种抗生素残留量，但有关抗生素对堆肥的影响及堆肥过程中ARGs的消长行为还有待明确. 特别堆肥对磺胺ARGs的影响情况在不同研究中存在一定的差异. Selvam等^[12]研究证明堆肥可以降低磺胺ARGs丰度；而Zhu等^[14]则发现不同地区的堆肥对磺胺ARGs的影响效果有所不同. 因此，还需要开展更多的研究明确堆肥过程中ARGs的丰度变化，同时明确堆肥影响ARGs消长的机制. 本研究借助HPLC-MS/MS、 荧光定量PCR、 MicroRESP^TM等多项技术，分析对比外源磺胺抗生素添加和不添加堆肥过程中理化性质演变、 养分转化、 抗生素降解及抗性基因消长行为,以期为堆肥质量控制及抗生素阻断技术研究提供参考.

粪便原料由慈溪中慈生态肥料有限公司提供，以鸡粪为主，含有垫料，基本理化指标如下：含水率61.05%；pH 7.76； EC 3 000 μS ·cm^-1；碳氮比 17.89；有机质61.21%；总氮1.98%；总磷 1.45%；总钾 2.23%；铵态氮NH₄⁺-N 755.75 mg ·kg^-1；硝态氮NO₃^--N 181.79 mg ·kg^-1. 磺胺-6-甲氧嘧啶(SMM)和磺胺二甲嘧啶(SM2)由Sigma-Aldrich公司提供，纯度>98%.

SM2和SMM在国内养殖畜禽粪便中检出频率较高，其在鸡粪中的残留含量可在0.08-6.00 mg ·kg^-1之间^[15]. 本试验通过外源添加抗生素设置两个浓度处理：(CK)不添加抗生素；(SA)添加2.00 mg ·kg^-1 SMM和2.00 mg ·kg^-1 SM2. 原料堆肥前先经过反复翻堆混匀，保证原料的均一性. 堆体粪便用量在1.5 t左右，堆肥周期28 d，平均室温25℃，定期翻堆. 每隔一周采样1次直到堆肥结束，采集堆体不同部位样品进行混合，保证采样代表性. 每个处理3次重复.

新鲜样本用于测定含水率、 pH 值、 电导率(EC)；风干样品用于测定总碳、 总氮等其他养分指标. 采用烘箱干燥法测含水率；按1 ∶10固液比浸提后，分别用pH计测pH 值和电导仪测EC；采用元素分析仪测总碳、 总氮；铵态氮采用靛酚蓝比色法测定； 硝态氮采用酚二磺酸比色法测定^[16]；采用钒钼黄比色法测总磷；利用精密数字温度计测定堆温.

MicroRESP^TM技术是研究原位土壤、 堆肥微生物群落水平生理特征(CLPP)的一种较为灵敏、 快捷的测定方法^[17]. 将甲酚红(12.5 mg ·L^-1)、 氯化钾(150 mmol ·L^-1)和碳酸氢钠(2.5 mmol ·L^-1)混合制成指示剂. 同时配制3%的纯化琼脂，加入2倍胶体积的指示剂，然后将指示琼脂添加到检测板的微孔中，配制好的检测微孔板存放于含碱石灰的干燥器中待用. 将待测肥料均匀添加到深孔板中，随后加入水和15种碳源底物^[18]，将配制好的检测板倒扣在深孔板上，25℃培养6 h后，利用酶标仪读取570 nm波长下检测板的吸光值. 测定检测板在样品培养前和培养6 h后的吸光值，通过吸光值差异计算CO₂产生率. 具体步骤和计算方法见文献^[18].

样品采集后-20℃保存备用. 称取1.00 g样品(精确至0.01 g)至50 mL聚丙烯离心管中，加入内标溶液，放置10 min. 加入15 mL 含有体积比为3 ∶7的乙腈和EDTA-Mcllvain缓冲溶液(pH：4.0)的提取液，涡旋1 min，超声30 min，7 000 r ·min^-1，离心5 min，将上清液转移至圆底烧瓶中；残渣再用15 mL提取液提取一次；合并两次上清液于圆底烧瓶中. 将圆底烧瓶放于旋转蒸发仪上除去有机相，水浴温度为40℃，将剩余溶液转移至50 mL离心管中，用去离子水定容至40 mL，使溶液中的有机相(乙腈)比例降至≤10%，离心后取20 mL过SPE固相萃取小柱. 收集洗脱液于玻璃刻度管中，45℃氮气吹干，用体积比为1 ∶1的甲醇-水溶液定容至1 mL，过0.22 μm有机滤膜，液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)测定，内标法定量.

色谱条件：Phenomenex C₁₈柱(3 μm,2.0 mm×150 mm)，Thermo Finnigan Surveyor HPLC 系统(Thermo Scientific,USA)；流速：0.25 mL ·min^-1；柱温：30℃；进样量：5 μL. 流动相A：甲醇，B：甲酸-水(1 ∶1 000，体积比)，等度洗脱：0 min(40％A)→5.0 min(40％A). 磺胺二甲嘧啶和磺胺-6-甲氧嘧啶的回收率和定量限如表 1所示.

表 1(Table 1)

表 1 SMM和SM2的回收率和定量限 Table 1 Recoveries,relative standard deviation (RSD) and quantification limits for SMM and SM2 determining method 化合物 回收率(RSD,n=5)/%(添加浓度/μg ·kg-1) 定量限/μg ·kg-1 20 50 200 SMM 77.8(9.6) 75.7(9.6) 79.7(8.5) 10.0 SM2 82.4(13.1) 88.5(7.9) 84.1(12.3) 10.0

表 1 SMM和SM2的回收率和定量限 Table 1 Recoveries,relative standard deviation (RSD) and quantification limits for SMM and SM2 determining method

样品采集后-20℃保存，冷冻干燥后备用. 取冷冻干燥后的肥料样品0.25g，按照Omega EZNA^TM soil DNA试剂盒(Omega公司)说明提取DNA. 随后以有机肥基因组DNA为模板，采用表 2中所示的引物进行End-point PCR和荧光定量PCR(qPCR). 供试引物的PCR退火温度如表 2所示.

表 2(Table 2)

表 2 供试引物序列和PCR条件 Table 2 Primers and PCR parameters 引物 5′→3′方向 目标基因片段(End point PCR和qPCR退火温度) V3-FW(341F) CCTACGGGAGGCAGCAG 细菌16S rDNA V3区段 (55℃，62℃) V3-RV(518R) ATTACCGCGGCTGCTGG sul1-F CGCACCGGAAACATCGCTGCAC sul 1 (60℃，65℃)[19] sul1-R TGAAGTTCCGCCGCAAGGCTCG sul2-F TCCGGTGGAGGCCGGTATCTGG sul 2 (60℃，62℃)[19] sul2-R CGGGAATGCCATCTGCCTTGAG sul3-F TCCGTTCAGCGAATTGGTGCAG sul 3 (60℃)[12] sul3-R TTCGTTCACGCCTTACACCAGC sulA-F TCTTGAGCAAGCACTCCAGCAG sulA (60℃)[12] sulA-R TCCAGCCTTAGCAACCACATGG IntI1-F GGCTTCGTGATCICCTGCTT IntI 1 (60℃，60℃)[14] IntI1-R CATTCCTGGCCGTGGTTCT IntI2-F GTTATTTTATTGCTGGGATTAGGC IntI 2 (60℃)[14] IntI2-R TTTTACGCTGCTGTATAGGTGC tet(Q)F AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG tetQ(58℃，58℃)[8, 20] tet(Q)R CGGAGTGTCAATGATATTGCA tet (W)F GAGAGCCTGCATATGCCAGC tetW(58℃，58℃)[8, 20] tet (W)R GGGCGTATCCACACTGTTAAC gyrAF GA(T/C)GGN(C/T)TNAA(G/A)CCNGTNCA gyrA(45℃)[12] gyrAR GCCATNCCNACNGC(G/A/T)ATNCC PARC5-1 GCGAATAAGTTGAGGAATCAG parC(55℃)[12] PARC3-1 AGCTCGGAATATTTCGACAAC

表 2 供试引物序列和PCR条件 Table 2 Primers and PCR parameters

End-point PCR扩增采用北京全式金生物公司提供的2×EasyTaq PCR SuperMix，BioRAD T100 PCR仪，反应在20 μL体系中进行，其中模板0.5 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 10 μL，引物各1 μL(10 μmol ·L^-1)，超纯水补齐至20 μL. 扩增反应如下：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 30 s，退火30 s，72℃延伸1 kb ·min^-1，30个循环；72℃延伸5 min，16℃ 5 min. PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，割胶回收、 纯化. 将目的DNA片段与 PMD19-T载体(Takara)连接后，转化进入大肠杆菌DH5α感受态细胞中并提取重组质粒. 将PCR验证后的质粒进行测序(上海生工生物技术有限公司)，随后利用NCBI数据库中BLAST功能验证插入片段为目标基因. 本试验中构建的标准质粒为分别含有 sul1、 sul2、 IntI1、 tetQ、 tetW和16S rRNA(有机肥来源)的重组PMD19-T 载体.

荧光定量PCR扩增采用Takara公司提供的试剂盒MightyAmp^TM for Realtime PCR Kit，ABI StepOnePlus^TM 实时荧光定量PCR仪，反应在20 μL 的反应体系中进行. 其中模板DNA 2 μL，10 μL 2×MightyAmp for Real Time (SYBR plus) (2×)，引物各0.4 μL(10 μmol ·L^-1)，ROX reference Dye(50×) 0.4 μL，超纯水补齐至20 μL. 扩增反应采用三步法，具体条件为：预变性98℃ 2 min；变性98℃ 10 s，退火15 s，72℃ 30 s，40个循环；熔解曲线程序. 采用NanoDrop微量分光光度计对标准质粒DNA的浓度进行测定，建立质粒拷贝数与CT值对应关系的标准曲线. 所有抗性基因标准曲线线性相关性良好(R²>0.99)，qPCR扩增效果(E)在99%-110%之间，可以用于目标基因的定量分析.

利用参照基因16S rDNA对样品中的抗性基因进行校正：

抗性基因相对丰度=抗性基因绝对拷贝数/16S rDNA基因绝对拷贝数

应用统计软件SPSS 15.0进行显著性差异分析(One-way ANOVA，最小显著差法LSD)和主成分分析(PCA)；采用Sigmaplot 10.0软件作图；首先采用极差法对数据进行标准化，然后利用Canoco 4.5软件对生物信息矩阵进行冗余分析(RDA)，同时利用Monte Carlo permutation test检验RDA排序轴特征值的显著性，置换次数为999，将生成的数据文件应用Canodraw 4.5 生成物种-环境排序图.

对于堆肥系统而言，温度变化在一定程度上反映堆肥系统中的微生物活性，是堆肥化反应进程的直观表现. 本试验中，磺胺组堆肥0-14 d的总体堆温低于对照组[图 1(a)]. 图 1(b)对比了磺胺组和对照组堆肥的基础CO₂呼吸，发现除堆肥7 d以外，堆肥0-14 d对照组的基础CO₂呼吸基本高于磺胺组. 因此，可认为磺胺添加抑制了堆肥早期微生物代谢，降低微生物发酵，导致堆肥达到高温时间延长. 此外，堆肥过程中，微生物通过代谢呼吸提高堆温，而堆温升高反过来又会抑制微生物活动. 因此，堆肥初期(0-7 d)堆温的骤升引发的大量微生物死亡和代谢抑制可以导致堆肥7 d基础CO₂呼吸的剧烈下降[图 1(b)]. 堆肥早期对照组堆温高于磺胺组可能是堆肥7 d磺胺组基础CO₂呼吸高于对照组的直接原因. 堆肥21 d以后，对照组堆温下降，磺胺组堆温上升[图 1(a)]，同时对照组和磺胺组堆肥基础CO₂呼吸差异缩小[图 1(b)]，表明高浓度磺胺抗生素对堆体发酵的抑制会随着其进入堆肥时间的延长而减弱. 堆肥过程中磺胺抗生素的降解可能是抑制作用减弱的一个重要原因^{[4, 9]}.

图 1

Fig. 1

(a)堆温；(b)不同堆肥阶段的基础CO2呼吸； (c)不同时间下CK和SA组堆肥中MicroRESP数据的主成分分析 图 1 对照组(CK)和磺胺组(SA)堆温及生物群落水平生理特征 Fig. 1 Composting temperature and microbial characteristics of the treatments with (SA) or without (CK) addition of sulfonamide antibiotics

图 1(c)利用PCA分析不同堆肥进程下磺胺添加对微生物群落水平生理特征的影响，结果表明：堆体中微生物群落代谢特征随着堆肥的进行不断变化；在堆肥早期(0-7 d)和堆肥末期(28 d)，磺胺组和对照组堆肥微

生物群落代谢特征差异较小；而堆肥中期(14-21 d)，磺胺组和对照组堆肥微生物群落代谢特征差异明显增大. 由上可知，磺胺抗生素对堆肥微生物群落结构的影响主要反映在堆肥中期. 此外，从堆肥14-28 d，对照组堆肥微生物群落代谢特征的时间变化趋势明显大于磺胺组. 堆肥微生物群落代谢变化可以从一定程度上反映堆肥微生物活动差异以及微生物群落结构的变化. 堆肥后期磺胺抗生素对微生物群落代谢特征影响的减小进一步反映了抗生素诱导产生的堆肥微生物群落结构和功能改变是短暂的，会随着堆肥进程而逐步减弱甚至消失^[12].

不同处理堆体中基本养分、 pH和电导率在堆肥进程下的变化情况如图 2所示. 研究结果表明，对照组堆肥有机质(TOM)、 总磷(TP)、 铵态氮(NH₄⁺-N)和硝态氮(NO₃^--N)含量随时间的变化幅度明显大于磺胺组堆肥，可知磺胺添加在一定程度上抑制了堆肥养分转化. 磺胺组有机质含量明显

高于对照组，可认为高浓度磺胺药抑制了堆体微生物对碳源的利用^[9]，导致磺胺组有机质下降幅度减小，这与磺胺组堆肥基础呼吸速率下降的结果相一致. 此外，堆肥过程中，水溶性的NH₄⁺-N 一部分会转化为NH₃挥发，一部分通过硝化作用形成NO₃^--N，一定程度上降低堆肥中NH₄⁺-N，增加NO₃^--N^[9]. 在本试验中，尽管磺胺组和对照组的总氮含量时间曲线没有明显差异，但对照组堆肥中NO₃^--N含量显著高于磺胺组，这表明磺胺组中高浓度的磺胺抗生素对堆体中的微生物硝化作用产生了明显抑制. 由于NH₄⁺-N的硝化会导致堆肥pH降低，因此磺胺组微生物硝化作用的减弱可能是对照组pH低于磺胺组的重要原因，抗生素对pH的这种影响在王桂珍等^[9]的研究中也有发现. 此外，由于磺胺组堆肥pH高于对照组，因而磺胺组堆肥中的NH₃更容易挥发^[9]，这也是为何对照组堆肥硝态氮高于磺胺组，但二者的总氮下降幅度却无明显差异的原因. 另外，对照组与磺胺组在堆肥过程中的电导率-时间曲线也不同，磺胺组的电导率总体高于对照组.

图 2

Fig. 2

图 2 对照组和磺胺组堆肥中pH、 EC和基本养分情况 Fig. 2 The pH,EC and nutrients of manure compost in treatments with or without addition of sulfonamide antibiotics

供试粪便原料无SMM检出，但有少量SM2残留. 图 3(a)描述了堆肥过程中对照组鸡粪内源残留SM2的降解行为，发现0.21 mg ·kg^-1 SM2在7 d内即可100%降解. 通过外源添加SMM和SM2，磺胺组堆肥原料中的SMM和SM2残留量分别提高至2.68 mg ·kg^-1和 1.77 mg ·kg^-1. 由于翻堆和抗生素拌入过程中的人为误差，堆体中实际抗生素浓度与理论计算值不完全相同. 图 3(b)描述磺胺组堆肥中SMM和SM2降解的时间曲线，结果指出尽管磺胺组堆肥中SM2残留量显著增加，但鸡粪的好氧堆肥仍能有效去除SM2，堆肥7 d后SM2残留量降低至0.84 mg ·kg^-1，降解率达52.3%. 与内源SM2在对照组堆肥中的降解类似，剩余的0.84 mg ·kg^-1 SM2 在7 d内(堆肥第14 d时)即可完全降解. 与SM2相比，鸡粪中SMM的降解速度更快，堆肥7 d降解率达79.0%，14 d内降解率100%，残留浓度低于检出限10 μg ·kg^-1. 尽管需要进一步验证，仍可推测鸡粪中SMM的快速降解能力可能是本试验鸡粪原料中无法检出SMM的一个重要原因. 综上，好氧堆肥可以有效去除堆肥中的SM2和SMM，这与其他学者的研究结果相一致^[10]. 事实上，磺胺类药物例如SMM在土壤中比较难降解，其去除速率往往低于四环素类药物等其它常见兽药^{[3, 4]}. 根据本试验研究结果可推测，与土壤环境相比，磺胺类抗生素在堆肥环境中可能更容易降解. 因此，可以通过堆肥强化养殖源有机肥中磺胺类抗生素的降解，减少其在农田土壤中的累积.

图 3

Fig. 3

图 3 堆肥原料中SMM和SM2在好氧堆肥中的降解曲线 Fig. 3 Degradation of SMM and SM2 in chicken manure during aerobic composting

本试验首先通过end-point PCR检测粪便原料和有机肥样品中 sul1、 sul2、 sul3、 sulA、 IntI1和IntI2 的存在情况，电泳结果表明所有样品中均无法检出 sul3、 sulA和IntI2，但有与sul1、 sul2及IntI1 相同大小的DNA产物检出(图 4)，经过割胶回收、 片段纯化及测序鉴定可以确定以上DNA产物为目标抗性基因片段. 根据以上结果，初步判断供试粪便中的磺胺抗性基因以 sul1、 sul2 为主，整合子以IntI 1 为主. 随后，采用qPCR对堆肥过程中的 sul1、 sul2和IntI1 进行定量分析.

随堆肥进行，鸡粪中sul 1 和sul 2 相对丰度基本呈现先下降后上升的变化趋势(图 5)，研究结果与Selvam等^[12]的报道类似. 在堆肥早期，磺胺抗性基因相对丰度的降低表明堆肥启动后磺胺抗性基因携带菌在细菌群落中的比例下降，暗示了堆肥早期非抗性细菌的生长能力可能高于抗性细菌. 对堆体中16S rDNA和磺胺抗性基因的绝对拷贝数进行分析，发现16S rDNA的绝对拷贝数在堆肥启动后(7 d)显著上升，而磺胺抗性基因的绝对拷贝数下降. 因此可认为，堆肥的启动可诱导堆体中非抗性细菌大量生长，但抑制抗性宿主菌的繁殖或相关抗性基因的水平转移. 堆肥进入中期(14-21 d)后，堆体中的sul 1 和sul 2 相对丰度降至最低值，最高消减率分别达52.1%和65.4%. 由于在本试验中，无论是内源还是外源添加的磺胺抗生素在堆肥14 d内均可完全降解，因此推测鸡粪中磺胺抗生素降解导致的抗性选择压力的下降和消失是sul 1 和sul 2 相对丰度降低的诱因之一. 然而，堆肥后期(21-28 d)，鸡粪中 sul 1 和sul 2 相对丰度又有所回升，特别是sul 1 . 而在此期间，总细菌数量随时间下降，大量正常细菌的死亡可能直接导致堆体细菌群落中磺胺抗性宿主菌比例增加. 此外，堆肥后期温度的下降也可能诱导部分在高温期被抑制的抗性基因宿主菌复苏^[12].

相关分析结果进一步指出 IntI1与sul1 相对丰度高度显著相关(Pearson Correlation=0.816,P<0.01). 堆体中 sul1和IntI1 可能存在于同一个抗性质粒中或者抗性菌内，在这种情况下 sul1在IntI1 的介导下可以在不同个体的细菌之间水平转移扩散^{[21, 22]}. sul2与IntI1，sul2与sul1 相关性不显著(Pearson Correlation=0.509,P=0.162； Pearson Correlation=0.579,P=0.103). sul 1 相对丰度在堆肥21 d就上升到一个小高峰[图 5(b)]，而sul 2 的这个小高峰在堆肥28 d时才出现[图 5(c)]，推测部分sul 2 宿主菌与sul 1 宿主菌可能属于不同细菌种属. 因此，堆肥内源细菌可能拥有多种不同的磺胺抗性基因，并且不同磺胺抗性菌可以拥有不同的抗性机制.

随后对比磺胺组和对照组(图 5)发现：外源磺胺抗生素的添加抑制了0-7 d堆肥细菌数量的增加，但7 d后磺胺组中细菌数量可以高于对照组，28 d内趋于一致，该结果与堆温和基础呼吸数据结果一致，表明磺胺抗生素倾向抑制堆肥早期微生物，抑制作用随堆肥进行而减弱；堆肥前中期，磺胺组sul 1 和IntI 1 相对丰度与对照组相比无明显提高，对照组堆肥21 d的sul 1 和IntI 1 相对丰度甚至还高于磺胺组；到堆肥28 d，磺胺组的sul 1 和IntI 1 才明显高于对照组，而此时堆体中已无法检出磺胺抗生素. 上述结果说明，sul 1 和IntI 1 及其宿主菌在堆肥中的变化可能与抗生素浓度没有明显相关性，即其在堆体中的传播或增长不依赖于抗生素. 类似的现象在前期多项研究报道中被提及，例如Ji等^[19]对粪便和粪便施肥土壤中抗性基因丰度与多种重金属和抗生素的相关性进行分析发现，抗性基因丰度与抗生素浓度的相关性较弱，而与重金属Cu、 Zn、 Hg等显著相关；Heuer 等^[23]通过室内培养试验建立sul 1 和sul 2 丰度与磺胺嘧啶浓度之间的定量模型，发现sul 1 传播不依赖于磺胺嘧啶浓度，但明显影响sul 2 丰度. 本试验中，磺胺组sul 2 相对丰度总体高于对照组，尤其是堆肥7 d磺胺添加显著提高sul 2 . 因此，与前期研究报道相一致^[23]，本试验也证实sul 2 宿主菌生长或sul 2 转移频率与磺胺类抗生素选择压力的相关性更强.

图 4

Fig. 4

图 4 部分堆肥样品的抗性基因PCR扩增结果 Fig. 4 PCR detection results of ARGs in part of manure compost samples

图 5

Fig. 5

图 5 堆肥过程中16S rDNA绝对拷贝数和抗性基因IntI 1 、 sul 1 和sul 2 的相对丰度 Fig. 5 Absolute copy numbers of 16S rDNA and relative abundances of IntI1,sul1 and sul2 during composting

初步的End-point PCR表明堆体样品中无法检出gyrA和parC，但有tetQ和tetW检出(图 4). tetQ和tetW抗性基因属于RPP(核糖体保护蛋白)组的四环素抗性基因，Yu等^[24]研究发现它们在猪粪中的绝对拷贝数是通道运输相关tet抗性基因(tetC、 tetG)的10-1 000倍. 本试验鸡粪原料中的tetQ和tetW相对丰度分别为1.31%和0.31%，大大高于Selvam等^[12]研究中的猪粪(来源：香港；tetQ、 tetW：0.04%、 0.02%)，明显低于 sul1、 sul2 等磺胺抗性基因，与大多畜禽粪便抗性基因相关报道一致^[12]. 此外，本试验结果(图 6)与Selvam等^[12]的报道类似，tetQ和tetW随时间先增加后下降，堆肥7 d堆体中tetW相对丰度是鸡粪原料中的4.7倍左右. 显然tetQ和tetW宿主菌在堆肥启动后的一段时间内非常活跃. 事实上，供试鸡粪原料中没有检出四环素类抗生素，这些四环素抗性基因可能在鸡肠道中就已经进化出来. 对比磺胺组和对照组可知，磺胺组中四环素抗性基因的相对丰度高于对照组，尤其是tetQ，表明磺胺抗生素不仅促进磺胺抗性基因扩散，还可以增加四环素抗性基因的传播. 因此，抗生素存在共选择或者交叉选择以产生抗性的机制^[25]，也暗示着很多耐药细菌同时含有不同抗生素抗性基因^[26]. 例如，Arcangioli 等^[26]研究发现沙门氏菌中的sul 1、 IntI1 、 tetA和tetR出现在同一个抗性质粒中.

ARGs会受到环境中很多因素的影响，例如光照、 温度、 重金属存在、 环境湿度等^[27]. 因此，除了磺胺抗生素浓度，堆肥进程中的堆体理化参数变化也会驱动堆体中抗性基因相对丰度发生改变.

RDA冗余分析是基于排序技术的线性分析方法，不仅可以结合多个环境因子一起分析，而且能够独立保持每一个环境因子对物种变化的贡献率^[28]. 为了明确堆肥理化指标与ARGs相对丰度的关系，对水分、 pH、 EC、 有机质等各项养分与ARGs进行RDA分析. RDA分析结果表明，第一和第二排序轴分别对应98.2%和89.6%的抗性基因相对丰度与堆肥过程因子之间的关系，4个排序轴共解释了88.8%的抗性基因相对丰度变化和99.1%的抗性基因-堆肥过程因子的关系，所选的堆肥过程因子解释了88.8%的总特征值. MonteCaHo 检验测得的显著值表明所选堆肥过程因子是堆肥中抗性基因相对丰度相关的主要特征参数(F=8.781,P<0.01). 图 7显示了各指标之间的关系，红色箭头连线的长度代表某个过程因子对物种影响的大小，连线越长，代表这个过程因子对物种的影响越大，因此堆肥过程因子对抗性基因的影响大小为：温度、 铵态氮、 硝态氮>pH、 含水率、 碳氮比>总碳、 总磷>EC. 红色箭头和蓝色箭头之间的夹角小于90°，表示物种与环境因子正相关，相反则表示负相关，夹角越小，相关性越强. 由图 7可知，温度与 sul1、 sul2和IntI1 负相关. 温度可能通过影响磺胺抗性质粒在堆肥中的存活能力和接合转移能力^[29]，进而使得堆肥进程中抗性基因相对丰度发生改变. 温度箭头与tetQ和tetW箭头的夹角约为90°，表明温度对tetQ和tetW的影响较小. 此外，碳氮比和硝态氮与 sul1、 sul2、 IntI1、 tetQ和tetW 均呈负相关；而pH、 含水率和铵态氮浓度与抗性基因相对丰度成正相关；堆体pH和含水率对tetQ和tetW的影响比 sul1和sul2 要强烈. Knapp等^[30]也发现pH与大部分抗性基因的相对丰度例如blaCTX、 ermB显著相关，高pH环境利于抗性基因的扩散，但不同抗性基因之间存在差异. 含水率、 铵态氮、 硝态氮等养分很有可能通过影响堆体微生物群落结构^[31]，进而影响抗性基因相关丰度. 由上可以明确堆肥过程中抗性基因消长的影响因素，通过调控主控因素可以帮助人们优化堆肥条件,从而降低有机肥成品中的抗性基因残留丰度.

图 6

Fig. 6

图 6 堆肥过程中四环素抗性基因相对丰度 Fig. 6 Relative abundances of tetQ and tetW during composting

图 7

Fig. 7

Tm: 堆温；W：含水量；C/N：碳氮比；TC：总碳；TP：总磷 图 7 堆肥过程因子与ARGs相对丰度的二维排序图 Fig. 7 RDA biplot of ARGs relative abundances and the composting process factors

(1)磺胺抗生素的添加抑制堆肥早期微生物代谢活动，减缓养分转化，延长了堆体达到高温的时间，但磺胺抗生素的抑制作用会随着其进入时间的延长而减弱. 磺胺抗生素对堆肥微生物群落结构的影响主要反映在堆肥中期.

(2)好氧堆肥可以有效去除鸡粪中残留的SM2和SMM，堆肥14 d内降解率均达100%，且堆体中SMM降解速率高于SM2.

(3)磺胺抗生素添加明显增加堆体中sul 2 、 tetQ和tetW的相对丰度，一类抗生素可以同时诱导多类抗性基因丰度的增加. 除了抗生素，堆肥理化过程因子变化也是驱动堆体中抗性水平发生改变的重要原因. 温度与 sul1、 sul2和IntI1 明显负相关，与tetQ和tetW无明显相关性. 上述5种抗性基因与碳氮比和硝态氮与均呈负相关，而与pH、 含水率和铵态氮含量正相关；堆体pH和含水率对tetQ和tetW的影响比 sul1和sul2 要强烈.