水体富营养化是我国湖泊面临的主要环境问题，改善湖泊富营养化现状成为水环境修复的当务之急^{[1, 2, 3, 4]}. 磷是湖泊富营养化的限制因子，湖泊沉积物是内源磷的主要来源，沉积物中磷含量是湖泊富营养化的主要指示参数^[5].

近年来,恢复与重建沉水植物作为控制湖泊富营养化的重要途径,已经得到了广泛应用^{[6, 7]}. 沉水植物作为湖泊生态系统重要的组成部分，不仅可以吸收水体中的磷元素，而且根系泌氧给沉积物创造有氧环境，改变沉积物理化因子从而影响微生物群落结构，而这种微生物群落结构的变化是影响沉积物中磷营养盐形态转换的重要因素之一. 因此，深入研究沉水植物对微生物群落结构变化的影响，对于改变沉积物中磷元素含量并进一步缓解湖泊水体的富营养化问题，有着重要的意义^{[8, 9]}. 磷脂脂肪酸 (phospholipid fatty acid，PLFA)，是一种用来表征微生物群落结构的方法，可以作为微生物生物量和群落结构变化的特征微生物标记物^[10]. Zhang等^[11]利用磷脂脂肪酸方法研究了不同年限的黄土高原两种优势植物根系土壤微生物群落结构特征，闫法军等^[12]对刺参池塘底质微生物群落的研究也表明刺参池塘底泥和附着基微生物功能多样性具有显著的不同季节变化. 目前，PLFA方法国内外多用于土壤微生物群落的检测^{[13, 14, 15, 16]}，应用于湖泊沉积物微生物群落结构的研究较少.

当前，针对湖泊沉积物微生物结构变化的研究主要着眼于比较季节变化的影响^{[17, 18]}，野外实验很少考虑植物在不同生长周期的微生物群落结构变化趋势，因为植物群丛萌芽和衰亡时存在在湖面以下，很难在野外的环境条件下确定这个植物具体位置，而本研究选取的洪泽湖保护湿地由于范围小，水位较浅，而且没有外来干扰，加上GPS的定位结合人工定点定位能够较准确地确定采样点，对于定点分期采样有很大优势. 植物的根系随着生长周期的变化会影响营养盐的循环，而磷营养盐的循坏与微生物群落结构的变化密切相关. 因此，本研究利用PLFA方法对洪泽湖保护湿地沉水植物根系沉积物群落结构进行分析，探究沉积物微生物群落在水生植物影响下不同生长周期的结构变化以及其与环境因子之间的影响关系.

洪泽湖，中国第四大淡水湖，平均深度3-4 m，地处江苏省西部淮河下游，苏北平原中部西侧，淮安、 宿迁两市境内，如图 1所示的区域(502-菹-蓖混丛、 503-菹草群丛、 504-蓖齿眼子菜群丛)，具有完整的生态系统，植物物种丰富. 研究此区域既能够摒除外来干扰，单纯研究植物受自然环境下的影响，也能够弥补室内模拟实验生态系统不健全的不足.

图 1

Fig. 1

图 1 洪泽湖示意 Fig. 1 Map of Hongze Lake

洪泽湖保护湿地湖边沉水植物以菹草(Potamogeton crispus L.)和蓖齿眼子菜(Potamogeton pectinatus L.)为优势种，菹草具有能够抑制藻类的过量生长、 增加水体透明度、 耐污能力高、 适应能力强的特点^[19]，蓖齿眼子菜具有生态幅度宽、 耐污和适阴性强较强、 能够净化水质和抗风浪的特点^[20]，因此两者在水生植被修复方面发挥着先锋物种的作用. 1.2 样品采集

本次采样选取菹草群丛、 蓖齿眼子菜群丛和两者混丛作为研究对象，于2014年3月末(菹草旺盛期、 蓖齿眼子菜生长初期)、 5月末(菹草衰亡期、 蓖齿眼子菜旺盛期)和次年2月初(菹草生长初期、 蓖齿眼子菜萌芽期)分别在其群落内部分层采集沉积物样品．采样点分别为菹草群丛(HZZ，33° 13′20.43″N，118°19′16.14″E)、 蓖齿眼子菜群丛(HZB，33°13′29.73″N，118°19′15.45″E)、 混合群丛(HZH，33° 13′ 21.86″ N，118°19′16.93″E)，每个采样点采集3个样品作为平行. 使用彼得森采样器采样，并将底泥装入聚乙烯自封袋中，放入冷藏箱4℃保存. 带回实验室后样品经冷冻干燥后在-70℃保存，一周内完成PLFA测定及磷形态测定.

参照文献^[21]的方法加以改进.

(1) 提取 称取4 g冻干的沉积物土样，每个样品加20 mL的提取剂(柠檬酸盐缓冲液 ∶氯仿 ∶甲醇=0.8 ∶1 ∶2)避光振荡2 h后，离心取上清液，加入3.6 mL柠檬酸和4 mL氯仿，充分混合避光静置12 h，吸取下层氯仿相于干净玻璃管，氮吹至干.

(2) 分离 分别用5 mL丙酮、 三氯甲烷将固相萃取小柱(Supelco Discovery SPE DSC-Si Silicatube，3 mL，500 mg)活化，用总计1 mL的氯仿将玻璃管提取物转移到萃取小柱，然后依次加入5 mL氯仿并弃去，5 mL丙酮并弃去，5 mL甲醇并收集(此步提取磷脂颗粒),收集的甲醇相在氮气下吹干.

(3) 甲脂化 向吹干样品中加入1 mL甲醇 ∶甲苯(1 ∶1)和1 mL 0.2mol ·L^-1 KOH甲醇溶液，摇匀后35℃水浴15 min，待冷却到室温后，顺次加入2 mL去离子水，0.3 mL 1 mol ·L^-1 HAc，2 mL正己烷，漩涡混合30s，然后以710 g ·min^-1离心力离心5 min，重复提取一次，合并两次提取的正己烷相，氮气下吹干，-20℃冷冻保存.

磷脂脂肪酸数据测定采用GC 7890 N型气相色谱仪(美国Agilent公司)，包括全自动进样装置、 石英毛细管柱及氢火焰离子化检测器，色谱柱: P/N 19091J-413，HP-5毛细柱: 30 m，320 μm×0.25 μm. GC条件: 进样口温度250℃，柱温300℃，载气为高纯氮气(20 mL ·min^-1)，不分流进样，进样量1μL. 磷脂脂肪酸的鉴定采用美国MIDI公司开发的基于细菌细胞磷脂脂肪酸成分鉴定的 Sherlock MIS系统 (Sherlock Microbial Identification System).

PLFA 的命名采用以下原则：以总碳数： 双键数ω双键距离分子末端位置命名，前缀a和i分别表示支链的反异构和异构，cy则表示环丙烷脂肪酸；后缀c表示顺式，t表示反式； 10 Me表示一个甲基侧链在距分子末端第10个碳原子上，br表示不知道甲基的位置. 革兰氏阳性菌(G⁺)的磷脂脂肪酸有14:0、 16:0、 i15:0、 a15:0、 15:0、 i16:0、 a17:0、 i17:0等，革兰氏阴性菌(G^-)的磷脂脂肪酸有14:1ω5c、 15:1ω6c、 16:12OH、 cy17:0、 18:1ω5c、 18:1ω7c、 18:1ω7t、 11Me18:1ω7c、 cy19:0等，真菌的磷脂脂肪酸有16:1ω5、 18:1ω9c、 18:2ω6,9c、 18:3ω6c (6,9,12)，放线菌的磷脂脂肪酸有10Me16:0、 10Me17:0、 10Me18:0，此外部分磷脂脂肪酸仅特异性地存在于某类群微生物的细胞膜中如好氧菌的磷脂脂肪酸有 16:1ω7、 16:1ω7t、 18:1ω7，厌氧菌的磷脂脂肪酸有 cy17:0、 cy19:0^{[22, 23]}.

分别对采样点区域水体的pH、 Eh、 DO指标进行测定，分别使用HACH PHC301、 MTC301、 LDO101电极测定，TOC测定使用型号为multi N/C 3100德国耶拿TOC仪.

采用PRIMER 5软件做多维标度法(MDS)分析和Canoco软件进行RDA分析. 数据分析采用Excel 2007和SPSS v18.0软件完成. 采用单因素方差分析(ANOVA)中的最小显著性法(LSD)进行方差分析和差异显著性检验(P<0.05).

分析3种植物群丛不同时期PLFA总量变化，并对其作方差分析(ANOVA)以及LSD进行差异显著性检验.

图 2为混合群丛、 菹草群丛、 蓖齿眼子菜群丛在其不同生长周期的其根系沉积物PLFA总量的变化. 从中可以看出随着时间变化，PLFA总量呈现增加趋势，混合群丛、 菹草群丛和蓖齿眼子菜群中沉积物PLFA 总量在2月和3月无显著差异，但2月和3月均与5月有显著性差异.

图 2

Fig. 2

不同小写字母表示同一时期不同群丛差异显著(P<0.05),不同大写字母表示同一群丛不同时期差异显著(P<0.05)图 2 不同生长周期各植物群丛沉积物PLFA含量 Fig. 2 Content of PLFA in sediment during different growth periods of the plants

在2月，菹草群丛沉积物PLFA总量与蓖齿眼子菜群丛沉积物PLFA总量有显著差异，而两者均与混合群丛沉积物无显著差异，在3月和5月，3种植物群丛之间均无显著性差异. 在2月，同样的温度条件下菹草群丛的沉积物PLFA总量与蓖齿眼子菜沉积物中的总量差异显著，这是由于此时菹草处于生长初期，根系在沉积物中已经开始生长，而且植物根系分泌物中的种类多达200种以上，包括糖、 氨基酸、 有机酸、 生物酶等物质，这些物质为微生物的生存创造良好的条件^[24].

在3月时，菹草群丛沉积物PLFA总量增加73.0%，而蓖齿眼子菜群丛沉积物PLFA总量增加153.0%，可能是由于菹草在之前生长阶段沉积物中PLFA总量已累积，而且菹草根系组织较蓖齿眼子菜根系组织欠发达，根系发达的植物其分泌的营养物质可以有效地提高根际微生物的数量^[25].

5月蓖齿眼子菜进入旺盛期，沉积物中PLFA总量达到440.2 mg ·kg^-1，较生长初期增加了330.0%，菹草进入衰亡期沉积物PLFA总量达到483.9 mg ·kg^-1，较旺盛期增加181.0%，菹草衰亡时期和蓖齿眼子菜旺盛时期沉积物PLFA总量差异不明显，是由于菹草衰败的残体进入沉积物表层，植物残体生物量的增大可能会影响微生物群落的数量^{[26, 27, 28]}，残体分解过程会诱发大量微生物生成以加速其分解，且残体会造成沉积物表面有机质含量增加为微生物提供丰富底物.

混合群丛此时主要受菹草影响，其沉积物PLFA总量介于蓖齿眼子菜和菹草群丛沉积物PLFA总量之间，可能是由于混合群丛中菹草在混丛中覆盖密度低，分布较分散，根系影响作用不够明显； 在3月和5月时，混合群丛沉积物微生物总量并非是处于两种单一群丛总量之间，可能是两种植物根系分泌不同物质，这些物种之间互相影响从而反映到微生物数量，后期菹草衰亡时，蓖齿眼子菜正处于旺盛期能够有效地吸收残体中的有机质，形成更加复杂的环境影响微生物的活动.

比较分析菹草群丛不同时期表层沉积物各类微生物的百分比含量变化，如图 3，在菹草群丛的生长周期中其沉积物中细菌含量占主要成分. 在菹草的生长初期(2月)、 旺盛期(3月)、 衰亡期(5月)其沉积物中G⁺/G^-(革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌)比值变化为0.83、 1.35、 1.26. G^-比例在菹草的生长周期呈现先降低后升高趋势，G⁺比例在菹草的生长周期呈现先升高后降低趋势，放线菌比例出现小幅度增加，真菌比例先增加后降低. 对菹草群丛沉积物微生物群落结构作方差分析，结果表明在菹草群丛沉积物中，G⁺在2月与3月、 5月均差异显著，其G^-在2月与3月、 5月均差异显著； 放线菌随时间变化无显著差异，真菌在2月与3月、 5月差异显著.

图 3

Fig. 3

不同小写字母表示同一类型微生物结构在不同时期的差异显著，下同 图 3 菹草群丛沉积物微生物百分比分布 Fig. 3 Distribution of microbial percentages in sediment of Potamogeton crispus L.

比较分析蓖齿眼子菜群丛不同时期表层沉积物各类微生物的百分比含量变化，如图 4，在蓖齿眼子菜群丛的生长周期中沉积物中细菌含量占主要成分. 在蓖齿眼子菜的萌芽期(2月)、 生长初期(3月)、 旺盛期(5月)其沉积物中G⁺/G^-比值变化为0.89、 0.98、 1.49. G^-比例在蓖齿眼子菜的生长周期呈现连续降低趋势，G⁺比例在蓖齿眼子菜的生长周期呈现连续升高趋势，放线菌比例先升高后小幅降低，真菌比例先增加后降低. 对菹-蓖混合群丛沉积物微生物群落结构作方差分析，结果表明在混合群丛中，混合群丛沉积物中的G⁺在2月与5月差异显著，其G^-在2月与3月、 5月显著差异，放线菌在2月和3月有显著差异，真菌在2月与3月、 5月差异显著.

图 4

Fig. 4

图 4 蓖齿眼子菜群丛沉积物微生物百分比分布 Fig. 4 Distribution of microbial percentages in sediment of Potamogeton pectinatus L.

比较分析菹-蓖混合群丛不同时期表层沉积物各类微生物的百分比含量变化，如图 5，在混合群丛的生长周期中沉积物中细菌含量占主要成分. 在混丛生长的2、 3、 5月其沉积物中G⁺/G^-比值变化为0.73、 1.25、 1.39. G^-比例在菹-蓖混合群丛的生长周期呈现连续降低趋势，G⁺比例在菹-蓖混合群丛的生长周期呈现连续增加趋势，放线菌比例先增加后降低，真菌比例先增加后降低. 对蓖齿眼子菜群丛沉积物微生物群落结构作方差分析，结果表明在蓖齿眼子菜群丛沉积物中，G⁺在2月、 3月均与5月差异显著，而其G^-只在2月和5月有显著性差异； 放线菌随时间变化无显著差异，真菌在2月和5月无显著差异，但这两者均与3月有显著性差异.

图 5

Fig. 5

图 5 菹-蓖混合群丛沉积物微生物百分比分布 Fig. 5 Distribution of microbial percentages in sediment of mixed group

一般认为沉水植物扎根于沉积物，能够通过根际作用促进根际微生物生长，改变微生物群落结构^[29]. 沉积物中G⁺/G^-比值在蓖齿眼子菜和混丛的生长周期中呈现连续增加趋势，而在菹草群丛沉积物中呈现先升高后降低的趋势. 一般认为G^-相对于其他细菌对养分的变化更加敏感，且认为G⁺/G^-与有机质含量负相关关系^[30]，菹草5月时其沉积物中G⁺/G^-略微降低，由于此时菹草处于衰亡时期，沉积物表层累积菹草残体导致表层沉积物有机质含量升高. 在蓖齿眼子菜5月时，其沉积物中G⁺/G^-增加，可能由于蓖齿眼子菜此时处于生长旺盛期，植物生长过程对有机质有吸收作用.

蓖齿眼子菜旺盛期跟其生长初期的沉积物微生物结构差异比菹草旺盛期跟其生长初期的沉积物微生物结构差异显著. 可能由于蓖齿眼子菜在沉积物中的根系比菹草发达，对周围理化环境的影响较大，而且两种植物群丛的生长周期不一致且温度的变化对其也有调控影响.

对不同时期3种不同植物群丛沉积物中PLFA数据利用PRIMER 5软件做多维标度法(MDS)分析，结果如图 6所示(HZZ：洪泽湖菹草群丛 HZB：洪泽湖蓖齿眼子菜群丛 HZH：洪泽湖菹-蓖混合群丛). 从中可以看出微生物的组成结构在不同的时期发生了明显的变化，不同时期对微生物结构的影响远大于植物群丛本身，同一时期不同植物群丛可以聚类，而不同时期同一群丛差异较大，无法聚类. 进一步对PLFA的数据进行SIMPER分析，得到的分析报告结果如表 1所示. 2月时期的3种群丛沉积物微生物相似度为82.57%，其中对相似度贡献最大的磷脂脂肪酸为10:0 3OH、 13:0 anteiso、 12:0 iso 3OH、 14:0 iso 等； 3月时期的3种群丛相似度为84.51%，其中对相似度贡献最大的磷脂脂肪酸为16:00、 16:1ω7c、 18:1ω7c； 5月时期的3种群丛沉积物微生物相似度为80.23%，其中对相似度贡献最大的磷脂脂肪酸为16:00、 16:1ω7c、 18:1ω7c. 2月和3月的沉积物微生物组成结构的差异度为67.39%，其中对差异度贡献最大的磷脂脂肪酸为16:00、 10:0 3OH、 16:1ω7c、 13:0 anteiso、 18:1ω7c等； 2月和5月的沉积物微生物组成结构的差异度为68.41%，其中对差异度贡献最大的磷脂为16:00、 10:0 3OH、 13:0 anteiso、 16:1ω7c、 12:0 iso 3OH等； 3月和5月沉积物的微生物组成结构的差异度为19.00%，其中对差异度贡献最大的磷脂脂肪酸为16:1ω7c、 16:00、 19:1 iso I、 18:1ω7c、 18:00等.

图 6

Fig. 6

图 6 不同季节不同植物群丛沉积物微生物MDS分析 Fig. 6 MDS analysis of microorganisms in sediment for different groups during different seasons

表 1(Table 1)

表 1 不同季节不同植物群丛沉积物微生物SIMPER分析 Table 1 SIMPER analysis of microorganisms in sediment for different groups during different seasons 月份 相似度/% 磷脂脂肪酸 月份 差异度/% 磷脂脂肪酸 2 82.57 10:0 3OH13:0 anteiso12:0 iso 3OH14:0 iso 2、 3 67.39 16:0010:0 3OH16:1ω7c13:0anteiso18:1ω7c 3 84.51 16:0016:1ω7c18:1ω7c 2、 5 68.41 16:0010:0 3OH3:0 anteiso16:1ω7c12:0 iso 3OH 5 80.23 16:0016:1ω7c18:1ω7c 3、 5 19.00 16:1ω7c16:0019:1 iso I18:1ω7c18:00

表 1 不同季节不同植物群丛沉积物微生物SIMPER分析 Table 1 SIMPER analysis of microorganisms in sediment for different groups during different seasons

综合MDS和SIMPER分析的结果可以看出，在3种植物群丛中沉积物微生物群落结构随着生长周期变化而变化，而且时间越长差异度越显著. 有研究表明微生物群落结构组成存在明显时间性变动^[31]，而且植物根系活力也能够增强微生物的生长，改变根系微生物群落结构^[32].

3个采样点在2、 3以及5月水温、 DO、 Eh、 pH的理化指标如表 2所示. 从中可以看出，从2-5月随着气温的回升，水体的温度也在增加. 在2月植物刚萌芽阶段，蓖齿眼子菜群丛、 菹草群丛、 菹-蓖混丛的溶解氧(DO)相差不多，但在3月末，此时菹草处于旺盛期，单一的菹草群丛明显比其他群丛DO高，这是因为植物在旺盛期，叶片较密，其光合作用释放的氧气显著大于呼吸作用消耗的氧气. 但在5月末此时处于菹草衰亡期和蓖齿眼子菜旺盛时期，菹草群丛的溶解氧远低于蓖齿眼子菜群丛，这是因为在菹草衰亡期其叶片枯萎进行光合作用的能力较弱，而且叶片及沉积物根系腐烂分解需要消耗大量溶解氧^[33]. 在2-5月期间，菹草从生长初期到衰亡期，pH值出现先增加后降低的趋势，蓖齿眼子菜从萌芽期到生长旺盛期pH一直呈现增加趋势，说明植物的生长可以提高水体的pH^[34].

表 2(Table 2)

表 2 沉水植物群丛水体理化指标 Table 2 Physical and chemical indicators in the water with different submerged plants 采样点 指标 2月 3月 5月 T/℃ 4.2 15.6 27.1 HZH pH 8.1 8.78 9.45 DO/mg ·L-1 10.62 6.09 8.1 Eh/mV 156.0 — -145.4 T/℃ 4.2 15.6 26.7 HZZ pH 8.26 9.6 8.85 DO/mg ·L-1 11.09 10.08 5.88 Eh/mV 125.2 — -109.4 T/℃ 4.7 15.7 28.9 HZB pH 8.19 8.75 9.77 DO/mg ·L-1 10.82 7.84 17.6 Eh/mV 134 — -186.9

表 2 沉水植物群丛水体理化指标 Table 2 Physical and chemical indicators in the water with different submerged plants

对环境因子和微生物群落结构使用Canoco软件进行RDA分析，结果如图 7所示，其中代表环境因子和磷脂脂肪酸的直线方向越相近，表明二者相关程度越高； 若代表环境因子和磷脂脂肪酸的直线箭头方向相同，表明正相关，否则负相关. 首先对环境因子和微生物群落结构作趋势对应分析(DCA)可知，第一排序轴的梯度范围小于3(lengths of gradient=1.359)，则后续分析采用RDA进行评估. 结果显示第一象限解释87.5%，第二象限解释5.7%，4个象限共解释97.8%. 结果显示：18:2ω6c、 16:1ω5c所代表的真菌、 16:0 10-methyl所代表的放线菌以及16:00、 17:0 iso等磷脂脂肪酸与T、 pH以及季节变化这类环境因子呈正相关，其中17:0 iso这类磷脂脂肪酸与环境因子呈极显著正相关. DO与17:0 10-methyl这类代表放线菌的磷脂脂肪酸呈正相关，与14:00、 18:00这类磷脂脂肪酸呈负相关性. 18:1ω7c 11-methyl、 17:0 cyclo、 18:1ω9c磷脂脂肪酸与TOC和有机质有着显著正相关，其中18:1ω7c 11-methyl所代表的放线菌与TOC呈极显著正相关,说明环境因子的改变一定程度上影响微生物群落结构的变化^[32].

图 7

Fig. 7

图 7 环境因子和微生物群落结构的RDA分析 Fig. 7 RDA analysis of environmental factors and microbial community structure

以下针对部分代表性磷脂脂肪酸和环境因子间关系进行深入讨论. 图 7中18:1ω7c 11-methyl代表G^-、 17:0 cyclo代表的厌氧菌、 18:1ω9c代表的真菌与TOC有正相关关系，这是因为植物在衰败时，真菌是分解有机质的主要微生物类群，而且群从内累积大量植物残体造成TOC含量升高，此时为了加快有机质的分解会产生大量真菌，真菌在分解有机质时需要消耗氧气，造成周围区域呈现缺氧状态，因此厌氧菌的特征磷脂脂肪酸显示出了与TOC很好的相关性； 17:0 10-methyl代表放线菌的磷脂脂肪酸与DO呈正相关，可能是因为放线菌为专性好氧菌，能产生各种酶和维生素. 此外，DO也显示出了与17:0 cyclo 这类G^-呈正相关性，与14:00、 18:00这类G⁺呈负相关性，比照前文提到衰亡期时G⁺比例减少，G^-比例增加，因为衰亡期时植物无法进行光合作用且需要分解植物残体需要消耗DO，当DO 低的时候显示与G^-正相关关系，与G⁺负相关关系； 16:00、 17:0 iso代表的G⁺与pH呈正相关关系，是由于植物的根系能够分泌有机酸使得pH值降低，革兰氏阳性菌(G⁺)更易在酸性条件下生长，细菌受pH的影响，这与郭子武等研究结果一致^[35]. 温度(T)和时间(TIME)也与pH的相关磷脂脂肪酸类似，pH 也是随着植物不同生长周期根系生长变化而改变的. 微生物的生长与T、 pH、 DO密切相关，这与朱健等研究结果一致^[36].

(1)沉水群丛根系沉积物PLFA总量在不同的时期发生了显著的变化，而且生长周期对沉积物微生物群落的影响远大于植物群丛本身，时间相差越长，差异性越大.

(2) 沉水植物根系能够影响沉积物微生物群落结构. 沉水植物的生长能够增加沉积物中G⁺/G^-的比例，植物的衰亡能够降低沉积物中G⁺/G^-的比例.

(3)环境因子与沉积物微生物群落结构密切相关. 革兰氏阴性菌、 厌氧菌、 真菌的部分特征磷脂脂肪酸与TOC有正相关关系； DO与放线菌、 革兰氏阴性菌的部分特征磷脂脂肪酸呈正相关，与革兰氏阳性菌部分特征磷脂脂肪酸呈负相关性； pH与革兰氏阳性菌部分特征磷脂脂肪酸呈正相关关系； T和TIME与pH影响类似.