2016, Vol. 37
现代工农业的快速发展导致大量废水排入周围水体,使得水体中氮、 磷和重金属等污染物含量逐渐升高,造成严重的水环境问题[1].进入水体的污染物不仅会导致水质恶化还会以颗粒或者可溶污染物的形式转移到沉积物中[2],影响底栖微生物的生长和分布,其中硝化和反硝化功能微生物活性决定了过量氮素的转化和去除,对改善水质,降低水体富营养化程度具有重要作用[3].有研究表明重金属污染物会抑制硝化和反硝化微生物的生长[4, 5],但痕量浓度的重金属也可能会促进氮转化[5],这是因为一些催化硝化和反硝化过程的酶是金属酶[6, 7, 8].也有研究表明沉积物氨氮、 硝氮和有机质含量对氮转化功能微生物的活性和丰度有重要影响[5, 9, 10, 11, 12].因此对受重金属以及氮、 磷和有机物污染的河流沉积物中氮转化微生物丰度的研究具有重要的意义.
铜陵是我国重要的有色金属矿业基地,已有3 000多年的铜矿开采和冶炼历史.长期的矿山开采活动不仅对矿区陆地生态环境造成破坏,还给周围河流带来较为严重的重金属污染问题.研究发现铜陵杨山冲尾矿库废水导致了周围河流沉积物的Fe、 As、 Cu、 Pb和Zn污染,且As、 Fe、 Cu的含量显著影响细菌群落结构[13].叶宏萌等[14]发现,铜陵市新桥至顺安河沉积物中Cu、 Zn、 Pb、 Cd的平均含量远超长江下游沉积物背景值,其中以Cu和Cd最显著.同时,也有研究表明铜陵市河流也受到较为严重的氮、 磷和有机质污染,如魏伟等[1]的研究发现,铜陵市河流上覆水中营养盐含量普遍偏高,其中总氮的最高质量浓度达到Ⅴ类水质标准的7.3倍,而且大部分沉积物样品的总氮和总磷含量分别超过2.00g ·kg-1和0.60g ·kg-1,均已能引起生态毒性效应.王丽等[15]的研究表明钟仓河河水总氮和COD质量浓度均值分别为6.33mg ·L-1和43.17mg ·L-1,均属于劣Ⅴ类水质.由此可见,矿山开采活动、 农业面源污染和生活污水排放是导致铜陵地区河流生态系统退化的主要原因[1, 14, 15].目前,对铜陵市河流生态系统的研究很多,但大多集中在重金属污染状况评价[1, 14]、重金属对细菌多样性[13]和浮游植物群落结构[1, 15]的影响等方面,而对沉积物中氮转化功能微生物丰度的研究还鲜有报道.本文以铜陵市矿区和农田周围的河流沉积物为研究对象,探讨季节变化和污染类型对河流沉积物中硝化和反硝化微生物丰度的影响,以期为矿业城市河流生态保护提供参考.
1 材料与方法 1.1 研究区域概况铜陵市(30°45′12″-31°07′56″ N,117°42′00″-118°10′06″ E)位于安徽省中南部,长江下游南岸,属亚热带湿润季风气候.年降雨量为1 390 mm,降雨主要集中在夏季,年平均湿度为75%-81%,年平均气温为16.2℃.无霜期为237-258 d.铜陵矿产资源丰富,是长江中下游著名的矿业城市,主要矿种有铜、 硫、 铁、 金、 银、 煤、 石灰石等,其中铜、 金、 银、 硫铁矿和石灰石储量均在全省名列前茅.金属矿产地主要在铜官山、 鸡冠山、 狮子山、 新桥和凤凰山这5个矿田.铜陵地区水资源比较丰富,主要包括顺安河、 新桥河、 钟仓河、 红星河、 黄浒河等.由于长期受到酸性矿山废水、 工农业废水和生活污水影响,铜陵市河流生态系统的污染状况严重.
研究区内共设6个采样点(图 1),按照受到的污染类型不同分成矿区周围的矿业污染组(MP组)和生活区的农业面源污染组(AP组),并将各区域采样点编号和主要污染源在表 1列出.分别在2011年11月及2012年2、 4和7月期间对以上6个采样点采集,24组沉积物样品(每组样品由3个平行样品混合而成)用外径为40 mm的PVC管[1]采集(采集深度为表层10 cm).用于微生物分析的样品在PVC管中心区域用灭菌的镊子采集并放入灭菌袋内置于4℃冰盒中,其余样品放入密封袋混匀后置于4℃冰盒用于理化性质分析.其中用于理化性质分析的样品用冷冻干燥机(FD-1A-50,中国)冻干后研磨、 过筛,用密封袋密封、 -20℃冷冻保存.
 | 图 1 铜陵市采样点分布图示意 Fig. 1 Distribution of the sampling sites in Tongling City |
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表 1 2个研究区的采样点设置和主要污染源 Table 1 Sample collection sites and main pollution sources of the two studied regions |
上覆水pH(pHw)和温度(Tw)用便携式仪器(HQ30d,USA)原位测定.沉积物含水量用单位质量沉积物鲜样经105℃烘干后损失的质量来表示； pH(pHs)用酸度计测定(M沉积物 ∶V水=1 g ∶5 mL)； 有机质含量用烧失量(LOI)法测定并采用转换系数0.58[16]将其换算成有机碳(TOC)含量； 总氮(TN)含量用元素分析仪(Elementar Vario MACRO)测定； 碳氮比(C/N)用TOC与TN的比值表示； 氨氮(NH4+-N)和硝氮(NO3--N)含量经NaCl提取后分别用苯酚-次氯酸钠比色法和紫外分光光度法测定； 总量重金属元素As、 Cu、 Fe、 Pb和Zn含量经三酸(HNO3、 HF和HClO4)消解后用ICP-AES测定.
1.3 沉积物基因组DNA提取称取0.25 g沉积物鲜样按照PowerSoil DNA Isolation Kit (MoBio Laborataries Inc. CA,USA)试剂盒的操作步骤提取沉积物基因组DNA.DNA样品用1%的琼脂糖凝胶电泳检测后置于-20℃冷冻保存.
1.4 沉积物硝化和反硝化功能基因丰度测定沉积物中硝化、 反硝化功能基因的丰度用荧光定量PCR仪(ABI step-one system)测定,引物见表 2.PCR反应条件为: 95℃热启动3 min,随后40个循环,包括95℃ 3 s,60℃ 30 s.
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表 2 PCR引物 Table 2 Primers used in this study |
定量PCR的标准曲线采用含有4个目的基因的克隆进行制备.将含有目的基因的克隆在LB培养液中过夜培养,根据EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(全式金)质粒提取试剂盒说明书提取质粒纯化并测定质粒浓度,根据摩尔常数计算目的基因的拷贝数,并将质粒连续稀释至106-102.
QPCR扩增反应体系为: 10 μL KAPA SYBR FAST qPCR Kit Master Mix (KAPA Biosysems,USA),上、 下游引物(10μmol ·L-1)各0.4 μL,6 μL沉积物DNA模板,2.8 μL无菌水以及0.4 μL ROX High,反应体系总体积为20 μL.阴性对照采用无菌水代替DNA作为反应模板,产物的特异性用溶解曲线以及凝胶电泳确定.QPCR的扩增效率为80%-90%,标准曲线R2>0.99.
qPCR扩增得到的基因拷贝数(copy number)和沉积物的湿重及其含水量用于计算单位质量干重的沉积物中目的基因的丰度(copies ·g-1).
1.5 统计分析利用SPSS 20.0软件进行数据分析,其中one-way ANOVA(Fisher's least significant difference test)被用于不同季节的沉积物理化性质和功能基因丰度的均值比较(P＜0.05),AP组和MP组间的差异采用独立样本t检验进行分析,相关性利用Pearson相关系数表示.
2 结果与分析 2.1 上覆水和沉积物理化性质本研究中4个季节MP组和AP组上覆水温度随季节变化明显,Tw以夏季最高,冬季最低.pHw均值变化范围为5.95-7.95,沉积物平均pH值范围为6.81-7.90,上覆水和沉积物pH总体上表现为中性或弱碱性.沉积物TN、 NH4+-N、 NO3--N和LOI含量及C/N均值范围分别为1.20-5.40 g ·kg-1、 5.68-39.24 mg ·kg-1、 2.14-21.48 mg ·kg-1、 18.37-91.41 g ·kg-1和8.79-14.20.重金属As、 Cu、 Fe、 Pb和Zn平均含量分别为58.75-162.86、 61.51-1 290.02、 33 377.53-79 637.51、 44.10-440.64和150.83-996.66 mg ·kg-1.
不同季节和组别上覆水和沉积物理化性质见表 3. ANOVA分析表明沉积物理化性质的季节变化并不明显,但4个季节TN、 NH4+-N和LOI平均含量均以秋季最低,其中TN和有机质最高含量均出现在春季,NH4+-N含量以夏季最高.沉积物NO3--N平均含量以秋季最高,冬季最低,C/N以冬季最高,秋季最低.沉积物中5种重金属的平均含量均表现为春季和冬季高于秋季和夏季.
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表 3 不同季节铜陵市河流上覆水和沉积物理化性质 Table 3 Physic-chemical properties of overlying water and sediment in different seasons in Tongling City |
t检验表明不同污染类型沉积物NH4+-N、 LOI、 TN、 Cu、 Fe、 Pb和Zn含量的差别明显.MP组沉积物NH4+-N、 LOI和TN平均含量均远低于AP组,AP组NH4+-N、 LOI和TN含量分别为MP组的3.84、 2.19和2.23倍.两组5种重金属的平均含量则均表现为:MP>AP,MP组As、 Cu、 Fe、 Pb和Zn含量分别为AP组的1.67、 6.13、 1.79、 3.62和3.62倍.由此可见,矿区周围河流重金属污染严重,营养盐和有机质含量较低而毗邻农田的河流氮和有机物的污染比较严重.
2.2 沉积物硝化作用功能基因丰度所有沉积物样品都能检测到古菌和细菌amoA基因.沉积物中AOA和AOB丰度的变化范围分别为1.74×105-1.45×108 copies ·g-1和1.39×105-3.39×107 copies ·g-1.除样品夏季6号、 冬季2号和6号样外,沉积物中AOA的丰度均高于AOB的丰度.
不同季节和组别沉积物中amoA基因的丰度见图 2(a)和2(b).尽管统计检验表明AOA和AOB丰度的季节变化并不显著,但夏季沉积物中两种amoA基因平均丰度均低于春季和秋季,AOB丰度甚至表现出:冬季>春季>秋季>夏季的变化趋势,说明温度并不是影响沉积物中硝化功能基因丰度的主要因素.与季节变化相同,污染类型对AOA和AOB丰度的影响也不显著,但4个季节沉积物AOB丰度均表现为:MP>AP.虽然MP组和AP组AOA平均丰度分别为7.46×106 copies ·g-1和1.69×107 copies ·g-1,AP组是MP组的两倍多,但这是由于秋季AP组极高的氨氧化古菌数量(接近细菌的10倍).而除秋季外,沉积物中AOA丰度均表现为: MP>AP.
 | 图 2 不同季节沉积物中氨氧化古菌和细菌amoA、 nirS和nirK基因的丰度 Fig. 2 Quantification of Arch-amoA,Bact-amoA,nirS and nirK genes in sediments in different seasons |
所有沉积物样品都能检测到nirS和nirK基因.沉积物中nirS和nirK基因的变化范围分别为1.69×107-8.55×109 copies ·g-1和4.45×106-1.51×108 copies ·g-1.除春季6号、 夏季4号和5号样外,沉积物中nirS基因的丰度均高于nirK基因.
不同季节和组别沉积物中nirS和nirK基因丰度见图 2(c)和2(d).与硝化功能基因相同,差异分析表明不同季节和不同污染类型沉积物中nirS和nirK基因丰度也不存在显著差异,但两种反硝化基因丰度的季节变化表现为春季(nirS)/秋季(nirK)>夏季>冬季>秋季(nirS)/春季(nirK),nirS和nirK基因的最高和最低丰度分别出现在相反的季节.同时,两组沉积物中nirS和nirK基因的平均丰度分别为:MP组,1.46×109 copies ·g-1和3.08×107 copies ·g-1； AP组,9.05×108 copies ·g-1和5.25×107 copies ·g-1,其中nirS基因丰度表现为: MP>AP,而nirK基因则与之相反.
3 讨论 3.1 不同污染类型沉积物的理化性质差异来自金属矿山尾矿库、 采石场和废石堆的废水中通常含有大量的硫化物,其氧化会产生富含金属元素的酸性矿山废水(AMD),成为矿区河流重金属重要来源之一[17].尽管有研究指出铜陵市河流重金属含量较高且偏酸性[14, 17, 18],而本次所调查的研究区内河流上覆水和沉积物总体上表现为中性或弱碱性,这与王丽等[15]对铜陵市冬季河流上覆水的研究结果相似,也与贺梦醒等[13]对杨山冲尾矿库周围河流沉积物的研究结果一致.尾矿和废石的产酸能力及酸中和潜力是影响酸性废水形成的重要因素,当产酸能力大于酸中和潜力,才有可能产生酸性排水.而当酸中和能力比较强(如凤凰山铜矿废石中CaO含量较高)则能够中和硫化物矿物产生的酸性废水,所以凤凰山铜矿的废石较少或者不产生酸性排水[17].
矿山废水一般对矿山周围和河流下游的影响较大,距矿山远近对不同区域河流重金属污染性质有重要影响.矿山周围河流沉积物通常含有较高的重金属元素,之后随着与矿山距离增加而逐渐降低且沉积物pH值会有所升高[13].对比所调查的两种污染类型河流上覆水和沉积物理化性质(表 4)可以看出,矿山周围MP组沉积物pH值低于距矿山较远的AP组,而MP组5种重金属元素的平均含量均远高于AP组,这与叶宏萌等[14]和陈莉薇等[17]的研究结果相似.研究区内河流沉积物中As、 Cu、 Pb和Zn平均含量均超过铜陵地区水系沉积物的元素背景值[17](表 4),其中MP组As、 Cu、 Pb、 Zn平均含量分别为背景值的5.76、 14.39、 4.35和7.29倍,AP组重金属含量较MP组已明显下降,但其As、 Cu、 Pb、 Zn平均含量仍为背景值的3.46、 2.35、 1.2和2.01倍,说明铜陵市矿区周围河流已受到严重的重金属污染.AP组河流由于承接较多的农田排水和生活污水,其沉积物氮和有机质含量均高于MP组,其中NH4+-N、 LOI和TN平均含量分别是MP组的3.84、 2.19和2.23倍.而且AP组多数沉积物的TN含量超过2.00g ·kg-1,生态毒性效应已达到严重级别[1],表明农业面源污染及生活污水排放已造成比较严重的生态危害.
3.2 污染类型和季节对硝化功能基因丰度的影响已有的研究表明,在大多数环境中AOA丰度高于AOB,在氨氧化过程中起主导作用[4, 10, 19, 20].所调查的河流沉积物中两种氨氧化微生物丰度大体表现为:AOA>AOB,这与对受到重金属污染的酸性淋溶土[4]和河口沉积物[9]的研究结果相似,说明铜陵市河流沉积物中氨氧化古菌在数量上占优势,是驱动氨氧化作用的主导微生物,而且AOA对重金属胁CPAHsΣ件的耐受性可能比AOB高[4, 9].氨氮作为氨氧化微生物的能量来源,其含量对AOA和AOB丰度有重要影响.由于AOA对铵离子的吸收能力比AOB强,因此在低氨氮环境中一般以氨氧化古菌为主[12, 20].有研究表明高浓度氨氮会抑制AOA同化CO2的能力从而抑制古菌生长[21].Verhamme等[22]的研究结果表明AOB在200 mg ·kg-1的氨氮条件下生长显著.因此,在氨氮富集的环境中AOB丰度一般高于AOA[12, 23].pH值也是影响氨氧化微生物丰度的主要因素.已有研究表明,AOB适宜生长的pH范围为7.0-8.5,低pH值条件会抑制AOB生长[12],而AOA在pH为3.7-8.7的范围内均能生长[24].因此,在酸性环境中一般以AOA为主[4],而碱性环境中两种氨氧化微生物丰度大小目前尚无定论.有研究表明AOA在碱性沙壤土(pH 8.34-8.65)中的丰度高于AOB[25],也有研究表明在碱性稻田土(pH=8.20)中AOB的丰度更高[26].综上所述,春季和冬季6号样极高的氨氮含量(分别为82.51mg ·kg-1和73.70mg ·kg-1)和冬季2号样偏碱性的pH条件(8.10)可能是导致这些沉积物中AOB丰度高于AOA的主要原因.
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表 4 不同污染类型河流上覆水和沉积物理化性质 Table 4 Physic-chemical properties of surface water and sediment under different pollution type |
尽管河流沉积物中MP组样品重金属含量显著高于AP组(表 3),但两组amoA基因丰度差别并不明显,这与王超等[12]对子牙河水系沉积物的研究结果相似,其原因可能是AOA和AOB对重金属的耐受性较强[27].同时,沉积物氨氧化微生物丰度大体表现为: MP>AP,重金属含量较高的河流沉积物中的丰度反而更高,这可能与AP组沉积物相比于MP组明显高的有机质含量有关.本研究中河流沉积物AOA和AOB都与LOI含量有一定的负相关关系(表 5),即有机质含量升高可能导致沉积物中氨氧化微生物丰度降低.据报道,有机物能增强异养微生物的活性,形成与硝化微生物对氧[28](O2)和氨[29]的竞争从而抑制硝化菌的生长,也有研究表明有机质有对AOA生理上的抑制作用[30].因此,高浓度有机质对氨氧化微生物生长的抑制作用可能是造成细菌和古菌amoA基因在AP组沉积物中的丰度低于MP组的原因.Erguder等[24]认为 AOA可能是兼养菌,不以氨氧化为唯一能量来源,可以利用有机质异养生长,因此导致秋季AP组AOA丰度高于MP组的原因可能是秋季AP组沉积物较低的NH4+-N、 LOI和重金属含量.
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表 5 功能基因丰度与环境因子的相关系数 1) Table 5 Correlation coefficient of abundance of functional genes and environmental factors |
温度是影响微生物生长的重要因子.Sims等[19, 20]的研究表明夏季湿地沉积物的amoA基因丰度要高于冬季,但本研究中夏季沉积物样品amoA基因丰度大多低于其他季节(图 2).这可能是因为水温降低会增加O2的饱和浓度从而促进沉积物中硝化微生物的生长[31].此外,Kemp等[32, 33]的研究表明沉积物中过饱和的O2以及随水温升高而降低的O2扩散量也可能是夏季硝化菌生长受到抑制的原因.
3.3 污染类型和季节对反硝化功能基因丰度的影响与氨氧化功能基因相同,研究区内矿业污染型河流与农业面源污染型河流沉积物中两种反硝化功能基因丰度的差异也不显著,并且沉积物样品中nirS和nirK基因丰度的数量级范围分别为107-109和106-108,与未受重金属污染的湿地基质[34, 35]中的数量接近,表明所调查的河流沉积物中较高的重金属含量并未对这两个功能基因的丰度产生明显影响,其原因可能是亚硝酸还原微生物有适应重金属胁迫环境的代谢机制[36].与amoA基因不同,沉积物中两种反硝化基因丰度的季节变化均表现为夏季高于冬季,说明温度也是影响反硝化菌生长的重要因素,这与Jung等[37]的研究结果相似.
对比研究区内两种污染类型沉积物nirS和nirK基因丰度[图 2(c)和(d)]可以看出,4个季节两组nirS基因丰度大小基本表现为:MP>AP,而nirK基因在MP组样品中丰度均低于AP,两种反硝化微生物的分布规律相反.这种差别可能与两种反硝化微生物的生态位分离有关[34, 38].研究区内大多数沉积物样品中nirS基因丰度高于nirK基因,这与湿地[34]、 河口[5]沉积物和污灌土[11]的研究结果一致,然而也有研究表明nirK基因在稻田土[38]和河口[9]、 湿地[39]沉积物中丰度高于nirS基因.此外,大部分反硝化菌是异养微生物,有机质除了能作为微生物生长的碳和能量来源影响反硝化菌生长[35],还能通过降低沉积物可利用的O2量间接促进反硝化菌生长[28],这与本研究中两种nir基因丰度均与沉积物LOI含量正相关(表 5)的结果一致.但nirS和nirK基因丰度与沉积物LOI含量的相关系数及显著度分别为:nirS(0.360,0.084)和nirK(0.027,0.902),nirS基因与LOI的关系远比nirK基因显著,即沉积物有机质含量变化对nirS基因丰度的影响可能更大,这与Guo等[11]的研究结果相似.此外,沉积物重金属含量与nirS和nirK基因丰度的相关性也不同(表 5).nirS基因丰度与重金属As、 Cu、 Pb和Zn含量呈正相关,而全部5种重金属均负相关于沉积物nirK基因. Mosier等[5]的研究发现nirS基因丰度极显著正相关于沉积物Pb含量.因此,秋季MP组沉积物nirS基因丰度低于AP组的原因可能是秋季沉积物较低的LOI和重金属含量.综上所述,虽然由nirS和nirK基因编码的蛋白酶功能相同,但具有不同nir基因的反硝化微生物对某种特殊环境的偏好程度不同[11, 34, 38].Cole等[40]的研究表明稍高的O2和较低的有机质含量对nirK反硝化微生物的生长有利,Yan等[41]则认为两种类型反硝化微生物对硝态氮的需求存在差异.因此,春季极高的沉积物LOI和重金属含量、 较低的NO3--N含量和秋季最高的NO3--N和最低的LOI含量、 较低的重金属含量可能是导致所调查的沉积物样品nirS基因丰度春季最高、 秋季最低而nirK基因丰度秋季最高、 春季最低的原因.
4 结论(1) 铜陵市河流沉积物样品总体上呈弱碱性,位于矿区周围的河流Cu、 Fe、 Pb和Zn含量明显高于毗邻农田的河流,而后者的NH4+-N、 TN和LOI含量更高； 重金属As、 Cu、 Pb和Zn平均含量均远超过铜陵市水系沉积物背景值,矿山开采已对铜陵市河流造成严重污染.
(2) 河流沉积物中硝化微生物以AOA为主,其平均丰度为AOB的4.39倍； 反硝化功能基因以nirS基因为主,其丰度平均值为nirK基因的28.35倍.
(3)矿区周围河流沉积物amoA和nirS基因的丰度高于毗邻农田的河流,而后者的nirK基因丰度更高； 夏季和冬季沉积物AOA丰度低于春季和秋季,而AOB在春季和冬季沉积物中的丰度高于夏季和秋季.nirS和nirK基因的最高和最低丰度分别出现在相反的季节,具体表现为春季(nirS)或秋季(nirK)最高,夏季、 冬季次之,秋季(nirS)或春季(nirK)最低.
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