水生生态系统中，溶解有机氮(DON)是营养物质循环中的重要环节^{[1, 2]}，不仅可以与溶解无机氮(DIN)之间相互转化，而且是一类潜在的可被生物利用的重要营养源. 其中,一些小分子量的DON如尿素、 溶解游离态氨基酸(DFAA)、 核酸等已被证明是可以被浮游植物直接吸收利用^{[3, 4, 5, 6]}，对浮游植物生长、 种群演替及初级生产力的影响不容忽视. 其中，总溶解态氨基酸(TDAA)是构成溶解有机质(DOM)的重要组成部分，其构成和丰度可用来指示DOM生物可利用性的潜力^{[7, 8]}.

胶州湾位于黄海之滨，是中国北方海区典型的半封闭海湾. 自20世纪70年代末以来，随着青岛市社会经济的高速发展，陆源污染物排放总量不断增加，富营养化已成为胶州湾海域最严重的环境问题之一，氮污染是导致胶州湾海域富营养化的关键因子^[9]. 目前，关于胶州湾氮污染物的来源、 构成和分布研究侧重于溶解无机氮(DIN)，而忽视了溶解有机氮(DON)对胶州湾氮污染的贡献.

为减少陆源排污，环胶州湾已经建成和运行多个公共污水处理厂，污水处理量达到114万t·d^-1，占入胶州湾污水总量的90%^[10]. 在2008年后，为减少氮污染物的排放，环胶州湾各污水处理厂经过升级改造，相继增加了硝化/反硝化系统； 尽管这些脱氮工艺可能对DIN特别是氨氮(NH₄⁺-N)的去除十分有效，但对其他形态氮包括硝态氮(NO₃^--N)和DON的去除率往往较低^{[11, 12]}. 研究表明，经污水处理厂处理后的废水进入近海水体后，一方面，其中DON可通过微生物降解作用和光化学作用转化为小分子量的DON和DIN； 另一方面，通过盐度调节作用，将原吸附于腐殖质上而难以被生物利用的氨氮以自由态释放，这些过程都增大了氮的生物可利用性，从而加重近海氮污染负荷和富营养化程度^[13]. 然而，目前尚未对环胶州湾污水处理厂排污口污水中DON的构成和生物可利用性进行系统研究.

本研究通过在不同季节对直排入胶州湾的4个公共污水处理厂排放口不同形态氮的调查，比较分析排入胶州湾不同公共污水处理厂TDN的构成，并以TDAA的构成及其在DOM中的丰度作为指标，评价所排放DON的生物可利用性.

胶州湾位于山东半岛南岸，水域面积约320km²，湾口狭小，最窄处仅为3.1 km，水深较浅，平均水深仅8.8 m，最大水深为64 m. 青岛市主城区环胶州湾而建，胶州湾不仅是青岛市社会经济发展的重要承载体，也是青岛市农业、 工业和生活污水的主要承纳体，约占青岛市面积的65%的陆域所产生的污染物通过河流和排污口进入胶州湾^[9]. 20世纪70年代末以来，伴随着青岛市经济持续高速发展，人口不断增加，陆源污染物排放数量持续增多，导致胶州湾水质不断恶化，引发了赤潮(绿潮)灾害频发等一系列生态环境问题^{[9, 14]}.

目前，所调查区域的直排入胶州湾污水处理厂都位于胶州湾东部人口密集的建成区，各污水处理厂的集污范围、 处理量和处理工艺等见图 1和表 1.

图 1

Fig. 1

图 1 直排胶州湾污水处理厂集污范围和采样站位示意 Fig. 1 Region of drainage and sampling stations at STPs around JZB

表 1(Table 1)

表 1 直排胶州湾公共污水处理厂集污区范围和处理工艺简介 Table 1 Region of drainage and introduction of treatment technology at STPs around the JZB 污水处理厂 简称 处理工艺1) 设计处理量/万t 集污区面积/km2 集污区污染源构成 人口 GDP/万元 娄山河污水处理厂 LSHF A2/O工艺 10 31.02 113 415 1 151 621.8 李村河污水处理厂 LCHF 改良A2/O工艺 15 154.08 447 933 2 936 414.4 海泊河污水处理厂 HBHF AB法处理工艺 8 30.52 526 050 1 892 220.3 团岛污水处理厂 TDF A2/O工艺 10 10.70 354 618 1 796 643.4 1)“A2/O”代表厌氧-缺氧-好氧法，是传统活性污泥工艺、 生物硝化及反硝化工艺和生物除磷工艺的综合”； “A/B”代表吸附-生物降解工艺

表 1 直排胶州湾公共污水处理厂集污区范围和处理工艺简介 Table 1 Region of drainage and introduction of treatment technology at STPs around the JZB

分别于2012年7月、 2012年11月、 2013年3月及2013年5月在直排胶州湾4个污水处理厂排放口进行取样分析，采样站位如图 1所示. 用有机玻璃采水器采集排放口水样5 L，0~4℃冷藏保存并在4 h内转移到实验室用全玻璃滤器过滤，滤膜孔径为0.7 μm(GF/F玻璃纤维滤膜,英国Whatman公司)，并在使用前450℃下灼烧4 h； 将所得滤液转入洁净的玻璃瓶中，-20℃保存，用于总溶解态氮(TDN)、 硝态氮(NO₃^--N)、 亚硝态氮(NO₂^--N)、 铵态氮(NH₄⁺-N)、 溶解有机碳(DOC)和总溶解态氨基酸(TDAA)的测定.

NO₃^--N、 NH₄⁺-N及NO₂^--N分别通过镉铜还原法^[15]、 次溴酸钠法^[15]和重氮-偶氮法^[16]测定； DOC、 TDN根据高温催化氧化(HTCO)方法进行测定^[17]，所用仪器为TOC-V_CPH分析仪(Shimadzu Corp.,Tokyo,Japan)，以邻苯二甲酸氢钾和硝酸钾分别作为DOC和TDN测定的标准品. 每个样品平行测定6次，相对偏差小于0.5%. 溶解有机氮(DON)为TDN与溶解无机氮(DIN)的差值，其中DIN为NH₄⁺-N、 NO₂^--N和NO₃^--N三者之和.

氨基酸通过柱前邻苯二甲醛衍生后高效液相色谱法进行分离测定^[18]，所用仪器为e2695型高效液相色谱仪(WatersAlliance,USA)并配置以荧光检测器和Agilent分离柱(ZORBAX EclipseAAA,4.6×150 mm,5 μm). 所用标准品为14种氨基酸混标(Fulka,USA)，共分离检测14种氨基酸，包括天冬氨酸(Asp)、 谷氨酸(Glu)、 丝氨酸(Ser)、 组氨酸(His)、 甘氨酸(Gly)、 苏氨酸(Thr)、 精氨酸(Arg)、 丙氨酸(Ala)、 酪氨酸(Tyr)、 缬氨酸(Val)、 甲硫氨酸(Met)、 苯丙氨酸(Phe)、 异亮氨酸(Ile)、 亮氨酸(Leu)，相对偏差在3%～5%.

利用Origin 8.0软件绘制相关参数柱状分布； 数据统计分析是应用SPSS 16.0(IBM Statistical Package for the Social Sciences Inc.)软件进行，相关性分析是利用皮尔森相关系数法进行相关性分析，若P<0.001(双边检验)，说明参量之间具有明显相关性.

直排胶州湾的各污水处理厂排放口不同季节TDN含量变化如图 2所示. 可以看出，各污水处理厂不同季节排放口TDN浓度和构成有所不同，其中，李村河污水处理厂和海泊河污水处理厂季节差异显著，而娄山河污水处理厂和团岛污水处理厂差异相对较小，但基本上呈现3月和11月高、 5月和7月低的变化特征. 对于海泊河污水处理厂，其排放口3月TDN最高，达3 580.65 μmol·L^-1，其次为11月，达1 262.50 μmol·L^-1； 而5月和7月相差不大，分别为526.73 μmol·L^-1和624.45 μmol·L^-1； 相应地，TDN的构成也有显著差异，3月以DON为主，摩尔分数高达88.75%，DIN摩尔分数仅为12%，DIN中以还原态的NH₄⁺-N和NO₂^--N为主，而其余3个季节TDN中以DIN为主，摩尔分数在65.4%~97.9%，DIN中以NO₃^--N为主，占比都在69%以上. 3月海泊河污水处理厂TDN含量显著高于其他季节且构成以具有还原态氮(包括DON、 NH₄⁺-N和NO₂^--N)为主，表明该污水处理厂的生化处理工艺对氮的生物氧化作用效果不佳. 同样，李村河污水处理厂排放口TDN浓度和构成也有较大差异. 实际上，调查期间这两个污水处理厂正处于扩容和改造阶段，导致其污水负荷和处理工艺尚不稳定. 而团岛污水处理厂和娄山河污水处理厂处理工艺较为稳定，其排放口不同季节TDN差异不大.

图 2

Fig. 2

图 2 直排胶州湾各污水处理厂不同季节TDN的浓度和构成 Fig. 2 Concentration and composition of TDN at STPs around JZB in different seasons

另外，调查结果表明，海泊河污水处理厂排放口不同季节氨氮含量明显高于其他污水处理厂，这可能是由于该污水处理厂采用AB法即两段活性污泥法工艺，对生活污水中氨氮处理排放执行《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB 18918-2002)中一级B指标，即氨氮≤8mg·L^-1的要求，而其它3个污水处理厂均采用改进的A²/O工艺，可以满足该标准中一级A指标即氨氮≤5mg·L^-1的要求^{[19, 20, 21, 22, 23]}.

DOC/DON可以作为指征DOM生物可利用性的一个重要参数. DOC/DON 值低，表明有机质矿化程度低，生物可利用高，反之则表明有机质矿化程度高，生物可利用低^{[24, 25]}. Pagilla等^[26]研究结果表明，DOC/DON≤11时，DOM具有较高的生物可利用性潜力，对受纳水体的氮污染具有显著影响. 胶州湾各污水处理厂不同季节水体中DOC/DON变化差异较大，分布在0.2~26.2 mol·mol^-1之间，年平均值为(5.05±6.39) mol·mol^-1(图 3)，不同季节DOC/DON的平均值分别为(9.78±11.92) mol·mol^-1 (5月)、 (6.90±2.52) mol·mol^-1(7月)、 (1.77±0.93) mol·mol^-1(11月)和(1.76±2.32) mol·mol^-1 (3月). 整体而言，11月和3月有机质的生物可利用性较5月和7月高，可能是由于这两个季节温度较低，未达到污水处理池中硝化/反硝化过程的适宜温度(30℃左右)^[27].

图 3

Fig. 3

图 3 入胶州湾污水处理厂排放口不同季节DOC/DON值 Fig. 3 Values of DOC/DON in the discharge outlets of STPs around JZB in different seasons

对于环胶州湾各污水处理厂的DOC/DON，只有5月海泊河污水处理厂和团岛污水处理厂出口大于11 mol·mol^-1，而其余季节各污水处理厂出口都小于11 mol·mol^-1，表明有机质具有一定的可矿化和生物可利用性潜力； 特别是各污水处理厂排放口在3月和11月时都低于5 mol·mol^-1，与美国伊利诺斯州污水处理厂和波兰北部污水处理厂(1.1~3.2 mol·mol^-1)排污口中DOC/DON值接近^{[26, 28]}，表明这些污水处理厂的有机质具有较高的生物可利用性潜力.

(1) 基于氨基酸在有机质中丰度指示DON生物可利用性潜力

作为溶解有机质(DOM)中易于生物降解的组分，TDAA在DOM中的占比可作为DOM生物可利用性潜力的评价指标，其值越高，表明DOM的生物可利用性潜力越大^{[7, 8]}. 由于DOC的测定误差小于DON,本研究以TDAA中所含碳在DOC中的摩尔分数即x(TDAA/DOC)来评价入胶州湾各污水处理厂排放口不同季节DOM的生物可利用性. 结果表明(图 4)，直排胶州湾各污水处理厂排放口不同季节TDAA/DOC值差异较大，分布在0.33%~3.02%之间，平均值为1.54%±0.78%，这与长江水体(1.79%~2.60%)^[29]和美国Atchafalaya河水(0.94%~2.95%)相近，而高于Mississippi河(0.85%~1.40%)^[30].

图 4

Fig. 4

TDAA/DOC表示TDAA中所含碳在DOC中的摩尔分数图 4 直排胶州湾各污水处理厂排放口不同季节氨基酸中所含碳在DOC中占比 Fig. 4 DOC normalized yields of amino acids in the discharge outlets of STPs around JZB in different seasons

Davis等^[31]通过生物降解现场培养实验，分析了DOM降解前后TDAA的丰度，提出TDAA/DOC值为1.60%和1.10%时可分别作为有机质易降解DOM (Labile DOM,L-DOM)和半易降解DOM(Semi-labile DOM,S-DOM)的评价标准，以水体中TDAA/DOC值与标准值相减，二者差值再除以TDAA/DOC的占比可以大体估算S-DOM和L-DOM的比例^{[30, 31]}. 据此方法估算出直排入胶州湾各污水处理厂排污口水体不同季节L-DOM有较大差异，其中，3月海泊河污水处理厂、 5月团岛污水处理厂以及7月娄山河污水处理厂排放口L-DOM较高，摩尔分数分别达到46.95%、 46.71%和32.85%； 5月李村河污水处理厂和海泊河污水处理厂、 11月娄山河污水处理厂L-DOM较低，摩尔分数分别达到21.91%、 16.55%和12.60%，其余季节各污水处理厂排放口水体无L-DOM. 而以S-DOM标准衡量，则直排入胶州湾各污水处理厂排污口水体在不同季节具有S-DOM，3月、 5月、 7月和11月的平均摩尔分数分别达到31.11%、 46.97%、 20.50%和0.44%. 这与应用DOC/DON指示入胶州湾各污水处理厂排放口DOM具有一定生物可利用性的结果基本一致. 需要指出的是，DOM生物可利用性与DOM的来源和受纳水体密切相关. 由于入胶州湾各污水处理厂DOM来源与河流有较大差异，且胶州湾海域微生物构成等与密西西比河流入的墨西哥湾有所不同，具有高生物可利用性的TDAA/DOC标准值的确定最好通过在胶州湾现场进行的生物降解实验来确定.

(2) 氨基酸构成

尽管直排胶州湾各污水处理厂排放口污水中氨基酸酸绝对丰度有所差异，但所检测出的12种氨基酸在TDAA中摩尔分数排序基本一致，其中，Gly的含量最高，达到27.76%以上； 其次为Leu，占比在14.61%左右，再次为Asp、 Ala、 Glu、 Thr、 Ser和Val，摩尔分数在5.25%~10.86%之间，而His、 Arg、 Ile和Tyr含量较低，摩尔分数在3.50%以下(图 5)，这与黄满红等^[32]应用氨基酸分析仪所测定的生活污水中的氨基酸组成由所不同，该研究表明生活污水中Glu、 Asp、 Ala、 Val和Leu含量较高. 污水中氨基酸构成不同，这一方面可能与污水的来源不同有关，另一方面，也与污水处理厂排放口污水经生化降解过程有关，在此过程中，一些易降解的氨基酸组分相对含量降低，而相对难降解的氨基酸组分则被富集，导致氨基酸相对丰度发生变化.

图 5

Fig. 5

AAi/TDAA表示每种氨基酸(Asp、 Gly、 Ser、 His等12种)在TDAA中的摩尔百分比； Asp：天冬氨酸； Gly：谷氨酸； Ser：丝氨酸； His：组氨酸； Arg：精氨酸； Gly：甘氨酸； Thr：苏氨酸； Ala：丙氨酸； Tyr：酪氨酸； Val：缬氨酸； Ile：异亮氨酸； Leu：亮氨酸图 5 直排胶州湾各污水处理厂排放口不同季节氨基酸的构成 Fig. 5 Composition of amino acids in the discharge outlets of STPs around JZB in different seasons

水体中氨基酸的构成和相对丰度与不同种类氨基酸的生物可利用性有关，因此，氨基酸的组成可以粗略指示有机质的降解程度^{[33, 34]}. 环胶州湾各污水处理厂排放口中Gly含量最高，这可能是由于微生物细胞壁中富含Gly^[35]，相对于细胞质中的氨基酸，Gly较难被生物降解，因此，随着DOM生物降解程度的加重，Gly相对丰度会进一步增大^{[34, 36, 37]}. 比如，海泊河污水处理厂3月TDN较高(图 2)，DOC/DON值较低(图 3)，Gly含量较低，表明其DOM未经过深度生物降解； 而7月该污水处理厂TDN含量较3月显著降低，DOC/DON值和Gly含量则较3月显著増高，表明7月该排放口污水中DOM发生明显的生物降解. 另外，作为TDAA的重要组成部分，组氨酸(His)富含于微生物细胞质中^[35]，较其他种类氨基酸易于降解，因而His含量随DOM生物降解加剧和生物可利用性减小而减小. 进一步发现表明His/TDAA与TDAA/DOC呈正相关(n=16，R²=0.586 1，P<0.01,图 6)，表明His/TDAA与TDAA/DOC一样，可作为DOM生物可利用性潜力的指标. 这与Zhang等^[38]应用氨基酸构成和丰度对长江口及其邻近海域DOM生物可利用性的研究结果基本一致.

图 6

Fig. 6

图 6 直排胶州湾各污水处理厂排放口TDAA/DOC与His/TDAA的相关性 Fig. 6 Correlation between TDAA/DOC and His/TDAA in the discharge outlets of STPs around JZB in different seasons

(1)直排胶州湾污水处理厂排放口水体中TDN浓度及其构成因季节和污水处理厂工艺不同而具有显著差异，TDN的变化范围为413.10~3 580.65 μmol·L^-1，并基本呈现3月和11月月高、 5月和7月低的季节变化特征，其中，DON占比的变化范围在2.14%~88.75%之间.

(2)直排胶州湾污水处理厂排放口5月、 7月、 11月和3月的DOC/DON的平均值分别为(9.78±11.92)、 (6.90±2.52)、 (1.77±0.93)和(1.76±2.32) mol·mol^-1，DOC/DON值较低，表明DOM具有较高的生物可利用性，可能会加重胶州湾海域氮污染.

(3)直排胶州湾各污水处理厂排放口不同季节TDAA/DOC值差异较大，分布在0.33%~3.02%之间，具有生物可利用DOM的摩尔分数则在0.44%~46.97%之间； 其中，TDAA中His/TDAA可作为评价DOM生物可利用性潜力的指标.