作为提升污水处理厂生物脱氮效能的重要途径之一，培养反应活性高、 沉降性能好的反硝化颗粒污泥(DGS)已成为国内外研究者关注的热点. 有研究表明，DGS能在有机负荷和氮负荷分别为67.5-200.0 kg ·(m³ ·d)^-1和19.1-50.0 kg ·(m³ ·d)^-1的条件下稳定运行，并获得90%-95%的有机物与硝态氮去除率，其污泥浓度可达传统活性污泥法的8-15倍，即17-30 g ·L^{-1[1, 2, 3]}. 因此，基于该技术可以实现简化工艺流程、 缩小反应器体积和提高出水水质等多重目标.

借助自身的强还原性(E₀=-0.44 V)和高可迁移性，纳米零价铁(nZVI)能够在特定条件下有效去除硝基苯、 含氯化合物、 重金属离子、 偶氮染料等难降解污染物，但其对微生物功能活性的抑制和对细胞结构的破坏作用也不容忽视^{[4, 5, 6]}. 目前，国内有关nZVI在污水生化处理系统中“剂量-效应”关系的报道还较少，针对反硝化颗粒污泥的影响研究更是从未被提及.

为探明nZVI对DGS可能存在的胁迫效应，本研究采用连续多个周期的批次实验，系统考察了经历nZVI短期冲击后，DGS反硝化活性在不同C/N比条件下的恢复情况，通过分析比反硝化速率(μ)、 去除单位硝态氮所消耗的COD值(ΔC/ΔN值)、 胞外聚合物(EPS)组分和泥相中总铁含量(Q_e)等参数，初步建立了nZVI投加量与DGS性能变化之间的相互关系，有助于优化新型反硝化系统的调控策略，提升运行稳定性.

以厌氧颗粒污泥为接种污泥，启动带内循环的上流式污泥床(USB)，反应器高径比约为9，有效体积为3.5 L，上升流速控制为3.8 m ·h^-1. 进水碳源、 氮源分别采用乙酸钠和硝酸钾，控制COD/NO₃^--N比(C/N比)为4，污泥氮负荷为1.2 g ·(g ·h)^-1，硝态氮和COD去除率分别达到95%-98%、 85%-90%. 反应器稳定运行8周后，获得成熟的反硝化颗粒污泥，呈淡黄色，粒径介于1.25-2.5 mm，MLVSS/MLSS为0.42-0.45，沉降速率约为127 m ·h^-1，最大比反硝化速率(μ)在23.0-27.1 mg ·(g ·h)^-1.

采用液相还原法制备nZVI，即在氮气保护下，使用硼氢化钠(NaBH₄)还原溶液中的三氯化铁(FeCl₃)^[7]. 产品平均粒径约为70 nm，经超纯水反复清洗后，保存于无水乙醇中. 使用前，借助超声波制成nZVI悬浊液.

污泥样品经0.9% NaCl溶液反复清洗后，分装于100 mL的具塞三角瓶中，注入80 mL反硝化基质，控制污泥浓度(MLVSS)为3 800-4 000 mg ·L^-1. 基质溶液以乙酸钠为碳源，硝酸钾为氮源(NO₃^--N浓度为100 mg ·L^-1)，依次控制C/N比为6、 4、 2和0，调节溶液pH至7.0.

反硝化批次实验共连续进行8个周期. 在第1周期的初始阶段，向不同C/N比的基质溶液中分别投加0(对照组)、 5、 10、 25和100 mg ·L^-1的nZVI，密闭后置于25℃下振荡(200 r ·min^-1). 反应1 h后，排出所有上清液并进行水质分析，再加入不含nZVI的基质溶液，重复上述过程，直至恢复期(第2-8周期)结束. 每组反应条件设3个平行组.

MLSS和MLVSS的测定采用重量法； NO₂^--N和NO₃^--N的测定分别采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法和紫外分光光度法； COD测定采用快速消解分光光度法； EPS提取采用甲醛-NaOH法^[8]； 多糖(PS)的测定采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖作为标准物质^[9]； 蛋白质(PN)的测定采用Lowry法，以牛血清蛋白作为标准物质^[10]； 采用混合酸(含硝酸、 高氯酸)湿式消解法预处理水样和泥样^[11]，采用岛津AA-6300C型原子吸收光谱仪测定两相中的总铁浓度，并扣除对照组的结果.

比反硝化速率(μ)是表征DGS功能活性的重要指标. 在计算μ值时，需扣除亚硝态氮浓度的影响^[12]，即：

DGS去除单位硝态氮消耗的COD值计为：

nZVI对DGS反硝化活性的抑制程度用比反硝化抑制率(IR)表示，如公式(3)所示：

由图 1可知，DGS比反硝化速率(μ)随反应周期的变化与基质C/N比、 nZVI投加量均密切相关.

图 1

Fig. 1

图 1 不同C/N比条件下，nZVI投加量对DGS比反硝化速率变化的影响 Fig. 1 Effects of nZVI dosage on the special denitrifiying rate of DGS under different C/N ratios

在第1周期内，C/N比为6、 4、 2和0对应的μ₀值分别达到23.7、 21.0、 11.1和4.3 mg ·(g ·h)^-1，普遍高于Lew等^[13]报道的17.9-3.0 mg ·(g ·h)^-1，这表明DGS具有优良的反硝化活性. 以C/N=6为例，投加5 mg ·L^-1 nZVI对应的μ₅与μ₀值差别很小，反应1 h后，硝态氮去除率接近100%. 而一次性投加10、 25和100 mg ·L^-1的nZVI时，DGS比反硝化抑制率(IR)将分别达到7.4%、 24.3%和56.7%. 此外，IR值与基质C/N比也呈现明显的正相关. 当C/N=4、 2和0时，投加10-100 mg ·L^-1的nZVI会使得IR值范围降至5.2%-52.0%、 4.5%-31.4%和3.5%-29.3%.

Lee等^[14]认为，在溶解氧充足的条件下，nZVI表面会被迅速氧化或腐蚀，形成由铁氧化物包裹的大颗粒，释放出Fe²⁺、 Fe³⁺，导致反应活性的降低. Wu等^[15]的研究表明，当nZVI投加量达到200 mg ·L^-1时，曝气池中活性污泥的种群丰度与ATP产量才会出现显著下降，脱氮、 除碳性能受到严重影响. 本研究中，nZVI对DGS反硝化活性的抑制浓度要低得多. 这是因为在缺氧或厌氧环境中，nZVI的表面特性将得到有效保护，因而具有更强的生物毒性^[14]. 另外，DGS是基于单一碳源培养形成的，其种群多样性势必低于普通活性污泥，这也使得前者对nZVI的耐受能力要更差^[16].

由μ值在第2-8周期内的变化可知，更低的nZVI投加量和更高的基质C/N比均有利于DGS活性的恢复. 当C/N=6时，经历3个周期的恢复，投加10 mg ·L^-1 nZVI对应的μ₁₀即可回升至μ₀的水平. 将nZVI投加量提高到100 mg ·L^-1，经历7个周期的恢复，DGS的反硝化活性仅相当于对照组的73.4%. 在贫营养条件下(C/N<4)，DGS的μ值始终随反应周期呈现下降趋势. 当C/N=0时，DGS只能依靠内源物质或水解死亡细胞进行反硝化^[13]. 如图 1(d)所示，投加不同浓度nZVI对μ值的影响很小，过量的nZVI无法借助氧化还原反应增强系统对硝态氮的去除效能^[17].

理论上，以乙酸钠为碳源时，反硝化菌去除1 g NO₃^--N需要消耗4.85 g COD^[18]. 由图 2可知，在第1周期内，随着基质C/N比的降低，DGS去除单位硝态氮(Δc_NO3^--N+0.6Δc_NO2^--N)所消耗的有机物含量(ΔCOD)逐渐减少，C/N=0时，溶液中COD值低于检测限. 由公式(2)计算得到，当C/N为6、 4和2时，对照组的ΔC/ΔN值分别为4.97、 4.42和3.86. 在不同C/N比条件下，当nZVI投加量超过10 mg ·L^-1时，DGS反硝化过程的ΔC/ΔN值明显高于对照组. 这是因为随着外界环境压力的增大，微生物生长代谢所需维持能将同步上升^[19]. 在恢复期内，借助基质溶液的稀释与洗脱作用，上清液逐渐澄清，nZVI对反硝化菌的胁迫作用不断减弱. 当C/N ≥4，nZVI>5 mg ·L^-1时，随着DGS反硝化活性的恢复，各周期ΔC/ΔN值呈缓慢下降的趋势. nZVI的初始投加量越高，ΔC/ΔN值的变化范围就越大. 反之，当外加碳源不足(C/N=2)时，DGS去除单位硝态氮消耗的COD值在第2-8周期内从4.1-4.3上升至4.8-5.0.

图 2

Fig. 2

图 2 不同C/N比条件下，nZVI投加量对反硝化过程中ΔC/ΔN值的影响 Fig. 2 Effect of nZVI dosage on the ΔC/ΔN value during denitrification under different C/N ratios

胞外聚合物是由Flavobacteria、 Zoogloea和Pseudomonas等特定菌属在特定环境压力下过量分泌的复杂高分子聚合物，其在维持颗粒结构稳定、 截留功能微生物和削弱毒物影响等方面发挥着重要作用^[20]. 从化学组成上看，蛋白质(PN)和多糖(PS)通常可占到EPS总有机碳的70%以上^[21].

由图 3可知，当C/N≥4时，DGS在第8周期的EPS总量为51.3-66.8 mg ·g^-1，明显高于第1周期的46.8-58.7 mg ·g^-1，但PN/PS值始终保持在1.4-1.6. EPS中蛋白质与多糖含量的增多是微生物活性恢复与外源物质储存的有力证据^{[22, 23]}. 反之，当外加碳源不足(C/N<4)时，微生物将可利用EPS中的多糖组分，进行内源反硝化，使得PN/PS值上升至2.1-2.3.

图 3

Fig. 3

图 3 不同C/N比条件下，EPS中蛋白质与多糖含量随nZVI投加量的变化 Fig. 3 Variation of protein and polysaccharides concentrations of EPS with nZVI dosage under different C/N ratios

在不同C/N比条件下，EPS中蛋白质与多糖含量随nZVI投加量的变化过程均非常类似. 由于毒物兴奋效应，少量nZVI可能会触发微生物的应激机制，增强酶系统活性，EPS总量略微上升. 然而，高浓度nZVI(100 mg ·L^-1)会使得PN与PS组分明显减少，在一定程度上削弱了颗粒结构的稳定性，减缓了反硝化活性的恢复进程. 这主要是因为大量nZVI颗粒吸附于细胞膜表面能够显著增强后者的通透性，影响胞内氧化还原循环，导致活性氧簇(ROS)累积，并对DNA结构和酶系统造成氧化性损伤^{[15, 24]}.

有研究表明，活性污泥可以通过表面沉积/聚集、 胞外吸附等途径，快速去除水中的各类纳米颗粒^[25]. 通过考察泥、 水两相中总铁的分布变化，探究nZVI在DGS中的吸附与洗脱过程，将有助于更客观地阐述纳米材料的“剂量-效应”关系.

在本研究中，DGS对nZVI的吸附速率很快. 接触20 min后，水相中总铁浓度的变化小于5%，反应1 h后，可近似认为已达到吸附平衡. 采用Freundlich和Langmuir等温方程均能很好地拟合该生物吸附过程(R²>0.941)，如图 4所示.

图 4

Fig. 4

图 4 不同C/N比条件下，DGS对nZVI的吸附等温线 Fig. 4 Biosorption isotherms of nZVI by DGS under different C/N ratios

Freundlich等温方程线性式：

Langmuir等温方程线性式：

表 1 (Table 1)

表 1 不同C/N条件下，DGS等温吸附方程中的参数值 Table 1 Biosorption parameters of nZVI by DGS under different C/N ratios C/N Freundlich模型 Langmuir模型 Kf n R2 Qmax b R2 6 0.958 2.280 0.997 13.21 -0.367 0.994 4 0.879 2.370 0.977 12.35 -0.244 0.989 2 0.739 2.446 0.971 7.56 -0.471 0.981 0 0.575 2.645 0.979 3.90 -0.386 0.941

表 1 不同C/N条件下，DGS等温吸附方程中的参数值 Table 1 Biosorption parameters of nZVI by DGS under different C/N ratios

有研究者认为，活性污泥等生物聚集体对纳米 颗粒的吸附机制非常复杂，包含范德华力、 表面静电和官能团作用等^[27]. 在本研究中，nZVI的投加量越高，泥相中总铁含量(Q_e)就越大. 随着基质C/N比的降低，Freundlich等温线的斜率(1/n)与容量系数(K_f)逐渐减小. 这意味着在外加碳源充足的条件下，nZVI更容易被DGS吸附，进而导致更强的生物胁迫效应. 由Langmuir等温方程的拟合结果可知，C/N=6对应的污泥最大吸附量(Q_max)约为C/N=0时的3.4倍.

在恢复期内，借助溶液的稀释与洗脱作用，泥相中总铁含量(Q_e)随反应周期逐渐降低，基质C/N比对洗脱过程的影响较小. 由图 5可知，当nZVI投加量由5 mg ·L^-1提高到100 mg ·L^-1时，反应7个周期后，Q_e的降幅从0.13-0.14 mg ·g^-1升至1.13-1.47 mg ·g^-1，洗脱率从46.3-47.5%降至32.8-38.9%.

图 5

Fig. 5

图 5 不同nZVI投加量条件下，泥相中总铁含量随反应周期的变化曲线 Fig. 5 Variation of total iron concentration in DGS with reaction period under different nZVI dosages

结合图 1和图 5可知，当泥相中总铁含量降至0.4 mg ·g^-1以下时，DGS的反硝化活性可以达到或接近对照组的水平. 例如，在C/N≥4的条件下，nZVI投加量为5 mg ·L^-1对应的第1-8周期和nZVI投加量为10 mg ·L^-1对应的第4-8周期. 对于更高的nZVI投加量(≥25 mg ·L^-1)而言，泥相中总铁含量的持续削减也为高C/N比条件下，DGS反硝化活性的恢复创造了有利条件. 例如，当C/N=6、 nZVI=100 mg ·L^-1时，Q_e在第2周期内下降了约0.86 mg ·g^-1，占到整个恢复期降幅的57%，随后DGS的μ值进入快速上升阶段.

(1)在反硝化体系中，当nZVI投加量大于5 mg ·L^-1 时，DGS活性将受到明显抑制，比反硝化抑制率(IR)与基质C/N比、 nZVI投加量呈现正相关. 但即使投加100 mg ·L^-1的nZVI，IR值超过50%，充足的外加碳源(C/N≥4)仍可有效促进DGS反硝化活性的恢复.

(2)当C/N≥4时，随着DGS反硝化活性的逐步恢复，ΔC/ΔN值缓慢下降，EPS中蛋白质与多糖含量均有所提高. 反之，当碳源不足时，DGS的μ值持续下降，EPS中多糖组分被大量消耗，PN/PS值从1.4-1.6升至2.1-2.3. 在所有C/N比条件下，投加100 mg ·L^-1的nZVI都会导致EPS总量的明显减少. 这在一定程度上削弱了颗粒结构的稳定性，减缓了反硝化活性的恢复进程.

(3)采用Freundlich和Langmuir等温方程均能很好地拟合DGS对nZVI的吸附过程(R²>0.941). 基质C/N比越高，污泥最大吸附量(Q_max)就越大. 在恢复期内，泥相中总铁含量的持续削减为高C/N比条件下，DGS反硝化活性的提升创造了有利条件. 当Q_e降至0.4 mg ·g^-1以下时，μ值可达到或接近对照组的水平.