园林废弃物(gardenwaste)指园林植物自然凋落或人工修剪所产生的枯枝、 落叶、 草屑、 残花、 树木与灌木剪枝及其它植物残体等^[1]，主要成分为难降解的纤维素和半纤维素. 近年来，我国园林废弃物以每年8%-10%的速度递增，给城市绿色化进程带来了巨大阻力^[2]，以北京市为例，园林绿化剩余物总量超过500 万t，而消纳处置能力不足10%，目前我国处理园林废弃物的方式主要为焚烧和填埋，这两种处理方式不仅浪费了可再生资源，还造成了严重的环境污染^[3]. 大量研究表明^{[4, 5]}，利用生物堆肥降解园林废弃物是目前最为绿色环保、 无害的方法. 废弃物堆肥后土地利用，不但可以减少填埋场的面积、 减少病原菌的繁殖场所，还具有提高土壤肥力，减少城市粉尘飞扬、 杂草丛生、 土壤侵蚀和地表径流等功能，而且还能美化城市绿化景观，减少城市水分消耗，降低城市绿地维护成本并带动循环经济发展，促进园林绿化剩余物资源化利用.

但是堆肥化处理高纤维素材料如园林废弃物、 秸秆等，实现资源再利用的过程中，由于纤维素的难降解性，阻碍了堆肥化的进程^[6]. 堆肥化是指可控条件下利用微生物降解有机物质(树叶、 草坪修剪物等)的过程^[7]，降解的最终产品为堆肥，易碎、 带有土味，外观与土壤相似. 而堆肥高温期作为有机大分子分解的主要阶段，也是保障堆肥无害化的重要阶段^[8]. 但是微生物在这个阶段受到高温因素的影响，其种群数量和活性会普遍降低，由此限制了有机物的快速分解，所以分筛选高温高效纤维素降解菌对解决园林废弃物、 秸秆等资源利用具有实际意义^[9].

研究表明，混合菌株的纤维素酶活性要比单一菌株高^{[10, 11]}. 目前对于纤维素降解菌的研究大多为单一菌^[12]，对于获得纤维素降解混合菌群的方法大多采用直接筛选法^{[13, 14]}，这种方法获得的混合菌群的菌落结构不稳定^[15]，后期实验中不能保证菌群的稳定性. 并且目前市场上很少有针对以园林废弃物为堆肥材料的成熟菌剂. 本文以园林废弃物堆肥为原材料，筛选高效高温纤维素降解菌，将这些菌种混合，研究混合菌群的最优发酵条件，通过加快纤维素材料的降解，以期为废弃资源再利用和绿化环境做出贡献.

样品采自北京市昌平区某有机果园场地处于高温期的堆肥材料，堆肥原料主要为园林废弃物和动物粪便.

刚果红培养基(分离筛选)：K₂HPO₄ 0.5 g，微晶纤维素 1.88 g，MgSO₄ 0.25 g，明胶 2.0 g，刚果红 0.5 g，琼脂 14-17 g，蒸馏水1 000 mL.

富集培养基(CMC-Na培养基)：CMC-Na 15.0 g，NH₄NO₃ 1.0 g，酵母膏 1.0 g，MgSO₄ 0.5 g，KH₂PO₄ 1.0 g，蒸馏水1 000 mL，琼脂.

发酵产酶培养基：CMC-Na 5.0 g，麸皮 30 g，蛋白胨 10 g，NaCl 20 g，KH₂PO₄ 1.0 g，MgSO₄ 0.2 g，(NH₄)₂SO₄ 3.0 g，蒸馏水1 000 mL.

取10 g样品，放入含有100 mL富集培养基的锥形瓶中，50℃摇床培养2-3 d后，取1 mL上清液于含有9 mL无菌水的试管中，按照此方法依次稀释至10^-6，然后取每个稀释度的稀释液200 μL，涂布于筛选培养基上，每个稀释度3个重复，将平板置于50℃恒温培养箱中培养72 h，观察菌落生长情况，将形成明显透明圈的单菌落，进一步分离纯化后接种于刚果红培养基上，经过72 h、 50℃高温培养，筛选出D/d(透明圈直径/菌落直径)较大的菌株进行鉴定和后续实验.

采用16S rRNA序列分析的方法鉴定筛选到的D/d值较大的33株菌株. 采用菌落PCR的方法：菌株在CMC-Na培养基上培养10-12 h后，挑到灭菌PCR管中. 选用扩增细菌16S rRNA通用引物对27F(5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′)和1492R(5′-AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA-3′)进行PCR扩增(引物由北京睿博兴科生物技术有限公司提供). PCR体系为：2×GC Buffer one 25 μL，dNTPs 1.25 μL，10pmol引物各2.5 μL，5 U ·μL^-1 Tap酶 0.5 μL，无菌水17.25 μL.

将测得的菌株序列上传到NCBI数据库中进行 BLAST分析比对，从比对结果中挑选与该菌株相似性较高的菌株的16S rDNA序列，通过Clustal X进行多重序列比对，并用 MEGA6.0软件，以Neighbor-joining法构建系统发育树.

混合菌群制备：将各个单菌株接种于CMC-Na的液体培养基中，将菌液置于50℃恒温摇床中培养，每6 h测定各单菌株的D₆₀₀，进而确定各单菌株的生长曲线. 当各菌株生长到对数期时，采用分光光度法检测各菌液的D₆₀₀，经过稀释处理后使各菌液D₆₀₀≈0.2^[16]，此时各个菌液1 ∶1等体积混合，获得实验所用的混合菌群M-1.

将混合菌群M-1和单一菌株以相同的接种量，在相同的发酵条件下进行发酵产酶培养，比较混合菌群和单一菌株的产酶能力.

(1)发酵培养基的优化

在发酵产酶培养基中分别就碳源、 有机氮源和无机氮源进行了研究，以确定最佳产酶培养基，每个处理3个重复，50℃培养3 d后，测定其产生的CMCase.

(2)发酵条件的优化

在最佳培养基的条件下，分别研究了温度、 初始pH和接种量对混合菌群M-1产酶的影响，每个处理3个重复，培养3 d后，测定其产生的CMCase活力.

菌株在发酵培养基中培养3 d后，8 000 r ·min^-1，离心10 min，上清液即为粗酶液. 本实验采用DNS法^[17]进行酶活力测定.

酶活定义：在上述条件下，每分钟由1 mL酶液水解底物产生1 μmol葡萄糖的酶量作为1个酶活力单位，以(U ·mL^-1)表示.

采用Microsoft Excel 2007软件对数据进行处理，采用Microsoft Excel 2007软件和Origin 8.5软件进行绘图，使用MEGA 6.0软件包构建系统发育树.

2.1 菌株筛选与鉴定

高温驯化后，从园林废弃物堆肥中共筛选分离到97株高温纤维素降解菌株，经过形态学观察发现大部分为放线菌，极少数为细菌，这与王亮^[18] 的研究结果相似. 纤维素降解菌在刚果红平板上能形成透明圈，且所形成透明圈大小与降解性强弱有一定的关系，所以通过比较菌株透明圈直径D与菌株直径d的比值D/d来进行复筛，将初筛得到的菌株，接种到刚果红培养基上，测其透明圈直径/菌落直径即D/d. D/d值大于2的有33株(表 1)，最大值为14.

表 1 (Table 1)

表 1 菌株透明圈直径D与菌株直径d的比值 Table 1 Ratio between transparent circle diameter and colony diameter of mixed strains 菌株 D/d 菌株 D/d 菌株 D/d 1 14.00 12 3.00 23 2.44 2 12.50 13 3.00 24 2.44 3 11.00 14 2.91 25 2.40 4 11.00 15 2.90 26 2.33 5 10.00 16 2.86 27 2.29 6 7.30 17 2.82 28 2.29 7 7.06 18 2.74 29 2.22 8 3.71 19 2.67 30 2.18 9 3.68 20 2.63 31 2.14 10 3.66 21 2.60 32 2.09 11 3.00 22 2.55 33 2.04

表 1 菌株透明圈直径D与菌株直径d的比值 Table 1 Ratio between transparent circle diameter and colony diameter of mixed strains

对复筛得到的33株菌株进行PCR扩增，获得的16S rDNA序列提交到NCBIC数据库进行序列比对，选取同源性较高的菌株，构建系统发育树如图 1. 结果表明，33株菌株初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces)和短芽孢杆菌属(Brevibacillus)这2个属，同源性均达99%以上，其中链霉菌属有高温紫链霉菌(S. thermoviolaceus)、 嗜热淀粉酶链霉菌(S. thermodiastaticus)、 嗜热一氧化碳链霉菌(S. thermocarboxydus)、 黄白链霉菌(S. albidoflavus)、 热普通链霉菌(S. thermovulgaris)这5个种，这些菌种依次编码为CA-1、 CA-2、 CA-3、 CA-4和CA-5； 短芽孢杆菌属只有波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)1个种，编码为CB-1. 其中有研究报道在芦笋老茎堆肥中也发现了热普通链霉菌^[19]，且其对枝条有很好地降解作用^[20].

图 1

Fig. 1

图 1 混合菌群M-1的系统发育树 Fig. 1 Phylogenetic tree of the strains M-1

2.2 混合菌群M-1和单一菌株产酶能力比较

在相同的发酵条件下，接种混合菌群M-1和单菌株CA-1、 CA-2、 CA-3、 CA-4、 CA-5、 CB-1，对混合菌群M-1与单一菌株的产CMCase能力进行比较，结果如图 2. 单一菌株产酶能力大小顺序为CA-2>CA-1>CA-3>CA-5>CA-4>CB-1，CA-2产CMCase活力相对最高，高达60U ·mL^-1； 混合菌群M-1产CMCase活力为76 U ·mL^-1，是CA-2菌株产CMCase活力的1.3倍. 所以混合菌群M-1的产酶能力比组成它的任何单一菌株产酶能力都强，这与李波等^[21]的研究结果一致.

图 2

Fig. 2

图 2 混合菌群M-1与单一菌株产酶能力比较 Fig. 2 Comparing enzyme producing capabilities of mixed strains M-1 and single strains

发酵培养基选取麸皮、 淀粉、 微晶纤维素、 乳糖、 麦芽糖、 葡萄糖、 CMC、 果糖和蔗糖这9种碳源，研究不同碳源对混合菌群M-1产酶的影响，结果如图 3. 首先，以麸皮或者淀粉为唯一碳源时，混合菌群M-1产CMCase活力比其他碳源条件下相对较高. 葡萄糖、 果糖、 乳糖等作为唯一碳源时菌群产酶能力低，原因可能是因为CMC酶合成不仅受诱导物和菌体生长速度的影响，还容易被葡萄糖等易利用碳源所阻遏^[22]. 其次，以麸皮+CMC(本底培养基中含有的两种碳源)或者麸皮+淀粉(单一碳源中产酶最强的两种碳源)为碳源时，菌群M-1产酶能力比单一碳源条件下产酶能力强. 以麸皮+CMC为碳源时，菌群产CMCase活力为30 U ·mL^-1，而以麸皮+淀粉为碳源时，混合菌群M-1产酶能力是以麸皮或淀粉为唯一碳源时的3.3倍左右，是以麸皮+CMC为碳源时的2.1倍. 由此可见，混合菌群M-1的最佳碳源为麸皮+淀粉.

图 3

Fig. 3

图 3 不同碳源对混合菌群M-1产酶的影响 Fig. 3 Effect of different carbon sources on enzyme activity of mixed strains M-1

在最佳碳源的条件下，在培养基中添加牛肉膏、 酵母膏、 尿素、 蛋白胨和玉米粉为唯一的有机氮来源，添加量为1%，研究不同有机氮来源对混合菌群M-1产CMCase活力的影响，结果如图 4(a). 以玉米粉为有机氮的供给来源时，混合菌群M-1产CMCase活力最高，高达83.5 U ·mL^-1，比以其他有机氮源为唯一氮源时所产酶能力要强，其中以尿素为唯一有机氮源时所产生的CMCase活力最低，仅为以玉米粉为有机氮源时的18.7%. 由此可见，玉米粉是混合菌群M-1产酶的最佳有机氮源.

图 4

Fig. 4

图 4 不同氮源对混合菌群M-1产酶的影响 Fig. 4 Effect of different nitrogen sources on enzyme activity of mixed strains M-1

在发酵培养基中分别加入KNO₃、 (NH₄)₂SO₄、 NH₄Cl和NH₄NO₃这4种无机氮源，添加量分别为4.6、 3、 2.4和1.8 g ·L^-1，使无机氮素含量相等，研究不同无机氮源对菌群M-1产CMCase的影响，结果如图 4(b). 以KNO₃为无机氮源时，菌群M-1产CMCase活力最大，最大值为103 U ·mL^-1，以NH₄NO₃、 (NH₄)₂SO₄和NH₄Cl为无机氮源时所产CMCase活力保持在最大酶活时的87%、 15%和14%. 由此可见，KNO₃是混合菌群M-1产酶的最佳无机氮源.

在最佳发酵培养基的条件下，将混合菌群M-1置于不同温度(30、37、45、50和60℃)下发酵培养，研究温度对混菌M-1产CMCase活力的影响，结果如图 5(a). 混合菌群M-1随着温度的升高，产酶能力呈现先升高后降低的趋势. 当温度为45℃时，混合菌群M-1产酶能力最强，最大值为135.9 U ·mL^-1； 之后，菌群M-1产酶能力随着温度的升高而降低. 由此可以确定混合菌群M-1的最佳培养温度为45℃.

图 5

Fig. 5

图 5 不同条件对混合菌群M-1产酶的影响 Fig. 5 Effect of different conditions on enzyme activity of mixed strains M-1

在最佳发酵培养基和最佳温度条件下，调整初始pH值(3、 4、 5、 6、 7、 8、 9和10)，其他条件相同，研究初始pH对菌群M-1产CMCase活力的影响，结果如图 5(b)所示. 菌群M-1在偏酸性环境中产酶较高，当初始pH为4时，菌群M-1产酶活力最高，最大值达106.5U ·mL^-1，在pH为3时，菌群M-1产酶能力保持着最大酶活力的90%； pH在5-10之间时，酶活基本在最大酶活力的50%左右上下浮动.

在最佳发酵培养基条件下，选取最佳温度和最适pH，接种量(0.5%、 1%、 2%、 4%、 6%、 8%和10%)为唯一变量，研究不同接种量对混合菌群M-1产CMCase活力的影响，结果如图 5(c). 随着菌群M-1接种量的增加，菌系产酶能力呈现先升后降的趋势. 接种量在0.5%-1%之间，菌群M-1所产CMCase随着接种量的增大而增大到最高，高达123 U ·mL^-1； 接种量大于1%时，菌群M-1产CMCase能力随着接种量的增大而减小.

现有的研究中筛选纤维素分解菌的材料来源大多是从沙地、 污泥等环境中得到的，还有以动物粪便为唯一样品来源筛选到的纤维素分解菌，如Joynson等^[23]从蛞蝓的肠道中分离出Citrobacter、 Serratia、 Pectobacterium、 Acinetobacter、 Mycoplasma、 Pantoea 和Erwinia等细菌^[23]. 一方面以园林废弃物和动物粪便为菌种来源的材料少有研究，另一方面目前对于纤维素降解的研究主要集中在单一菌株^{[12, 13]}和常温菌^{[14, 15]}，如Wang等^[24]研究了堆肥过程中嗜热菌和低温菌，对每个菌种单独进行了研究； Ma等^[25]从家蚕的肠中分离出毛霉属菌，并对其酶活性质进行了简单研究； Qaisar等^[26]对纤维素降解菌花斑曲霉进行了酶学性质研究； 而研究高温纤维素降解混合菌群酶活性质的较少. 基于以上两点，本研究从园林废弃物和鸡粪混合堆肥中筛选出6株高温纤维素降解菌，经鉴定分别为高温紫链霉菌(S. thermoviolaceus)、 嗜热淀粉酶链霉菌(S. thermodiastaticus)、 嗜热一氧化碳链霉菌(S. thermocarboxydus)、 黄白链霉菌(S. albidoflavus)、 热普通链霉菌(S. thermovulgaris)和波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis)，将6株高温纤维素降解菌制成混合群群M-1，经验证，混合菌群M-1的产酶能力比组成混合菌群的各单一菌株中产酶能力强. 由于菌株CA-1、 CA-2、 CA-3、 CA-4、 CA-5和CB-1是通过分离纯化得到的，其混合菌群的菌株组合方式和菌株混合后各个菌株之间的关系，还有待于进一步研究.

堆肥中纤维素类物质的降解是在微生物代谢过程中产生的一系列酶的共同作用下完成的. 接种外源高效降解纤维素的微生物后^[27]，堆肥中纤维素酶活力提高，缩短堆肥周期，促进了堆肥中微生物降解，难分解的纤维素类有机物从而加速堆肥腐熟^[28]，纤维素酶活性与堆肥腐熟密切相关^[29]，CMC酶为纤维素酶中的一种，所以确定混合菌群最佳产酶条件对后期进行堆肥实验提供理论依据.

有报道显示，发酵培养基中的碳源为麸皮+CMC复合碳源^[30]，原因可能是CMC易被纤维素酶利用，在纤维素酶大量产生之前，必须保证菌体生长所需要的同化碳源，麸皮中含有丰富的易同化碳源和有机氮源，能够满足菌体生长所需要的营养物质，故常用作同化碳源^[31]. 所以本文选取了麸皮+CMC和所选碳源中产酶最高两种碳源(即麸皮+淀粉)作为混合碳源来进行研究. 这与很多研究^[26]中所说的CMC为菌株产CMCase活力的最佳碳源不相符.

温度和pH是影响微生物生长产酶的主要因素. 本研究中，混合菌群M-1随着温度的升高，产酶能力呈现先升高后降低的趋势，混合菌群最适生长产酶温度为45℃，为高温条件，高于和低于这个温度都阻碍了微生物生长繁殖. 这与李波等^[21]研究的农业废弃物秸秆降解菌在液体培养过程中温度变化趋势一致，都经历了先升后降的趋势，区别为李波等研究的是常温菌； 混合菌群M-1在pH为4时产酶能力最强，说明菌群M-1有很强的酸适应能力. 这与Qaisar等^[26]研究的曲霉的最佳pH为4的结论相同. 接种量对菌群M-1产酶也有很重要的影响，接种量过高可能因为菌群密度过大引发营养物质竞争，出现营养匮乏，菌体相互抑制导致菌体生长受限，产酶能力下降.

综上所述，混合菌群M-1以1%的接种量接种于在初始pH为4的含有以麸皮+淀粉为混合碳源，以玉米粉为有机氮源，以KNO₃为无机氮源的培养基中，在45℃条件下发酵培养，混合菌群M-1产CMCase活力最大，为135.9 U ·mL^-1，是没优化条件前76 U ·mL^-1的1.8倍.

(1)本研究从园林废弃物鸡粪混合堆肥高温期堆肥中，筛选出6株具有较强降解纤维素能力的菌株，其中5株为链霉菌属(Streptomyces )菌种，1株为波茨坦短芽孢杆菌(Brevibacillus borstelensis). 目前高温放线菌对于纤维素降解的研究相对较少，所以本研究为园林废弃物降解菌剂扩大了菌种资源库.

(2)相同发酵条件下，比较混合菌群M-1和单一菌株降解纤维素的能力. 结果表明，混合菌群产CMCase活力比任何组成它的单一菌株都要高，为菌剂开发利用提供了理论依据.

(3)混合菌群M-1在最优条件下(即：以1%接种量接种于初始pH为4的以麸皮+淀粉混合物为碳源，玉米粉为有机氮源，KNO₃为无机氮源的培养基中，45℃)培养，产酶能力是优化培养条件之前的1.8倍，为应用于生产提供了数据基础.