环丙沙星(CIP)是一种喹诺酮类抗生素，被广泛应用于泌尿生殖系统等细菌感染疾病的治疗，通过影响细菌细胞DNA促旋酶和拓扑异构酶，从而抑制细胞DNA的复制^[1]. 近年来，CIP在城市污水和地表水中被频繁检出^{[2, 3]}，对生态环境和人体健康造成潜在的危害影响. 有研究表明^{[4, 5]}，CIP能够改变现有微生物群落结构的组成，同时可以促使细菌抗药性的产生和散播.

微生物硝化反应通常包括两个步骤：氨氧化(NH₃→NO₂^-)和亚硝酸盐氧化(NO₂^-→NO₃^-)阶段，分别由功能微生物氨氧化细菌(ammonium-oxidizing bacteria，AOB)和亚硝酸盐氧化细菌(nitrite-oxidizing bacteria，NOB)所驱动，其中氨氧化阶段一般被认为是整个硝化过程的限速步骤. 在污水生物脱氮过程中，参与硝化反应的关键细菌微生物主要为AOB，以及NOB中的硝化螺菌属(Nitrospira)和硝化杆菌属(Nitrobacter)^{[6, 7]}. 硝化微生物的生长速率非常缓慢，而且对环境条件的变化也很敏感，如pH^{[8, 9]}、 温度^{[10, 11]}、 溶解氧^[12]和有毒物质^{[13, 14]}等. 尽管如此，目前关于CIP对硝化过程及其功能微生物变化影响方面的研究还很少.

本研究以曝气生物滤池(BAF)作为研究对象，考察低浓度CIP对硝化过程及硝化微生物的变化作用影响，同时采用实时荧光定量PCR(qPCR)分析手段，检测分析CIP抗性基因(CIP-ARGs)，包括parC、 aac、 oqxB和qepA在生物膜硝化过程中的变化情况，分析探讨硝化微生物与CIP-ARGs之间的相关关系，以期为通过调控硝化反应过程参数，减轻抗生素等新型污染物对硝化微生物的负面影响提供科学依据和数据支撑.

分析仪器：SG6型溶解氧仪(Mettler Toledo)、 ICS-90型离子色谱(Dionex)、 恒温水浴氮气吹干仪(Organomation Associates)、 Fresco 17型台式高速离心机(Thermo Scientific)、 T100型普通PCR仪(Bio-rad)、 LightCycle 96型实时荧光定量PCR仪(Roche)、 Qubit 2.0型核酸蛋白测定仪(Invitrogen).

实验药品：本研究所使用的环丙沙星(CIP，纯度为98%)购自百灵威(J&K)科技有限公司. 乙腈为色谱纯，购自美国Sigma-Aldrich公司； 其它化学试剂均为分析纯，除过硫酸钾(纯度为99%)购自美国Sigma-Aldrich公司外，其余购自国药集团化学试剂有限公司.

本研究实验装置BAF为圆柱形有机玻璃柱，柱高1 200 mm，内径80 mm. 滤池采用沸石作为填料，装填高度为900 mm，装填密度为1.40 g ·cm^-3，滤料比表面积为500 m² ·g^-1. 滤池上部设有溢流口和反冲洗排水口，原水和反冲洗进水口均设于滤池底部； 距离滤池底端100 mm处设有穿孔曝气管. 滤池整体和硅胶水管均采用铝箔包裹遮光，以防止CIP发生光解及滋生藻类.

如图 1所示，原水由蠕动泵从滤池底部进水口打入，采用上向流方式，流速控制在125 cm ·h^-1，水力停留时间约为5 h. 空气由气泵从滤池底部进气口鼓入，通过控制阀门调节进气强度，确保滤池内溶解氧质量浓度稳定在2-3 mg ·L^-1之间. 此外，滤池中运行pH值约为7.3，温度约为25℃.

图 1

Fig. 1

图 1 实验装置流程示意 Fig. 1 Schematic diagram of the experimental device

在投加CIP之前，BAF采用实验室长期稳定运行的好氧反应器中活性污泥进行接种挂膜，并稳定运行7 d. 采用人工配水(见表 1)连续运行60 d，使得生物膜可完全适应进水水质，且对进水COD和氨氮的去除率可分别稳定在80%和40%以上. 随后，在2号装置(BAF-2)进水中加入质量浓度为50 μg ·L^-1的CIP，而1号装置(BAF-1)仍以原水进水运行.

表 1 (Table 1)

表 1 原水配水水质 Table 1 Compositions of the synthetic wastewater 组分1) BAF-1 BAF-2 CIP 0 50 CH3COONa ·3H2O 100 100 CaCl2 20 20 MgSO4 ·7H2O 0.42 0.42 K2HPO4 10 10 FeCl3 375 375 MnCl2 ·4H2O 30 30 H3BO3 37.5 37.5 ZnSO4 ·7H2O 30 30 CuSO4 ·5H2O 7.5 7.5 KI 45 45 (NH4)2SO4 70 70 1)CIP单位为μg ·L-1，其余均为mg ·L-1

表 1 原水配水水质 Table 1 Compositions of the synthetic wastewater

取一定量载有生物膜的滤料于50 mL离心管中，加入灭菌后的磷酸盐缓冲溶液，超声5 min，然后在5 000 r ·min^-1条件下离心10 min，过滤后将滤料表面上的生物膜洗脱下来，再次离心，收集沉淀固体进行DNA提取.

采用PowerSoil DNA Isolation Kit(MoBio Laboratories，USA)抽提样品，提取步骤参照试剂盒说明书. 所提取的DNA使用1%琼脂糖凝胶电泳和Qubit 2.0核酸蛋白测定仪检测其纯度和浓度.

目标硝化微生物基因序列片段和CIP抗性基因使用普通PCR和qPCR进行定性和定量分析，所用的扩增引物序列信息详见表 2. 其中，CTO引物特异性较高，对β-变形杆菌亚纲氨氧化细菌(β-AOB)扩增效果较好^[15]. qPCR反应体系如下：10 μL FastStart Green Master (Roche)，上下游引物 (10 μmol ·L^-1) 各1 μL，DNA模板1 μL，7 μL ddH₂O，反应体系总体积为20 μL. CIP抗性基因的qPCR 反应程序如下: 95℃预变性10 min，95℃变性10 s，退火温度 (qepA：61℃； parC：62℃； oqxB：60℃； aac：58℃) 20 s，72℃延伸30 s，共40个循环. 目标硝化微生物基因序列片段qPCR 反应程序如下: 95℃预变性10 min，95℃变性10 s，退火温度(AOB：57℃； Nitrospira：65℃； Nitrobacter：55℃)10 s，72℃延伸30 s，共45个循环. 每组样品3个平行样，同时使用无菌水作为阴性对照.

表 2 (Table 2)

表 2 qPCR所使用的基因引物信息 Table 2 英文 Sequences of primers for qPCR reactions标题 目标物 引物 引物序列 产物大小/bp 文献 16S rRNA 121F238R AGGAAGGTGGGGATGACCGGCTTTCTGGGATTGG 117 [17] AOB CTO189FCTO654R GGAGRAAAGYAGGGGATCGCTAGCYTTGTAGTTTCAAACGC 465 [18] Nitrobacter FGPS872FFGPS1269R CTAAAACTCAAAGGAATTGATTTTTTGAGATTTGCTAG 397 [19] Nitrospira NSR1113FNSR1264R CCTGCTTTCAGTTGCTACCGGTTTGCAGCGCTTTGTACCG 151 [20] qepA FR CCAGCTCGGCAACTTGATACATGCTCGCCTTCCAGAAAA 570 [21] parC FR CTGGATGCCGATTCCAAGCACGAAGGACTTGGGATCGTCCGG 186 [22] oqxB FR TCCTGATCTCCATTAACGCCCAACCGGAACCCATCTCGATGC 131 [23] aac FR TTGCGATGCTCTATGAGTGGCTACTCGAATGCCTGGCGTGTTT 482 [24]

表 2 qPCR所使用的基因引物信息 Table 2 Sequences of primers for qPCR reactions

在分析目标基因结果时，选择一个内参基因对目标基因的表达量进行校正，可以提高分析方法的准确性和重现性^[16]. 16S rRNA基因是细菌的保守基因片段，一般可用其浓度表示生物总量，将目标基因浓度同16S rRNA基因相比，可得各个目标基因在总菌群中的丰度(相对丰度).

进水和出水中亚硝酸根(NO₂^-)和硝酸根(NO₃^-)离子采用离子色谱仪(Dionex)测定； 氨氮(NH₄⁺-N)和化学需氧量(COD)的测定参照国家标准监测分析方法^[25]进行测定.

数据分析利用 SPSS 19.0 统计分析软件处理，计算因变量和自变量之间的皮尔逊相关系数(r)和P值，设置规定的统计检验显著性水平P=0.05，若P≤0.05认为具有显著相关性，反之则认为相关性不显著.

图 2为BAF进、 出水中NH₄⁺-N、 NO₂^-和NO₃^-的质量浓度变化情况，其中进水中未检出NO₂^-和NO₃^-. 从中可以看出，BAF-1出水中NH₄⁺-N、 NO₂^-和NO₃^-的平均质量浓度分别为5.12、 1.31和2.94 mg ·L^-1. 在整个运行周期内，出水中NH₄⁺-N、 NO₂^-和NO₃^-的质量浓度变化波动较小. BAF-2出水中NH₄⁺-N的平均质量浓度为5.37 mg ·L^-1，NO₂^-和NO₃^-的平均质量浓度分别为1.75 mg ·L^-1和2.56 mg ·L^-1. 从图 2中曲线变化情况可以看出，CIP的加入对NH₄⁺-N的去除变化影响不大，但对出水中NO₂^-和NO₃^-的质量浓度变化具有一定影响. 在投加CIP后的初始阶段，出水中NO₂^-和NO₃^-的质量浓度波动较大，在第31 d后趋于平缓.

图 2

Fig. 2

图 2 CIP对BAF中NH4+-N、 NO2-和NO3-的浓度变化影响 Fig. 2 Effect of CIP on the variation of NH4+-N,NO2- and NO3- concentrations in BAF

从整体上看，BAF对NH₄⁺-N的去除效果相对稳定. 尽管如此，当加入CIP后，出水中NO₃^-的质量浓度有所降低，从2.84 mg ·L^-1降至2.34 mg ·L^-1，而NO₂^-质量浓度相对有所上升，从1.51 mg ·L^-1升至1.96 mg ·L^-1，一定程度上表明亚硝酸盐氧化细菌对NO₂^-的氧化作用受到抑制，这种抑制作用持续约8 d后，出水中的NO₃^-质量浓度开始逐渐升高，并保持相对稳定. 由此可以推断，亚硝酸盐氧化细菌在低浓度CIP(50 μg ·L^-1)环境下具有一定的调节适应能力，尽管开始硝化反应受到抑制，但随后即可很快恢复. Gonzalez-Martinez等^[27]的研究同样表明，投加质量浓度为100 ng ·L^-1的CIP对微生物氨氧化过程具有短暂的抑制作用，同时伴随着微生物量的暂时降低.

此外，研究同样发现，生物膜微生物在硝化作用的同时对COD的去除较为稳定(数据未列出)，BAF-1和BAF-2中COD去除率范围分别为61.0%-70.3%和60.4%-70.7%，表明CIP的加入对微生物降解有机物影响较小.

CIP具有广谱杀菌作用，对细菌微生物的生长繁殖具有一定影响. Gonzalez-Martinez等^[27]发现在短程硝化过程中，质量浓度分别为100 ng ·L^-1和350 ng ·L^-1的CIP对氨氧化和亚硝酸盐氧化过程均具有一定的抑制作用，当CIP质量浓度为350 ng ·L^-1时，活性污泥系统内氨氧化细菌数量明显下降. Amorim等^[28]研究发现，在喹诺酮类抗生素(包括CIP、 氧氟沙星和诺氟沙星)混合质量浓度分别为9 μmol ·L^-1和32 μmol ·L^-1条件下，活性污泥系统中氨氧化细菌和亚硝化细菌的活性虽未受到明显抑制，但其整体微生物群落结构却发生了转移. 结合上述CIP对BAF中氮素形态变化的作用影响，本研究重点考察了CIP的加入对BAF中硝化微生物的变化影响，包括AOB、 Nitrospira和Nitrobacter.

图 3为CIP的投加对BAF中AOB、 Nitrospira和Nitrobacter的浓度变化影响. 从中变化曲线可以看出，BAF-1生物膜中硝化微生物的丰度变化较为稳定，AOB、 Nitrospira和Nitrobacter的丰度水平分别为6.5×10³-1.3×10⁴、 4.8×10³-1.1×10⁴和6.5×10⁶-1.3×10⁷ copies ·g^-1，Nitrobacter显著高于AOB和Nitrospira. 相比之下，BAF-2中硝化微生物的丰度在投加CIP之前均较为稳定，加入CIP后，其变化波动较大. AOB丰度在投入CIP初始时出现一个短暂的下降，随后即恢复稳定，表明微量CIP对其影响较小. 尽管如此，CIP的加入对Nitrospira和Nitrobacter影响较大，当加入质量浓度为50 μg ·L^-1的CIP时，BAF-2中Nitrospira和Nitrobacter的丰度均呈现先急剧降低，随后又升高的变化趋势，但适应周期有所不同. Nitrospira在投加CIP后第9 d时降至最低，降低幅度达1个数量级，而后开始不断升高，到第24 d时已超过未投加CIP时的丰度. 同样地，Nitrobacter在投加CIP后第9 d时降至最低，约为3.8×10⁶ copies ·g^-1，随后虽略有升高，但幅度较小，并逐渐趋于稳定，均低于未投加CIP时的丰度，表明CIP对Nitrobacter的抑制作用影响更大. 除此之外，上述结果显示，CIP在开始阶段对Nitrospira和Nitrobacter均具有一定的抑制作用，但经一段时间适应后，其可在CIP存在的环境下进行生长繁殖，这与前述NO₂^-和NO₃^-在投加CIP后初始阶段出现波动，随后逐渐趋于稳定的变化现象是一致的，同时与Gonzalez-Martinez等^[27]的研究结果相似.

图 3

Fig. 3

图 3 CIP对BAF生物膜中硝化微生物的丰度变化影响 Fig. 3 Effect of CIP on the variation in abundance of nitrifying microorganisms in biofilm

有研究表明，细菌抗药性的出现是由于对应抗生素药物对其产生的选择性压力而引起的. 长期暴露在抗生素环境条件下，抗药性细菌会逐渐被选择成为优势菌群. 本研究选取在环境水体中普遍存在的CIP-ARGs，包括parC、 aac、 oqxB和qepA作为研究对象，其中aac为氨基糖苷修饰酶基因，parC为拓扑异构酶基因，qepA和oqxB为外排泵基因，考察这些CIP-ARGs在BAF生物膜硝化作用过程中的变化情况.

图 4为CIP-ARGs在BAF中抗性基因的相对丰度变化情况，4种抗性基因相对丰度有很大差异，其中BAF-1中aac相对丰度最高，达2.82×10^-3-8.51×10^-3，而qepA相对丰度最低，在8.51×10^-8-1.66×10^-7之间，parC和oqxB的相对丰度分别在1.91×10^-4-4.90×10^-4和9.12×10^-5-2.57×10^-4范围内. 此外，对生物膜16S rRNA基因同样进行了检测分析，发现其在整个运行周期内较为稳定，绝对丰度在2.29×10⁸-4.07×10⁸ copies ·g^-1之间，同时结合图 4中不同CIP-ARGs的曲线变化趋势可知，BAF-1运行工况对生物膜的扰动影响较小.

图 4

Fig. 4

图 4 CIP-ARGs在BAF运行过程中的波动变化 Fig. 4 Fluctuation of CIP-ARGs during the operation process of BAF

尽管如此，CIP的加入对生物膜微生物具有较为显著的影响，其中16S rRNA基因绝对丰度由3.98×10⁸ copies ·g^-1降至3.80×10⁶ copies ·g^-1之间，降低幅度达2个数量级. 此外，CIP的出现除对aac和qepA抗性基因的变化影响较小[图 4(b)和4(d)]外，对其余2种CIP-ARGs均具有一定的影响，如parC相对丰度呈现出先降低后升高的变化趋势，在投加CIP后第19 d时降幅最大，达1个数量级，这与硝化微生物Nitrobacter的变化趋势相类似； oqxB相对丰度在初始阶段波动较小，在投加CIP后第19 d时开始逐渐升高，在运行周期结束时已超过其在未投加CIP时的相对丰度，这与硝化微生物Nitrospira的变化趋势是类似的.

生物膜细菌微生物对CIP的适应和代谢，决定了其对CIP必须具有抵抗性. 由图 2(b)分析可知，CIP的加入对BAF生物膜硝化过程开始阶段具有一定抑制作用，但随后又逐渐恢复，而硝化微生物丰度也相应地出现了波动变化(见图 3)，这表明固定生物膜对低浓度的CIP具有一定的抵抗和适应能力，敏感的细菌微生物在CIP的作用下被杀灭，而携带有CIP-ARGs的细菌微生物在CIP存在环境中生存、 适应和繁殖，逐渐成为生物膜优势菌群.

由表 3数据分析可知，BAF-1生物膜中硝化微生物与CIP-ARGs之间无显著相关性. 尽管如此，研究发现BAF-2中生物膜Nitrobacter与parC抗性基因之间呈现出显著的正相关性 (r=0.895，P=0.006)，并且Nitrospira与oqxB抗性基因之间同样具有非常高的正相关性 (r=0.907，P=0.005)，推测不同硝化微生物的遗传因子中可能携带有CIP-ARGs，同时也表明CIP的出现对CIP-ARGs的诱导、 表达和散播具有一定的促进作用. 结合2.3节的分析结果可知，这种显著相关性与上述BAF-2生物膜中Nitrobacter与parC的变化趋势，及Nitrospira与oqxB的变化趋势是相一致的.

表 3 (Table 3)

表 3 硝化微生物与CIP-ARGs相关性分析 Table 3 Correlation analysis between nitrifying microorganisms and CIP-ARGs CIP-ARGs 类型 BAF-1 (CIP=0 μg ·L-1) BAF-2 (CIP=50 μg ·L-1) AOB Nitrobacter Nitrospira AOB Nitrobacter Nitrospira parC r 0.444 -0.872 0.213 -0.634 0.895 -0.085 P 0.556 0.128 0.787 0.126 0.006 0.851 aac r 0.545 -0.357 0.276 0.130 0.596 -0.456 P 0.455 0.643 0.724 0.781 0.157 0.303 oqxB r 0.401 -0.799 -0.756 -0.005 0.079 0.907 P 0.599 0.201 0.244 0.992 0.866 0.005 qepA r 0.208 0.374 0.578 -0.02 0.597 0.064 P 0.792 0.626 0.422 0.965 0.157 0.892 1)黑体字表示具有显著相关性

表 3 硝化微生物与CIP-ARGs相关性分析 Table 3 Correlation analysis between nitrifying microorganisms and CIP-ARGs

(1)低浓度CIP (50 μg ·L^-1) 对BAF生物膜硝化反应具有一定抑制作用，但经一段时间适应后可逐渐恢复. 通过对硝化微生物的检测分析可知，CIP对AOB作用影响较小，但对Nitrospira和Nitrobacter具有抑制作用.

(2)通过对生物膜CIP-ARGs检测可知，CIP除对aac和qepA抗性基因的变化影响较小外，对parC和oqxB的影响较大. 此外，实验结果发现，parC相对丰度的变化趋势与Nitrobacter的变化趋势相类似，而oqxB相对丰度与Nitrospira的变化趋势相类似.

(3)CIP对生物膜中CIP-ARGs的诱导、 表达和散播具有一定促进作用. 此外，Nitrobacter与parC之间具有显著正相关性，而Nitrospira与oqxB之间同样具有显著相关性，推测不同硝化微生物的遗传因子中可能携带有CIP-ARGs.