利用嗜酸性硫杆菌(如氧化亚铁硫杆菌和氧化硫硫杆菌等)的生物酸化是去除土壤^{[1, 2, 3, 4]}、 底泥^{[5, 6, 7]}、 飞灰^[8]、 污泥^{[9, 10, 11]}等中重金属的有效方法，然而在生物酸化过程往往受到重金属阳离子、 阴离子和水溶性有机物等因子的抑制作用. 重金属阳离子对硫杆菌的毒害主要是使蛋白质发生变性. 据报道，0.1-1 mg ·kg^-1的Ag⁺几乎能完全抑制氧化亚铁硫杆菌的生长，这种抑制作用比Cd²⁺和Pb²⁺强5 000倍以上；30 g ·L^-1的Cu²⁺、 Ni⁺和Co²⁺对氧化亚铁硫杆菌的生长也有明显的抑制作用^{[12, 13]}. 阴离子以硫氰酸盐的抑制作用最强，5 mg ·kg^-1的硫氰酸盐完全抑制细菌的生长与对亚铁的氧化，此外Cl^-、 NO₃^-浓度大于50 mmol ·L^-1时，也能完全抑制氧化亚铁硫杆菌对亚铁的生物氧化^[14].

嗜酸性硫杆菌是典型的化能自养菌，对有机物特别敏感^[15]. 土壤中细菌降解有机物及污泥、 底泥有机质厌氧发酵等产生低分子有机酸等都会抑制嗜酸性硫杆菌的活性进而影响生物酸化和重金属脱除效果. Flournier等^[16]发现经高温灭菌的污泥会释放低分子有机酸，嗜酸性硫杆菌不能正常对该污泥进行有效酸化. 张再利等^[17]研究显示，氧化亚铁硫杆菌在100 mg ·L^-1乙酸和400 mg ·L^-1葡萄糖浓度范围内均能很好地生长，而在丙酸、 正丁酸中生长则受到抑制. 另有报道，甲酸、 乙酸、 丙酸等对嗜酸性硫杆菌均有强烈的抑制作用，随着有机酸浓度的增加，其对硫杆菌抑制作用逐渐增强，先后表现出弱抑制、 强抑制和完全抑制^[18]. 在弱抑制时，硫杆菌铁氧化速率下降，但仍有完整的生长周期，并最终完全利用能源物质；强抑制情况下，能源物质氧化速率大幅下降且不能完全利用；而在完全抑制情况下，硫杆菌完全失活，能源物质无明显氧化的痕迹. 因此，低分子有机酸对硫杆菌生物酸化的抑制作用主要表现在Fe²⁺和S⁰氧化的延滞期加长，导致酸化速度减慢和重金属脱除效率降低.

大量施用有机肥是改良重金属污染土壤常见的农艺措施之一. 实验证明，有机肥的添加能够有效提高土壤pH值、 降低土壤中重金属有效态含量、 降低重金属的生物可利用性等^{[19, 20]}. 然而，施用有机肥虽可通过改变重金属形态如有机质与重金属的络合来降低重金属的生物有效性和毒性，但不能从根本上去除重金属. 当环境发生变化时，重金属活性可能会重新激活. 因此，研究利用嗜酸性硫杆菌的生物酸化法去除土壤重金属具有重要意义. 但对于这些施用了有机肥的重金属污染土壤，由于有机物的分解，特别是在淹水、 局部浇水等环境中，有机物可能会分解产生大量低分子有机酸，会抑制嗜酸性硫杆菌的生物活性进而影响重金属脱除效果.

诚然，低分子有机酸对嗜酸性硫杆菌的活性抑制受到了国内外学者兴趣和研究，但大多基于若干有机酸针对某种硫杆菌的抑制效果^[21]，而有机酸对不同硫杆菌的毒害抑制程度、 不同硫杆菌对各类有机酸的耐受水平的比较等至今少有报道. 此外，虽然生物酸化技术的应用已经扩展到河床底泥、 制革污泥、 垃圾飞灰等重金属去除，包括在重金属污染土壤中的研究也有阶段性成果. 但是，施用有机肥的土壤中不同低分子有机酸对嗜酸性硫杆菌的抑制效果，及有机酸抑制时间等对生物酸化的研究未见相关报道. 为此，本研究对上述疑问进行了实验比较，并通过外源添加低分子有机酸模拟大量施用有机肥的重金属污染土壤所产生有机酸，分析有机酸添加时间对土壤生物酸化和重金属脱除效果的影响，以期为有机肥改良重金属污染土壤的生物修复提供一定理论参考.

样品取自湖北省大冶市罗家桥街办，其位于大冶有色金属冶炼厂东南侧. 在田间持水量土壤湿度下，将土壤样品装袋编号并迅速转移至实验室4℃冰箱低温保存. 测定土壤基本性质见表 1，供试土壤有机质含量较低，对应的低分子有机酸浓度较小，但根据土壤二级环境质量标准(GB 15618-2008)，土壤重金属Cd、 Cu分别超标7.1倍和13.6倍.

表 1(Table 1)

表 1 供试土壤的基本理化性质 Table 1 Basic physicochemical properties of the tested soil 指标 pH1) 有机质/% 有机酸×10-3 /mg ·L-1 重金属/mg ·kg-1 甲酸 乙酸 丙酸 镉 铜 参数 6.42 6.23 7.83 36.00 1.26 2.13 682.16 1)pH和有机酸为液土比10 ∶1时测定结果

表 1 供试土壤的基本理化性质 Table 1 Basic physicochemical properties of the tested soil

氧化亚铁硫杆菌Acidothiobacillus ferrooxidans LX5(CGMCC No. 0727)和氧化硫硫杆菌Acidithiobacillus thiooxidans TS6(CGMCC No. 0759)分别采用改良9K液体培养基和SM液体培养基扩大培养^[22]. 改良9K液体培养基成分为A液：(NH₄)₂SO₄ 3.5 g，KCl 0.119 g，K₂HPO₄ 0.058 g，Ca(NO₃)₂ ·4H₂O 0.016 8 g，MgSO₄ ·7H₂O 0.583 g，蒸馏水1 000 mL，pH 2.5，121℃灭菌30 min；B液：FeSO₄ ·7H₂O 44.2 g ·L^-1，pH 2.5，0.22 μm滤膜过滤除菌，用时A液和B液混合均匀^[23]. SM液体培养基成分为(NH₄)₂SO₄ 0.4 g，KH₂PO₄ 3.0 g，CaCl₂ ·2H₂O 0.25 g，MgSO₄ ·7H₂O 0.5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 2.5，121℃灭菌30 min；10 g ·L^-1硫粉，105℃，间歇灭菌，用时两者混合均匀^[24].

在低分子有机酸中，甲、 乙、 丙、 丁酸对硫杆菌活性具有较大的抑制作用^{[25, 26]}，4种有机酸的浓度通过测定总有机碳(TOC)含量来表示^[27]. 经测定，本实验中所用的甲、 乙、 丙、 丁酸的含量分别为551.72、 527.37、 578.24、 831.13 g ·L^-1.

有机酸对嗜酸性硫杆菌的抑制实验：在一系列500 mL三角瓶中，按2 g ·L^-1的Fe²⁺加入FeSO₄ ·7H₂O作为能源物质，按10%接种A. ferrooxidans，分别加入4种不同浓度梯度的有机酸，以不加有机酸的处理为对照，之后采用改良9K液体培养基A液补足体积，确保各处理的总体积一致. 最后用9 mol ·L^-1的H₂SO₄调上述所有体系pH至3.00±0.02. 低分子有机酸对A. thiooxidans的抑制实验与上述实验类似，仅把接种微生物换成A. thiooxidans，Fe²⁺换成相同浓度的S⁰，以SM液体培养基代替9K液体培养基A液. 甲酸的浓度梯度分别为0、 8.3、 16.5、 41.2、 81.9、 162.3、 241.0、 394.1 mg ·L^-1；乙酸的浓度梯度分别为0、 15.8、 39.4、 78.3、 155.1、 230.4、 376.7、 719.1 mg ·L^-1；丙酸的浓度梯度分别为0、 17.3、 43.2、 85.9、 170.1、 252.6、 413.0、 788.5 mg ·L^-1；丁酸的浓度梯度分别为0、 24.9、 62.0、 123.4、 244.5、 363.1、 593.7、 1 133.4 mg ·L^-1. 三角瓶置于28℃、 180 r ·min^-1的摇床中培养，每隔24 h取样，过0.22 μm滤膜后测定Fe²⁺和SO₄^2-的含量.

Fe²⁺氧化率和氧化抑制率的计算公式如下^[27]：

S⁰氧化率和氧化抑制率的计算公式如下^[27]：

从表 1来看，供试土壤中甲、 乙、 丙酸的含量较低，故本实验通过外源添加低分子有机酸来模拟大量施用有机肥的土壤所产生有机酸，人为提高重金属污染土壤有机酸浓度. 将供试土壤样品预先制备成含固率为5%的土壤泥浆，取270 mL泥浆至若干500 mL三角瓶中，添加A. ferrooxidans和A. thiooxidans菌液各15 mL，并且投加2 g ·L^-1Fe²⁺和2 g ·L^-1 S⁰作为能源物质. 置于28℃、 180 r ·min^-1的摇床中培养. 在0、 12、 24 h分别单独加入81.9 mg ·L^-1甲酸、 230.4 mg ·L^-1乙酸、 170.1 mg ·L^-1丙酸、 123.4 mg ·L^-1丁酸作为抑制剂. 以不加抑制剂的正常生物酸化处理为对照，每个处理均设3个重复. 每隔12 h取样测定泥浆中Fe²⁺和SO₄^2-含量.

前期实验得出结论，甲酸对土壤生物酸化的干扰程度最大. 参考1.2.2节的方法，观察测定甲酸作为硫杆菌抑制剂时土壤生物酸化过程pH的变化，并以不加抑制剂的正常土壤生物酸化处理为对照，每个处理均设3个重复，生物酸化96 h时测定液相中Cd和Cu的含量并根据土壤各重金属总量计算各自脱除率.

将土壤与水按1 ∶10比例混合，采用pHS-3C精密pH计测定pH值；采用液相色谱法测定土壤中各低分子有机酸含量；Cd和Cu分别采用微波消解-石墨原子吸收分光光度法和火焰原子吸收分光光度法测定；Fe²⁺含量采用邻啡罗啉比色法测定；SO₄^2-含量采用氯化钡浊度法测定；供试纯低分子有机酸用TOC进行表征，采用TOC-5000测定.

采用SPSS(SPSS 21 for windows)进行统计分析，分差分析后采用SNK (Student-Newman-Keuls test)方法进行多重比较.

不同浓度梯度低分子有机酸对A. ferrooxidans氧化Fe²⁺和A. thiooxidans氧化S⁰活性的影响分别如图 1和图 2所示. 8.3 mg ·L^-1的甲酸在24 h后对A. ferrooxidans活性的抑制作用就达到90%左右，虽然8.3、 16.5、 41.2 mg ·L^-1的甲酸对A. ferrooxidans活性的抑制效果从48 h开始有所下降，但其最低抑制率仍达到80%左右，而162.3、 241.0、 394.1 mg ·L^-1的甲酸在168 h内基本完全抑制A. ferrooxidans的活性，抑制率达到98%. Tuttle等^[26]研究表明，硫杆菌在可溶性的低分子有机酸中对甲酸最为敏感，在甲酸浓度分别达到12 mg ·L^-1和120 mg ·L^-1时对A. ferrooxidans的抑制率分别为98%和100%. Gu等^[25]研究也得出了相似的结果. 图 1(b)-1(d)表明低浓度的乙酸、 丙酸和丁酸在24 h后对A. ferrooxidans的活性抑制率有所下降，其中15.8 mg ·L^-1的乙酸、 17.3 mg ·L^-1的丙酸和24.9 mg ·L^-1的丁酸分别在144、 96 和96 h时抑制率降为0；而39.4 mg ·L^-1的乙酸、 43.2 mg ·L^-1的丙酸和62 mg ·L^-1的丁酸对A. ferrooxidans的活性抑制率分别从24 h的87%、 91%、 90%降到168 h的45%、 62%、 70%. 所以甲、 乙、 丙、 丁酸在72 h内抑制90%以上 A. ferrooxidans活性的最低酸浓度分别为41.2、 78.3、 43.2和123.4 mg ·L^-1.

图 1

Fig. 1

图 1 不同浓度低分子有机酸处理下Fe2+氧化抑制率的变化情况 Fig. 1 Change of Fe2+ oxidation inhibition rate with different concentrations of formic acid,acetic acid,propionic acid,and butyric acid

图 2

Fig. 2

图 2 不同浓度低分子有机酸处理下S0氧化抑制率的变化情况 Fig. 2 Change of S0 oxidation inhibition rate with different concentrations of formic acid,acetic acid,propionic acid,and butyric acid

如图 2所示，总体来看，在一定浓度范围内，有机酸对S⁰氧化的影响是随着有机酸浓度的增加而增强. 8.3、 16.5、 41.2 mg ·L^-1的甲酸对A. thiooxidans活性的抑制率在168 h内基本维持在30%-89%左右，差异较大，低于同水平下对A. ferrooxidans活性的抑制率. 然而当甲酸浓度达到81.9 mg ·L^-1时，对A. thiooxidans活性的抑制率在24 h时达到90%，并且在接下来的144 h内基本稳定在96%以上. 图 2(b)-2(d)表明低浓度的乙酸、 丙酸和丁酸在24 h后对A. thiooxidans的活性抑制率有所下降，其中15.8 mg ·L^-1的乙酸对A. thiooxidans活性的抑制率在168 h时降为6.56%；17.3 mg ·L^-1的丙酸和24.9 mg ·L^-1的丁酸分别在168 h和96 h时抑制率降为0. 这表明A. thiooxidans能够耐受一定低浓度的低分子有机酸，而在72 h内A. thiooxidans活性抑制率90%以上时甲、 乙、 丙、 丁酸最低浓度分别为81.9、 230.4、 170.1和123.4 mg ·L^-1. 这与初立恩等^[28]研究结果相类似，当乙酸浓度为10 mmol ·L^-1(约240 mg ·L^-1)时，A. thiooxidans休止细胞活性抑制率达到100%. 可见A. thiooxidans对低分子有机酸的的耐受性要高于A. ferrooxidans.

通过低分子有机酸对硫杆菌抑制效果可知，促使A. ferrooxidans和A. thiooxidans活性抑制率在72 h内达到90%以上的最低甲、 乙、 丙、 丁酸浓度分别为41.2、 78.3、 43.2、 123.4 mg ·L^-1和81.9、 230.4、 170.1和123.4 mg ·L^-1. 在纯体系条件下，若90%的A. ferrooxidans和A. thiooxidans活性同时被抑制，那么最低的甲、 乙、 丙、 丁酸浓度分别为81.9、 230.4、 170.1、 123.4 mg ·L^-1. 为考察低分子有机酸对正常土壤生物酸化是否存在干扰作用，本实验采用81.9 mg ·L^-1甲酸、 230.4 mg ·L^-1乙酸、 170.1 mg ·L^-1丙酸、 123.4 mg ·L^-1丁酸分别在0、 12、 24 h对土壤酸化过程中的硫杆菌活性进行抑制.

能源物质的利用速度及利用程度是间接反映硫杆菌活性的重要参考指标. 本研究考察了不同时间点各有机酸抑制下土壤泥浆中Fe²⁺和SO₄^2-含量的变化情况. 如图 3和图 4所示，与对照相比，不管是A. ferrooxidans氧化Fe²⁺还是A. thiooxidans氧化S⁰，在0 h加入低分子量有机酸作为抑制剂，其抑制硫杆菌氧化活性效果并不明显，只是能源物质利用略慢. 这主要可能原因是本实验采用的土壤样品为鲜样，0 h加入的有机酸中相当一部分被土壤某些异养微生物所降解，减弱了其对体系中硫杆菌的抑制效果^{[29, 30]}. 随着时间延长，12 h和24 h时土壤泥浆中的异养微生物数量由于体系pH的大幅下降而失活减少，不能完全以低分子有机酸作为碳源进行生物代谢利用. 从图 3列表中可以看出，在12 h和24 h两点加入甲酸后，Fe²⁺含量分别在接下来的36 h内保持稳定；而除了在土壤正常生物酸化12 h时加入丙酸能够使Fe²⁺在接下来的12 h内保持不被氧化外，其余处理加入抑制剂后的抑制效果均不显著. 但对于S⁰的氧化而言，在正常生物酸化的12 h和24 h两点分别加入甲、 乙、 丙、 丁酸后其抑制作用分别维持36 h和36 h、 24 h和24 h、 24 h和12 h、 36 h和12 h. 所以甲酸的存在对土壤生物酸化的干扰较其它3种酸要大. 另外，考虑到土壤体系较为复杂，土壤胶体可能对外源添加有机酸具有一定的吸附或其它物化作用，降低液相中有机酸有效浓度. 因此，关于土壤体系中硫杆菌受有机酸毒害效应还有待深入研究.

图 3

Fig. 3

图中表格每行标有相同字母表示在0.05水平下没有显著性差异，标有不同字母表示在0.05水平下有显著性差异，下同 图 3 不同时间点分别加入低分子有机酸抑制A. ferrooxidans活性后泥浆中Fe2+含量变化情况 Fig. 3 Variation of Fe2+ after A. ferrooxidans was inhibited by addition of formic acid,acetic acid,propionic acid, and butyric acid at different time points of acidification,respectively

图 4

Fig. 4

图 4 不同时间点分别加入低分子有机酸抑制A. thiooxidans活性后泥浆中SO42-含量变化情况 Fig. 4 Variation of SO42- after A. thiooxidans was inhibited by addition of formic acid, acetic acid,propionic acid,and butyric acid at different time points of acidification,respectively

pH变化是土壤酸化效果优劣的重要指标. 生物酸化初期(0 h)加入甲酸后，硫杆菌受甲酸的影响导致土壤pH比对照下降缓慢，但在36 h后也能降低至2.75，与对照基本持平(图 5). 这与同处理下土壤泥浆中Fe²⁺和 SO₄^2-的变化基本相吻合[图 3(a)和图 4(a)]. 而生物酸化12 h和24 h加入甲酸后，体系pH均略有所回升并在之后36 h内分别维持在3.7和3.4左右，说明生物产酸过程基本停止.

图 5

Fig. 5

图 5 在生物酸化不同时间点加入甲酸抑制硫杆菌活性后泥浆pH变化情况 Fig. 5 Variation of soil slurry pH after Thiobacillus was inhibited by addition of formic acid at different time points of acidification

图 6为生物酸化过程中甲酸投加时间点对泥浆重金属去除的影响. 与对照相比，生物酸化启动时(0h)同步添加甲酸对泥浆重金属去除没有显著影响，经96 h后重金属Cd和Cu的去除率仍分别达到67.21%和79.42%. 在12 h和24 h时投加甲酸均降低了生物酸化后期泥浆重金属去除率，且甲酸抑制时间越早越不利于体系pH的下降(图 5)和重金属的浸出(图 6).此时，重金属Cd和Cu的去除率分别降低至28.19%、 26.21%和37.67%、 41.09%. 李超等^[31]研究得出，生物酸化过程中当体系pH降低至4.0以下时，污泥固相中重金属Cu才能得以较好的溶出. 本研究对照处理中，重金属Cu的去除率最高为80%，而毕文龙等^[32]以复合硫杆菌对电镀污泥进行酸化处理时发现，污泥中Cu的浸出率达到了96.8%. 类似地，Zhou 等^[33]研究发现当体系污泥pH降低至2.0时，污泥重金属Cu的溶出率几乎接近100%. 这不仅与供试样品重金属的形态分布有一定关系，主要原因在于上述学者生物酸化时间较长(15 d)和体系终点pH较低而促使重金属浸出效率提高.

图 6

Fig. 6

图 6 在土壤生物酸化不同时间点加入甲酸抑制硫杆菌活性后泥浆重金属去除率变化情况 Fig. 6 Variation of soil slurry heavy metal removal rate after Thiobacillus was inhibited by addition of formic acid at different time points of acidification

(1)纯体系下，要使A. ferrooxidans和A. thiooxidans活性抑制率在72 h内达到90%以上，则甲、 乙、 丙、 丁酸这4种低分子量有机酸最低浓度分别为41.2、 78.3、 43.2、 123.4 mg ·L^-1和81.9、 230.4、 170.1和123.4 mg ·L^-1.

(2)甲、 乙、 丙、 丁这4种低分子量有机酸中，甲酸对A. ferrooxidans和A. thiooxidans的抑制作用最显著，A. thiooxidans相比A. ferrooxidans对上述4种有机酸具有更高的耐受性.

(3)新鲜土壤在生物酸化初期(0 h)加入4种有机酸对后续土壤酸化过程影响较小，但12 h后加入抑制剂却能使土壤生物酸化基本停止. 以甲酸为例，0 h和12 h抑制时，土壤Cd和Cu的脱除率分别为67.21%、 79.42%和28.19%、 26.21%.