高氯酸盐作为强氧化剂、添加剂、媒染剂被应用到军火工业、核反应器、纺织印染等不同的工业领域中^{[1, 2]}．一些研究表明，高氯酸盐干扰人体甲状腺功能，影响人体的正常新陈代谢、扰乱人体荷尔蒙分泌^{[3, 4, 5, 6, 7]}．2005年8月，美国环保署(EPA)公布了高氯酸盐在饮用水中的安全标准为24.5μg·L^-1[8]．在我国，地表水和地下水均检测出较高浓度的高氯酸盐^{[9, 10, 11]}．由此可见治理水体中的高氯酸盐污染刻不容缓．

由于高氯酸盐水溶性高、稳定性高、难降解^{[12, 13]}，因此在一般自然环境条件下可长期稳定存在，其降解过程往往需要几十年甚至更长时间．混凝、沉淀、过滤和消毒等自来水厂的常规处理工艺很难将其有效去除^[14]．目前高氯酸盐的主要去除方法分为物理法、化学法和生物法．物理法的原理是将高氯酸盐进行浓缩，无法彻底地去除高氯酸盐．化学法主要利用一些化学还原剂将高价态的氯离子还原成氯离子，但还原成本高一直是化学法发展的制约因素^{[15, 16]}．生物法主要是在特定的环境下利用微生物新陈代谢功能，将高氯酸盐还原成无毒的氯离子．生物法具有安全性能好、易于管理与操作和产物无毒性等优点^{[14, 17]}．但是降解速率慢一直是生物法降解高氯酸盐的缺点．如何解决降解速率低的问题成为微生物法发展的关键所在．

许多研究者指出，醌类化合物可以加速污染物生物厌氧还原过程^{[18, 19, 20]}．但目前关于醌类化合物加速高氯酸盐的生物还原过程的研究较少．同时，水溶性醌在实际应用中投加量大，不易分离，易流失造成二次污染．故本研究首次开展非水溶性醌调控菌GWF生物还原高氯酸盐过程分析．向生物体系中投加用乙酸纤维素包埋法固定的非水溶性醌类小球，考察其在为微生物还原高氯酸盐过程中的最佳浓度、最佳条件、共存离子对微生物还原高氯酸盐过程的影响以及非水溶性醌乙酸纤维素小球的稳定性研究．

NaClO₄·H₂O,NaAc,MgSO₄·7H₂O,CaCl₂·2H₂O,K₂HPO₄·2H₂O,KH₂PO₄，NH₄Cl等均为分析纯(AR)，且纯度≥99.5%. 5种非水溶性醌类化合物为蒽醌、1-氯蒽醌、1,5-二氯蒽醌、1,8-二氯蒽醌和1,4,5,8-四氯蒽醌，均购自于上海试四赫维化工有限公司．

培养基组成：NH₄Cl 0.67 g·L^-1，NaAc 2.4 g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.12 g·L^-1，K₂HPO₄·2H₂O 0.10 g·L^-1，KH₂PO₄ 0.06 g·L^-1，微量元素1~2 mL·L^-1，pH 7.0±0.2.

微量元素组成：MnCl₂·4H₂O 0.002 0 g·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 0.004 g·L^-1，CuSO₄ 0.001 0 g·L^-1，Na₂MoO₄ 0.000 2 g·L^-1．

异养菌GWF(KM062029)是实验室分离纯化的高效高氯酸盐还原菌．将菌GWF按5%的体积比接种到灭活的培养基中，35℃、140 r·min^-1振荡培养10 h．待菌液D_{600 nm}=0.3±0.02时从恒温摇床中取出．利用富集菌液来研究不同种类、不同浓度的非水溶性醌条件下菌GWF还原高氯酸盐的能力．在300 mL血清瓶中依次加入富集菌液、不同种类、不同浓度非水溶性醌类乙酸纤维素小球，高氯酸盐的初始浓度固定在100 mg·L^-1．瓶口用丁基橡胶瓶塞和铝膜密封后转移至生化培养箱中静置培养，确保厌氧条件，培养温度为35℃．每12 h进行取样测定．所有实验均有3个平行样．

实验所用的非水溶性醌采用乙酸纤维素包埋法进行固定^[21]．

pH值：使用PHS225C型数字酸度计.

高氯酸盐浓度：氯酸根离子浓度采用离子色谱法进行测定．用无菌注射器取10 mL液体样品10 000 r·min^-1离心10 min，取上清液．依次用SC18-SPE柱和0.22 μm的尼龙滤膜二次过滤上清液．高氯酸根离子浓度采用戴安ICS-1100型离子色谱仪(Dionex,Sunnyvale,CA)进行分析．离子色谱柱为PAC AS 20，离子保护柱为PAC AG 20．淋洗液为40 mmol·L^-1的KOH，检测限为0.2 μg·L^-1．

非水溶性醌对菌GWF加速高氯酸盐生物还原的影响如图 1所示．蒽醌、1-氯蒽醌、1,5-二氯蒽醌、1,8-二氯蒽醌和1,4,5,8-四氯蒽醌这5种非水溶性醌的投加量均为0.036 mmol·L^-1．由于实验中所用非水溶性醌用乙酸纤维素包埋法进行负载，这种球状颗粒可能会对高氯酸盐有一定的吸附作用，从而影响实验结果的分析．为了排除这一影响，在相同实验条件下，增加了两组对照体系，分别是不加小球的对照体系和添加空白乙酸纤维素小球的空白小球体系．实验结果与对照体系和中空白小球体系相比，5种非水溶性醌对菌GWF生物还原高氯酸盐均有加速作用，其加速顺序为1,5-二氯蒽醌>1,4,5,8-四氯蒽醌>1,8-二氯蒽醌>蒽醌>1-氯蒽醌且．其中1,5-二氯蒽醌加速效果最明显，在培养48 h后，高氯酸盐去除率达100%．由于纤维素小球内部的多孔结构使其具有一定吸附性，但实验结果表明其吸附量小于2%，故醋酸纤维素小球的吸附作用可忽略．因此，本实验中最佳非水溶性醌为1,5-二氯蒽醌，并在后续实验中对其展开系统研究．

图 1

Fig. 1

图 1 非水溶性醌对高氯酸盐生物还原的影响 Fig. 1 Effect of water-insoluble quinone on perchlorate biological reduction process

Cervantes^[22]研究表明，醌类化合物是能加速初级电子供体的电子向最终电子受体传递的化合物，可以使降解速率提高一到几个数量级．其机制为：①在生物厌氧还原过程中，需要许多辅酶参加，而醌类化合物具有辅酶所具有的结构特征，在还原过程中起着类似辅酶的作用； ②醌类化合物在酶的作用下会形成活性高且有一定稳定性的中间体，这些活性中间体能从底物中获得氢质子或电子传递给最终电子受体，从而使其还原．故1,5二氯蒽醌加速的可能机制可能为二者的结合．Xi等^[23]研究表明醌类化合物因不仅与反硝化过程中重要的辅酶甲基萘醌有着相似的结构，加速反硝化的生物还原过程，而且醌类化合物也可以作为电子载体大大缩短反硝化时间．

为了考察不同浓度的1,5-二氯蒽醌对菌GWF对高氯酸盐还原过程的影响，本组实验设置6种不同浓度的1,5-二氯蒽醌，分别为0.012、0.024、0.036、0.048和0.060 mmol·L^-1，以不加小球和添加空白乙酸纤维素小球作为对照体系，考察1,5-二氯蒽醌浓度对菌GWF生物还原高氯酸盐的影响．实验结果如图 2所示．不添加1,5-二氯蒽醌和只添加空白乙酸纤维素小球时，高氯酸盐的还原效果并不明显．5种醌浓度的反应体系对高氯酸盐的降解均有一定的加速作用，其加速的原因可能为1,5-二氯蒽醌具有的醌基官能团，醌基官能团具有碳氧双键，活性极为活泼，易发生氧化还原反应．培养48 h后，高氯酸盐的去除率分别为6.2%(0.012 mmol·L^-1 1,5-二氯蒽醌)、15.2%(0.024 mmol·L^-1 1,5-二氯蒽醌)、99.1%(0.036 mmol·L^-1 1,5-二氯蒽醌)、69.4%(0.048 mmol·L^-1 1,5-二氯蒽醌)和43.1%(0.060 mmol·L^-1 1,5-二氯蒽醌)．结果表明，在一定范围(0.012~0.036 mmol·L^-1)内增加1,5-二氯蒽醌的浓度，能加速菌GWF生物还原高氯酸盐．同时，由实验可以得出速率常数K1[mg·(L·h)^-1]随1,5-二氯蒽醌浓度的增加而增加，通过线性拟合可以得出高氯酸盐的生物还原速率与1,5-二氯蒽醌浓度呈正相关：

图 2

Fig. 2

图 2 不同浓度的1,5-二氯蒽醌对高氯酸盐生物还原的影响 Fig. 2 Effect of different concentrations of 1,5-dichloroanthraquinone on the perchlorate biological reduction process

当1,5-二氯蒽醌浓度过高时(大于0.036 mmol·L^-1)时，会抑制菌GWF生物还原高氯酸盐．由实验可以得出速率常数K2随1,5-二氯蒽醌浓度的增加而降低，通过线性拟合可以得出高氯酸盐的生物还原速率与1,5-二氯蒽醌浓度呈负相关：

故而，1,5-二氯蒽醌投加浓度为0.036 mmol·L^-1时对高氯酸盐降解的加速作用最明显并以此浓度展开后续的研究．

微生物的生长繁殖都有一个适宜的温度范围，温度过高时会使微生物体内的酶高温失活，温度过低时微生物会低温休眠^[24]．本组实验分别考察了在20、25、30、35和40℃这5种温度条件下，1,5-二氯蒽醌加速菌GWF生物还原高氯酸，35℃条件下添加空白乙酸纤维素小球作为对照实验．实验结果如图 3所示．在反应第48 h时，20、25、30、35和40℃下高氯酸盐降解率分别为3.7%、79.3%、94.8%、99.8%、100%和95.5%．菌GWF在35℃条件下，高氯酸盐在48 h内就已经降解至检测限之下．在20~35℃范围内，高氯酸盐生物还原速率呈逐步上升趋势．在40℃时，高氯酸盐生物还原速率有所下降．这可能由于高氯酸盐还原酶在低温条件下活性较低，进而抑制了菌GWF的新陈代谢； 温度升高，高氯酸盐还原酶的活性增强，高氯酸盐还原速率也提升； 当温度升高到一定水平时(高于35℃)，反而不适宜菌GWF还原高氯酸盐．所以本实验确定1,5-二氯蒽醌加速菌GWF生物还原氯酸盐的最佳温度是35℃．

图 3

Fig. 3

图 3 不同温度对高氯酸盐生物还原的影响 Fig. 3 Effect of temperature on the perchlorate biological reduction process

微生物反应绝大多数是酶促反应，而酶的活性受所处pH值影响，不同的酶最适的pH值范围也不同．Coates等^[25]和Wang等^[26]指出高氯酸盐还原菌可以在pH范围5~9的环境中生长，而最佳生长pH范围为6.8~7.5.因此，本实验在初始pH值分别为6、6.5、7、7.5、8、8.5、9这7个梯度下考察了最适浓度的1,5-二氯蒽醌加速菌GWF降解高氯酸盐催化效果．实验结果如图 4所示．与空白菌液相比，在不同的pH值范围内，1,5-二氯蒽醌对菌GWF降解高氯酸盐均有加速作用，在pH值为7.5时，加速作用最为明显，其次为pH值为7.0时； 当pH值小于6.5或者pH大于9时加速作用明显减弱．分析这一实验结果的主要原因，一为强酸强碱条件下，微生物的生长受到了抑制，同时生物活性也会相应降低； 二为极端条件下，反应体系的传质也受到制约，尤其是醌类化合物起到的调控作用会受到大幅度影响，从而导致菌GWF生物还原高氯酸盐速率下降．

图 4

Fig. 4

图 4 pH对1,5-二氯蒽醌加速高氯酸盐生物还原的影响 Fig. 4 Effect of pH on the acceleration of perchlorate reduction process by 1,5-dichloroanthraquinone

在含高氯酸盐的烟花、电镀、电解抛光、军队弹药和其他工业废水中一般都会存在硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐等共存阴离子^{[27, 28, 29]}．因此，研究考察硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐对1,5-二氯蒽醌加速菌GWF生物还原高氯酸盐的影响．为其工业应用做出理论性指导．

硝酸盐对最适浓度的1,5-二氯蒽醌对菌GWF高氯酸盐生物还原的催化加速作用的影响实验共有6个浓度梯度，其分别为：0、5、10、20、30和40 mg·L^-1.实验结果如图 5所示．硝酸盐可以促进对1,5-二氯蒽醌加速菌GWF高氯酸盐生物还原过程，且加速程度与硝酸盐浓度无关，这与Xu等^[30]做的实验结果相类似．在反应60 h后，高氯酸盐的生物还原率为90%左右，而此时投加硝酸盐的任一体系中高氯酸盐的生物还原率为100%． 其中，硝酸盐的浓度为20 mg·L^-1 的体系中，高氯酸盐的生物还原速度最快． 由此，硝酸盐的投加促进了1,5-二氯蒽醌对菌GWF降解高氯酸盐的催化加速作用．

图 5

Fig. 5

图 5 硝酸盐对1,5-二氯蒽醌加速菌GWF高氯酸盐生物还原过程的影响 Fig. 5 Effect of nitrate on the 1,5-dichloroanthraquinone-accelerated perchlorate reduction process by strain GWF

设置6种不同浓度的磷酸盐，分别为0、5、10、20、30和40 mg·L^-1，考察磷酸盐浓度对1,5-二氯蒽醌加速菌GWF高氯酸盐生物还原过程的影响．实验结果如图 6所示．在5~40 mg·L^-1的浓度范围内，磷酸盐对1,5-二氯蒽醌加速菌GWF高氯酸盐生物还原有微弱促进作用．

图 6

Fig. 6

图 6 磷酸盐对1,5-二氯蒽醌加速菌GWF高氯酸盐生物还原过程的影响 Fig. 6 Effect of phosphate on the 1,5-dichloroanthraquinone-accelerated perchlorate reduction process by strain GWF

为了考察硫酸盐对1,5-二氯蒽醌加速菌GWF高氯酸盐生物还原过程的影响，分别投加0、5、10、20、30和40 mg·L^-1的硫酸盐，测试高氯酸盐还原效果．实验结果如图 7所示，硫酸盐对1,5-二氯蒽醌加速菌GWF高氯酸盐生物还原过程有一定的促进作用，且加速程度与硫酸盐浓度无关．

图 7

Fig. 7

图 7 硫酸盐对1,5-二氯蒽醌加速菌GWF高氯酸盐生物还原过程的影响 Fig. 7 Effect of sulfate on the 1,5-dichloroanthraquinone-accelerated perchlorate reduction process by strain GWF

本组实验通过在1,5-二氯蒽醌加速菌GWF生物还原高氯酸盐过程中添加不同浓度的硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐，发现硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐均有一定的促进作用，分析其促进的可能原因是，氮、磷、硫可以作为菌GWF的营养物质对其活性起到促进作用．

由于固定化负载方法一般会有机械强度低，负载物易脱落等问题，故本实验通过对比4次连续重复利用同一批次1,5-二氯蒽醌的醋酸纤维素小球体系与空白小球体系相比，来判断固定后的蒽醌的生物催化稳定性．实验结果如图 8所示．投加1,5-二氯蒽醌的醋酸纤维素小球体系与空白小球体系相比，4次重复利用高氯酸盐生物还原速率仍是空白乙酸纤维素小球2倍以上．由此可知，非水性醌加速高氯酸盐生物还原是一个操作性好、整体效率高且具有实际应用价值的高氯酸盐污染生物处理方法．

图 8

Fig. 8

图 8 醋酸纤维素小球的重复利用 Fig. 8 Recycling of cellulose acetate balls

(1)5种非水溶性醌对菌GWF降解高氯酸盐均有加速作用，其加速顺序为1,5-二氯蒽醌>1,4,5,8-四氯蒽醌≥1,8-二氯蒽醌>蒽醌>1-氯蒽醌，1,5-二氯蒽醌加速效果最明显.

(2)当1,5-二氯蒽醌的浓度为0.012~0.036 mmol·L^-1时，高氯酸盐的生物还原速率与1,5-二氯蒽醌浓度呈正相关； 当1,5-二氯蒽醌浓度大于0.036 mmol·L^-1时，高氯酸盐的生物还原速率与1,5-二氯蒽醌浓度呈负相关.

(3)硝酸盐、磷酸盐、硫酸盐对高氯酸盐生物还原都有一定的促进作用.

(4)1,5-二氯蒽醌乙酸纤维素小球在循环使用后仍能保持较高的高氯酸盐生物催化还原性能．