异养硝化-好氧反硝化(heterotrophic nitrification-aerobic denitrification,HN-AD)菌所具有的同步去除有机物、氨氮和硝态氮的特点使其成为当今污水处理技术领域的研究热点之一. 近年来研究者从土壤、水库、污水处理反应器等环境中分离出的HN-AD菌多适宜盐度较低的废水处理，对耐盐菌株的研究较少. 张培玉等^[1]从稳定运行的处理高浓度氨氮含盐废水的MBR和A/O反应器活性污泥中筛选出1株耐盐HN-AD菌，并详细地研究了其异养硝化和好氧反硝化特性. 孙雪梅等^[2]从浅海网箱养殖区的富营养沉积环境中分离筛选到1株盐单胞菌属X3，并对其脱氮特性进行了深入研究. 刘天琪等^[3]从大连海域典型繁茂膜海绵 (Hymeniacidon perleve) 中筛选出1株耐盐HN-AD菌ADN-42. 因此筛选出更多耐盐并可同步脱氮除碳的HN-AD菌株、深入研究其生物学特性和脱氮机制，对高盐废水的生物脱氮具有重要的理论价值和指导意义.

本研究从胶州湾海底沉积物中筛选分离出1株海洋HN-AD菌株y3，从形态、生理生化和16S rRNA序列测定及系统发育分析方面对该菌株进行了鉴定，并对其在实际含氮海水中的生长条件和脱氮特性进行了深入分析，旨在为微生物强化处理高盐废水提供理论和技术支持.

本实验中所研究菌株分离自胶州湾海底沉积物.

菌株分离和生长高盐培养基为：KH₂PO₄ 0.2 g，K₂SO₄ 0.1 g，NH₄Cl 0.5 g，KNO₂ 1 g，柠檬酸三钠 1.5 g，微量元素溶液Ⅰ、Ⅱ各1.25 mL，海水1 000 mL，pH 7.0(用HCl和NaOH进行调节). 121℃压力锅灭菌30 min.

观察菌落的形态学特征和活化菌株时采用海水2216E培养基：蛋白胨 5 g，酵母粉 1 g，海水1 000 mL. 121℃压力锅灭菌30 min.

海水取自青岛沿海的近海水域，海水盐度约为31.8‰.

微量元素溶液Ⅰ：EDTA 5 g·L^-1，FeSO₄·7H₂O 5 g·L^-1.

微量元素溶液Ⅱ：EDTA 15 g·L^-1，H₃BO₄ 0.014 g·L^-1，MnCl₂·4H₂O 0.99 g·L^-1，CuSO₄·5H₂O 0.25g·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 0.43 g·L^-1，NiCl·6H₂O 0.19 g·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 0.22 g·L^-1，CoCl₂·6H₂O 0.24 g·L^-1，NaSeO₄·10H₂O 0.21 g·L^-1.

将菌株接种至2216E海水固体培养基上，培养12 h后观察菌株在固体培养基上的菌落特征. 通过拍摄扫描电镜照片来观察菌株的个体形态.

利用细菌生化鉴别试剂盒(BIO-KNOT Rap·E-15肠杆菌科鉴定) 对菌株进行生理生化分析.

接种一环菌株至海水2216E培养基上，以温度28℃、转速160 r·min^-1培养12 h后取200 μL菌液于EP管中，先经沸水浴13 min再经冰浴7 min后制得DNA模板. 通过通用引物进行PCR扩增.

PCR反应体系(50 μL)：正向引物27F(10 μmol·L^-1) 1 μL；反向引物1492R(10 μmol·L^-1)1 μL；2×Tap PCR MasterMix 25 μL；细菌DNA模板 2 μL；ddH₂O 21 μL.

正向引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3′.

反向引物1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′PCR反应程序：95℃预变性5 min，94℃变性 40 s，52℃ 复性40 s，72℃ 延伸90 s，30 个循环，72℃延伸 7 min.

系统发育分析：PCR 产物由上海金斯瑞生物有限公司测序，测序结果与 GenBank中已提交的模式菌株的16S rRNA 基因序列通过Blast软件进行同源性比较，通过BIOEDIT软件中的程序进行多重序列比对分析，利用MEGA 6.0软件，以Neighbor-joining法构建系统发育树.

本研究所选用的碳源包括乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸三钠和葡萄糖. pH根据已有的研究结果显示HN-AD的适应环境为中性或弱碱性，因此设置pH分别为5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5. 结合实际污水的C/N以及考虑高C/N对菌株的影响设置实验的C/N为1、5、9、13、17和21. 以分离培养基为基础，设置单一变量，其他条件设定碳源为柠檬酸三钠、pH=7.0、C/N=13配制测试液. 按2%的接种量即吸取对数生长期的菌液(D₆₀₀约为0.80)2 mL接种至100 mL灭菌后的培养基中，设置初始的氨氮的添加量为40 mg·L^-1和硝态氮的添加量为60 mg·L^-1，即总氮为100 mg·L^-1. 置于气浴恒温振荡器(转速160 r·min^-1)中，28℃ 培养20h后检测培养基中菌体的生长量(D₆₀₀)，氨氮、亚硝态氮和硝态氮的浓度.

以菌株的分离培养基为基础，柠檬酸三钠为碳源，初始pH值为7.0，C/N=13配制菌株y3的脱氮性能实验测试液，氮源分别为氯化铵、硝酸钾、亚硝酸钠、硝酸钾+亚硝酸钠、氯化铵+硝酸钾、氯化铵+亚硝酸钠，氮的初始添加量为150 mg·L^-1，混合氮源系统中氮的投加比例分别为2∶1、1∶1和1∶2.

将活化后处于对数增长期的菌液按2%的接种量接入盛有高温灭菌后的300 mL培养基中，置于恒温气浴振荡器(转速160r·min^-1)中，28℃ 培养，定时取样，测定测试液中D₆₀₀、氨氮、亚硝态氮和硝态氮的浓度变化.

氨氮：钠氏试剂分光光度法；亚硝态氮：N-(1-萘基)乙二胺分光光度法；硝态氮：麝香草酚分光光度法；菌体生长量：测定菌液在600 nm波长时的吸光度值(D₆₀₀)，实验中对氨氮、亚硝态氮、硝态氮浓度以及菌体生长量(D₆₀₀)的测定均采用UV 5200紫外/可见分光光度计进行. pH和ORP使用WTW pH/Oxi340i/SET测定. 脱氮率计算方法如下:

式中，R为氮的去除率，c_T为终态氮浓度(mg·L^-1)，c_I为初始氮浓度(mg·L^-1)，V为氮的去除速率[mg·(L·h)^-1]，t为时间.

菌株y3在固体培养基上的菌落形态如图 1(a)所示，菌落呈乳白色，不透明，表面干燥粗糙，边缘整齐，紧贴在培养基表面，易挑取. 菌体的扫描电镜照片如图 1(b)所示，菌株y3为长杆菌，大小约为2 μm×0.3 μm，无芽孢和鞭毛. 对菌株y3生理生化鉴定的结果表明，该菌为不动杆菌，氧化酶、水解酶甲基红实验、吲哚实验均呈阴性. 菌株y3的生理生化鉴定结果见表 1.

图 1

Fig. 1

图 1 菌株y3的形态特征 Fig. 1 Phylogenetic tree of strain y5 based on the homology of 16S rRNA gene sequences

表 1(Table 1)

表 1 菌株y3的生理生化特征 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain y3 代号 底物 反应 结果 ODC 鸟氨酸 脱羧酶 - LDC 赖氨酸 脱羧酶 - MR 葡萄糖 甲基红实验 - CEL 纤维糖 发酵氧化 - SOR 山梨醇 发酵氧化 - ADO 戊五醇 发酵氧化 - RHA 鼠李糖 发酵氧化 - XYL 木糖 发酵氧化 - SUC 蔗糖 发酵氧化 - MAL 丙二盐 碳源利用 - MAN 甘露醇 发酵氧化 - ARA 阿拉糖 发酵氧化 - IND 色氨酸 吲哚产生 - ESC 七叶苷 水解酶 - MOT 动力 悬滴法 -

表 1 菌株y3的生理生化特征 Table 1 Physiological and biochemical characteristics of strain y3

将获得的菌株y3的16S rRNA基因序列(长度为1 352 bp，登录号为：KR559931)提交至GenBank中，经Blast检索分析，应用MEGA 6.0软件，以Neighbor-joining 法绘制系统发育树，结果如图 2所示. 菌株y3与多株Pseudomonas stutzeri的同源性达98%，可初步判定菌株y3为假单胞菌属(Pseudomonas sp.).

图 2

Fig. 2

图 2 基于16S rRNA基因序列同源性构建的菌株y3的系统发育树 Fig. 2 Effect of carbon resource on the growth and nitrogen removal reaction of strain y3

从图 3中可以看出，菌株y3在以乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸三钠以及葡萄糖为唯一碳源时，20 h后氨氮的去除率(R)均在55%以上，硝酸盐氮的去除率均在95%以上，亚硝酸盐的累积量甚微. 碳源为乙酸钠、柠檬酸三钠和葡萄糖时，D₆₀₀均在0.80以上. 其中碳源为柠檬酸三钠时，脱氮效率最高，NH₄⁺-N的降解率为77.75%，NO₃^--N的降解率为99.54%，均高于以乙酸钠、葡萄糖或丁二酸钠为碳源的情况. 可见菌株y3的最佳碳源为柠檬酸三钠.

图 3

Fig. 3

图 3 碳源对菌株y3生长和脱氮反应的影响 Fig. 3 Effect of pH on the growth and nitrogen removal reaction of strain y3

如图 4所示，pH范围在6.0～8.0之间时，NO₃^--N的降解率均在97%以上，NO₂^--N的累积量很少. pH范围在6.5～8.0之间时，NH₄⁺-N的降解率均在91%以上，D₆₀₀值均在0.98以上. pH=7.0时，NO₃^--N的降解率最高为99.92%，NH₄⁺-N的降解率最高为98.46%，D₆₀₀值也是最高为1.25. 菌株y3的较适宜的pH范围是6.5～8.0，最适pH值为7.0.

图 4

Fig. 4

图 4 不同pH对菌株y3生长和脱氮反应的影响 Fig. 4 Effect of C/N ratio on the growth and nitrogen removal reaction of strain y3

由图 5可见，当C/N≤13时，随着比值得升高，菌株的生长量和脱氮效率升高. 当C/N=13时，D₆₀₀达到最大值为1.30，氨氮和硝态氮的降解率也达到最大值分别为99.21%和96.92%. 比值继续增加，脱氮效率反而下降. C/N范围在9～17时，NO₃^--N的降解率在94%以上，NH₄⁺-N的降解率均在91%以上，D₆₀₀均在1.11以上，且NO₂^--N的累积量很少. 菌株y3的最佳C/N为13.

图 5

Fig. 5

图 5 不同C/N对菌株y3生长和脱氮反应的影响 Fig. 5 Effects of C/N ratio on the grouth and nitrogen removal reaction of strain y3

如图 6所示，以NH₄Cl为唯一氮源时，0～10 h细菌处于适应期，NH₄⁺-N的浓度由142.99mg·L^-1降至139.89 mg·L^-1，只有微量的降解，硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的累积量甚微. 菌株于10 h进入对数生长期，NH₄⁺-N开始快速降解，到20 h时，NH₄⁺-N的浓度降至1.87 mg·L^-1，去除率达98.69%，到22 h时，降解完全. 氨氮降解过程中没有硝酸盐氮和亚硝酸盐氮的累积，菌体的生长量达到1.94.

图 6

Fig. 6

图 6 菌株y3的异养硝化过程 Fig. 6 Process of heterotrophic nitrification of strain y3

图 7为分别以KNO₃ 和NaNO₂为唯一氮源时菌株y3的好氧反硝化特性的测试结果.

从图 7(a)可见，以KNO₃为唯一氮源时，0～14 h细菌处于适应期，NO₃^--N的浓度由144.57mg·L^-1降至140.98 mg·L^-1. 14 h后菌株进入对数增长期，但增长速度非常缓慢，D₆₀₀最大只有0.74. NO₃^--N开始快速降解，反应到20 h时，NO₃^--N的浓度降至31.25 mg·L^-1，去除率达78.38%. 到22 h时，降解完全. 整个过程中，NO₂^--N的累积量较少，18 h时达到最大累积量，仅为4.95 mg·L^-1.

图 7

Fig. 7

图 7 菌株y3的好氧反硝化过程 Fig. 7 Process of aerobic denitrification of strain y3

如图 7(b)所示，以NaNO₂为唯一氮源时，0～14 h细菌处于适应期，NO₂^--N的浓度由145.42mg·L^-1降至136.83 mg·L^-1. 之后进入对数增长期，菌体的增殖速度同样缓慢，D₆₀₀最大只有0.75. NO₂^--N开始快速降解，反应到20 h时，NO₂^--N的浓度降至39.33 mg·L^-1，去除率达72.95%. 到22 h时，降解完全. 整个过程中，几乎没有NO₃^--N的累积.

图 8所示为在不同比例混合KNO₃和NaNO₂的系统中菌株y3的好氧反硝化特性. 0～12 h内为细菌生长的适应期，12～20 h为细菌生长的对数增长期，20～24 h为细菌生长的稳定期. 同时存在硝酸盐和亚硝酸盐时，菌株的生长速率和脱氮效率均有提高. 反应到20 h时，NO₃^--N∶NO₂^--N分别为2∶1、1∶1和1∶2的系统中，D₆₀₀分别为1.45、1.50和1.49，脱氮率分别为99.56%、99.75%和99.41%，均高于以硝酸钾和亚硝酸钠为唯一氮源的系统.

图 8

Fig. 8

图 8 混合氮源系统内菌株y3的好氧反硝化过程 Fig. 8 Process of aerobic denitrification of strain y3 in systems with mixed nitrogen sources

系统中共存的硝酸盐和亚硝酸盐，对彼此的还原均有促进作用. 到20 h时，NO₃^--N∶NO₂^--N分别为2∶1、1∶1和1∶2的系统中，硝酸盐的去除率分别为99.44%、99.51%和98.32%，亚硝酸盐的去除率分别为99.79%、100%和100%，均高于以硝酸钾和亚硝酸钠为唯一氮源的系统.

以不同比例混合氨氮和硝酸氮的培养液 测试菌株y3的异养硝化-好氧反硝化脱氮特性实验结果如图 9所示. NH₄⁺-N∶NO₃^--N分别为2∶1、1∶1、1∶2时，D₆₀₀的最大值分别为1.51、1.32和0.99，均低于以铵盐为唯一氮源的情况，高于以硝酸盐为唯一氮源的情况. 反应进行20 h，NH₄⁺-N∶NO₃^--N分别为2∶1、1∶1、1∶2的系统内，脱氮率均为100%，均高于以铵盐、硝酸盐为唯一氮源的情况.

图 9

Fig. 9

图 9 NH4+-N 和 NO3--N混合氮源系统下菌株y3的脱氮过程 Fig. 9 Process of nitrogen removel of strain y3 in the NH4+-N and NO3--N systems

系统中共存铵盐和硝酸盐时，对彼此的降解有促进作用. 反应到20 h，NH₄⁺-N∶NO₃^--N分别为2∶1、1∶1、1∶2的系统内，氨氮和硝态氮的降解效率均达到100%，均高于以铵盐、硝酸盐为唯一氮源的情况. 反应过程中，检测到亚硝酸盐的积累，最大累积量分别为24.18、47.55和56.07 mg·L^-1，可见，系统中硝酸盐所占的比例越大，亚硝酸盐的累积量越多.

图 10所示为NH₄Cl和NaNO₂共存时菌株y3的异养硝化-好氧反硝化特性. 从中可以看出，NH₄⁺-N∶NO₂^--N分别为2∶1、1∶1、1∶2时，D₆₀₀的最大值分别为1.78、1.52和1.29，均低于以铵盐为唯一氮源的情况，高于以亚硝酸盐为唯一氮源的情况. 可见系统中的氨氮促进细菌的增殖，氨氮含量越高，菌株对数增长时间越长，菌体的生长量越大. 反应至20 h时，菌株的脱氮率分别为90.43%、92.79%和99.96%，均高于以亚硝酸盐为唯一氮源的情况.

图 10

Fig. 10

图 10 NH4+-N 和 NO2--N混合氮源系统下菌株y3的脱氮过程 Fig. 10 Process of nitrogen removel of strain y3 in the NH4+-N and NO2--N systems

系统中共存的铵盐对亚硝酸盐的还原有促进作用，反应20 h后，各系统内NO₂^--N的去除率均在99%以上. 而亚硝酸盐的存在对氨氮的氧化产生一定的抑制，NH₄⁺-N∶NO₂^--N分别为2∶1和1∶1时，NH₄⁺-N的去除率分别为85.90%和85.67%，低于以氯化铵为唯一氮源的情况. 反应过程中，几乎没有硝酸盐的累积，亚硝酸盐的浓度也没有明显的上升.

目前已被筛选出来的HN-AD菌主要有副球菌属(Paracoccus)^[4]、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)^[5]、芽孢杆菌属(Bacillus sp.)^[6]、不动杆菌属(Acinetobacter sp.)^[7]等，主要适用于低盐度废水的处理. 而本实验从胶州湾海底沉积物中分离筛选出1株具有高效HN-AD能力的海洋菌株y3，适用于高盐度废水的生物处理. 通过形态学观察、生理生化鉴定菌及16S rRNA基因序列测定和系统发育分析，确定该菌株为假单胞菌属(Pseudomonas sp.).

碳源除了支持细菌生长外，还为菌株的HN-AD过程提供电子和能量. Richardson等^[8]在对菌株Thiosphaera pantotropha的研究中发现，碳源对周质硝酸盐还原酶的活性有很大的影响. 韩永和等^[9]对耐盐高效好氧反硝化细菌 A-13的研究结果显示，该菌的最适碳源为丁二酸钠. 宋宇杰等^[10]的研究发现菌株Acinetobacter sp． Y1的最佳碳源为柠檬酸钠和乙酸钠. 方海洋等^[11]对Alcaligenes faecalis No．4的研究发现该菌能利用柠檬酸钠和乙酸钠作为惟一碳源，以柠檬酸钠为碳源时脱氮活性最高. 本实验的研究发现，菌株y3在以乙酸钠和葡萄糖为碳源时，菌体生长最好；以柠檬酸三钠为碳源时，菌株对氨氮的去除率最高为77.75%，对硝酸盐氮的去除率为99.54%，菌株y3的最佳碳源为柠檬酸三钠. 这说明不同种属的菌株对碳源的利用状况有所不同，不同碳源因其结构和分子量的差异对菌株的生长和脱氮效果的影响也不同，分子量较小的碳源更容易为细菌利用，脱氮效率也较高. 此外，许多研究发现，在一定的碳氮比范围内，碳源浓度越高，菌株的脱氮效率越高. 吴建江等^[12]筛选出的假单胞菌XS76的最佳C/N为15，相比C/N=10时，氨氮的最终去除率有大幅提高. 超过一定的范围，碳源浓度继续增加对菌株的生长和脱氮效率没有明显的贡献，甚至有下降的趋势^{[13, 14, 15]}. 本研究的结果与之相似，C/N<13时，随着比值的升高，菌株的生长量和脱氮效率升高. 当C/N=13时，菌株的生长量达到最大值为1.30，氨氮和硝态氮的降解率也达到最大值分别为99.21%和96.92%. 随着C/N继续增加，系统内有机物增加，对细菌的生长以及酶的活性产生一定的抑制作用，因此菌株的生长量和脱氮效率呈下降趋势.

pH值对细菌的生长及其酶的活性有直接的影响，pH值过高或过低都会抑制细菌的生长和脱氮效率. 许多研究发现，HN-AD菌适宜的pH环境为中性或弱碱性^{[16, 17, 18]}. 李卫芬等^[19]研究发现，菌株F1在中性(pH=7)或偏碱(pH=7.5)的条件下，菌体生长较好，脱氮效率较高，在酸性(pH≤6.5)或强碱(pH≥8)条件下，菌体生长滞缓，脱氮效率低下. 黄廷林等^[20]研究发现贫营养菌株A14在pH为7时，反硝化效果最佳. 本研究与现有报道一致,pH范围在6.5～8.0之间时，菌株y3的生长较好，NH₄⁺-N的降解率在91%以上，NO₃^--N的降解率97%以上.

目前人们所认可的异养硝化途径主要有两种，是由Richardson等^[21]提出脱氮假想途径(图 11). 氨氮经氨单加氧酶(AMO)氧化为羟氨后，在羟氨氧化酶(HAO)的催化作用下有两条不同的氧化途径，一种是氧化为NO₂^-、 NO₃^-；另一种是NH₂OH直接转化为N₂O、 N₂. 相比于其他氮源，在以氯化铵为底物时，菌株y3的增长速率最大，且在氨氮降解的过程中几乎检测不到NO₂^--N和NO₃^--N，因此推测该海洋HN-AD菌株y3的异养硝化途径属于第二种.

图 11

Fig. 11

图 11 Richardson 提出的脱氮假想途径 Fig. 11 Hypothetic nitrogen removal pathway proposed by Richardson

在以硝酸钾或亚硝酸钠为唯一氮源时，经过22 h反应后，硝酸盐氮和亚硝酸盐氮分别去除完全，说明菌株y3均能够利用硝酸盐和亚硝酸盐进行代谢，与异样硝化菌P. stutzeri YZN-001^[22]、 P. mendocina TN-05^[23]等一致. 硝酸盐的还原过程中，亚硝酸盐的积累量较少，是因为在硝酸盐还原酶的刺激下，菌株的亚硝酸盐还原酶具有很高的反应活性，使硝酸盐还原产生的亚硝酸盐被迅速的还原，这与肖继波等^[24]的研究结果类似. 以亚硝酸盐为唯一氮源时，硝酸盐的累积量很少，说明亚硝酸盐在亚硝酸盐还原酶的作用下直接还原为氮的气态产物溢出反应系统. 与梁贤等^[25]所研究的HN-AD菌YL具有相似亚硝酸盐降解特性. 当硝酸盐和亚硝酸盐共存时，能促进菌株的生长和脱氮效率. 硝酸盐还原酶的产生刺激了亚硝酸盐还原酶的活性，同时亚硝酸盐还原酶也促进了硝酸盐还原酶的活性，使得菌株y3对硝酸盐和亚硝酸盐的反硝化能力提高.

NH₄Cl和KNO₃为氮源或者NH₄Cl和NaNO₂为氮源时，菌株的好氧反硝化效率高于单一氮源的情况，因为氨氮的存在促进菌体细胞的生长，使得硝酸盐还原酶和亚硝酸盐还原酶的合成加快，活性加强，从而提高了菌株的好氧反硝化速率. 在NH₄Cl和KNO₃为氮源的混合系统内，反应进行到18h时，氨氮几乎降解完全，相比单一氮源系统，异养硝化效率提高. 这是因为异养硝化过程耗能，而好氧反硝化过程产能，硝态氮的反硝化为异养硝化过程提供一定的能量支持，使得菌株的异养硝化进程加快. 该海洋HN-AD菌株具有较好的同步异养硝化好氧反硝化功能，可以实现高盐废水的同步、 高效脱氮除碳.

(1)从胶州湾海底沉积物中筛选出1株海洋性HN-AD菌y3，通过形态学观察、 生理生化鉴定以及16Sr RNA序列测定和系统发育分析，确定该菌属于假单胞菌属(Pseudomonas sp.).

(2)菌株y3的最佳碳源为柠檬酸三钠，最适宜pH为7.0，最佳碳氮比为13.

(3)菌株y3对氨氮、 硝酸盐和亚硝酸盐均能代谢，其中以氨氮为底物时，菌株的增殖速率最大，硝酸盐和亚硝酸盐的存在对菌株的生长均有抑制.

(4)菌株y3的异养硝化和好氧反硝化作用主要发生在对数增长期. 氨氮能促进菌株的好氧反硝化作用，硝酸盐的存在有利于菌株的异养硝化作用的进行，而亚硝酸盐会对菌株的异养硝化产生抑制作用.