砷在自然水体中主要以As³⁺和As⁵⁺两种形式存在，其中As³⁺毒性比As⁵⁺毒性高出60倍. 砷在人体新陈代谢过程中的迁移十分缓慢，长期饮用受砷污染的地下水会造成皮肤癌、 肺癌等疾病^{[1, 2]}. 我国云南、 山西、 新疆、 内蒙等地区的地下水均受到不同程度的砷污染^[3]，作为主要饮用水源，某些地区地下水砷质量浓度高达1 530 μg ·L^{-1 [4]}，远高于《生活饮用水卫生标准》(GB 5749-2006)中规定的砷浓度. 在常规饮用水处理系统中，混凝/絮凝工艺^[5]、 滤池吸附工艺^{[6, 7]}均可以在一定程度上降低砷质量浓度，而与混凝/絮凝工艺相比，滤池吸附工艺兼具有净化效率高、 处理成本低廉等优点. 生物滤池主要利用进水中的锰氧化菌，将Mn²⁺氧化为锰的高价氧化物^[8]，生成的锰氧化物具有高效的氧化性和一定的吸附性^{[9, 10]}，氧化吸附水体中的As(As³⁺、 As⁵⁺)，在氧化吸附的过程中形成包括锰氧化物、 砷以及细菌在内的多重络合物附着在滤料表面，从而达到通过价态转换降低As的毒性，通过吸附作用去除水体中的As的效果.

通过前期对生物滤池微生物群落宏基因组的分析，发现滤池表面生物膜中含有丰度较高的砷还原酶^[11]，这表明滤池中存在一定的砷还原菌. 而当滤池中Mn²⁺、 As(As³⁺、 As⁵⁺)和两种细菌同时存在时，针对As的氧化还原反应会同时发生，竞争对砷形态的影响：即锰氧化菌作用产生的锰氧化物，将As³⁺氧化为As⁵⁺，而砷还原菌将As⁵⁺还原成As³⁺； 同时，两种细菌还会竞争空间、 营养物质. 以往很多研究发现^{[12, 13]}，经过生物滤池处理后的水含砷量明显降低，且残余的砷主要以As⁵⁺的形式存在. 据此提出如下假设：生物氧化锰导致的砷氧化相比微生物的砷还原在滤池表面占主导作用，即含As(As³⁺、 As⁵⁺)的地下水经滤池作用后出水以As⁵⁺为主. 为验证此假设，以1株锰氧化模式菌和1株砷还原模式菌为研究对象，结合理化分析及分子检测，探究两菌株生长过程的竞争以及对砷的氧化/还原竞争的关系，以期为生物滤池转化去除地下水中Mn²⁺、 As提供理论支持.

菌株培养采用PYG培养基(peptoneyeast extract-glucose):葡萄糖0.25 g，酵母膏0.25 g，蛋白胨0.25 g，MgSO₄ ·7H₂O 0.5 g，CaCl₂ ·2H₂O 60 mg,蒸馏水1 L，用HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N′-2-ethanesulfonic acid，4-羟乙基哌嗪乙磺酸)调节pH为7.6±0.2，高温灭菌.

实验采用的砷还原菌为短杆菌LSJ-9(Brevibacterium sp. LSJ-9)，该菌株为革兰氏阳性专性好氧无芽孢菌，呈短杆状，由湖南受砷污染严重的土壤分离纯化得到； 锰氧化菌为假单胞菌QJX-1(Pseudomonas sp. QJX-1)^[14]，该菌株为革兰氏阴性好氧无芽胞菌，呈杆状或略弯，细胞两端圆钝，由湖南湘潭锰矿区域土壤分离纯化得到.

取保存于-80℃冰箱中的Pseudomonas sp.QJX-1和Brevibacterium sp. LSJ-9菌液3 mL，分别加至装有27 mL新鲜PYG培养基的100 mL锥形瓶中 ，30℃，170 r ·min^-1恒温振荡培养24 h，取3 mL培养后的菌液，重复上述操作，完成菌株的活化.

取上述活化后的菌液各20 mL，同时加至装有160 mL新鲜PYG培养基的500 mL锥形瓶中，将HEPES缓冲液、 Mn²⁺母液和As(As³⁺、 As⁵⁺)母液一起用高温灭菌后的0.22 μm滤膜过滤，添加到培养基中，使得Mn²⁺终浓度为5mg ·L^-1，As(As³⁺、 As⁵⁺)终浓度为0.75 mg ·L^-1，30℃，170 r ·min^-1恒温振荡培养72 h. 培养过程中间隔特定时间取样，样品经0.22 μm滤膜过滤，通过电感耦合等离子体原子发射光谱法 (700 series ICP-OES)测定Mn²⁺的浓度，通过原子荧光光谱法测定As³⁺和总As浓度. 相同条件下，设置Pseudomonas sp.QJX-1菌株单独氧化Mn²⁺和Brevibacterium sp. LSJ-9菌株单独还原As⁵⁺作为对照实验，上述实验均设置3组平行.

有研究表明，cumA在假单胞菌锰氧化过程中是必不可少的基因，而arsC是微生物细胞质砷还原的重要基因. 因此采用PCR及Real-time PCR分析两菌株在同一环境下生长竞争及功能表达竞争的关系.

(1)RNA提取与反转录 根据实验分析，9 h培养基中细菌数最多，27 h两菌株处于竞争关系，51 h达到“稳定”. 因此选取9、 27、 51 h这3个时间点取样1.8 mL，用Trizol法(Tiangen，China)提取样品中菌体的总RNA，用FastQuant RT Kit(With gDNase)(Tiangen，China)将总RNA反转录为cDNA.

(2) PCR扩增 以上述cDNA为模板，分别对两菌株的功能基因——多铜氧化酶cumA^[15]和砷还原酶arsC^[16]进行PCR扩增. 根据Brevibacterium sp. LSJ-9和Pseudomonas sp. QJX-1纯菌株的cDNA序列，设计并合成两菌株16S rRNA相对特异性的引物，两对引物分别以纯菌株的cDNA为模板，进行PCR扩增. 所采用的PCR引物及扩增条件如表 1所示. PCR采用20 μL扩增体系，2×Taq PCR Master Mix 10 μL，Forward primer(10 μmol ·L^-1)0.4 μL，Reverse primer(10 μmol ·L^-1)0.4 μL，ddH₂O 7.2 μL，模板2 μL，实验设置3组平行.

(3)Real-time PCR 将两株纯菌的16S rRNA和arsC基因的PCR扩增产物纯化、 回收后送至上海美吉生物公司合成质粒，以合成的质粒作为标准品，实验提取的总RNA反转录cDNA为模板，进行Real-time PCR，计算各阶段Pseudomonas sp. QJX-1菌株和Brevibacterium sp. LSJ-9菌株16S rRNA拷贝数和各阶段两菌株16S rRNA拷贝数之比，以及各阶段arsC基因的拷贝数. Real-time PCR采用20 μL扩增体系，2×SuperRealPreMix Plus(with SYBR Green I) 10 μL，50×ROX Reference Dye 2 μL，Forward primer(10 μmol ·L^-1)0.4 μL，Reverse primer(10 μmol ·L^-1)0.4 μL，ddH₂O 5.2 μL，模板2 μL，实验设置3组平行. 所采用的Real-time PCR引物及扩增条件如表 1所示.

表 1(Table 1)

表 1 PCR、 RT-PCR引物及扩增条件 1) Table 1 Sequence of the primers and thermocycling condition for PCR and RT-PCR 扩增产物 引物(5′-3′) 扩增条件 文献 cumA(800bp) cumAIdg2B:GAYGCCGGYAGCTACTGGTAYCACCC cumAIdgR:ACYTTGAARSYCATGCCRTGCARRTG 94℃ 3 min； 94℃ 30 s,45℃30 s,60℃ 1 min； 72℃ 2 min； 30次循环 [17] arsC(353bp) amlt42f:TCGCGTAATACGCTGGAGATamlt376r:ACTTTCTCGCCGTCTTCCTT 95℃ 5 min； 95℃ 45 s,60℃ 45 s,72℃ 1 min； 72℃ 2 min； 40次循环 [16] arsC(353bp) amlt42f:TCGCGTAATACGCTGGAGATamlt376r:ACTTTCTCGCCGTCTTCCTT *95℃ 15 min； 95℃ 45 s,60℃ 45 s,72℃ 1 min； 40次循环 [16] 16S(短杆菌) F:AGACGGTTTACGCTGTCACTTR:GGTACTTGTTCTTCCCTAACAACA *95℃ 15 min； 95℃ 30 s,45℃ 30 s,60℃ 1 min； 40次循环 本研究 16S(假单胞菌) F:GGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAR:CCACTGGTGTTCCTTCCTATATC *94℃ 15 min； 94℃ 30 s,45℃ 30 s,60℃ 1 min； 30次循环 本研究 1)*表示Real-time PCR扩增条件

表 1 PCR、 RT-PCR引物及扩增条件 1) Table 1 Sequence of the primers and thermocycling condition for PCR and RT-PCR

为探究两菌株对As³⁺、 As⁵⁺的氧化还原竞争，按1.2节所示方法，首先分析了Pseudomonas sp.QJX-1单独氧化Mn²⁺及Brevibacterium sp. LSJ-9单独还原As⁵⁺的过程，如图 1. 可以看出，Pseudomonas sp.QJX-1菌株9 h左右生长达到最大，并开始生成不溶性氧化锰[图 1(a)]. 与Pseudomonas sp.QJX-1菌株生长趋势相似，Brevibacterium sp. LSJ-9菌株9 h左右生长达到最大，而与之不同的是，在菌株生长达到最大之前，As⁵⁺已经开始被还原[图 1(b)]. 这与两菌株的作用机制不同有关，环境中的As⁵⁺可通过砷还原菌细胞膜上的磷脂通道进入细胞内，为降低细胞内的砷浓度，达到细胞解毒的目的，arsC基因将As⁵⁺还原为As³⁺，再通过膜蛋白将As³⁺泵出细胞^{[18, 19]}. 因此砷还原微生物的生长伴随着五价砷的还原. 而cumA的活性并不需要Mn²⁺的诱导^[20]，Mn²⁺的存在是锰氧化菌生长的非必要因素，因此锰氧化发生在菌体生长稳定之后.

图 1

Fig. 1

图 1 菌株生长曲线及分别对Mn2+、 As5+的作用 Fig. 1 Strain growth curves and effect of Mn2+ and As5+,respectively

同时设置了三价砷及五价砷体系，考察两菌株对As³⁺、 As⁵⁺的氧化还原竞争，如图 2. 与菌株单独培养相比，两菌株同时培养时，三价砷体系中不溶性氧化锰生成的时间明显延后[图 2(a)]，但最终Mn²⁺的氧化率达98.3%，生成的生物氧化锰对As³⁺的氧化率也达95%，与报道的生物氧化锰单独氧化As³⁺的效率相似^[10]，即砷还原菌的存在，并不影响生物氧化锰对As³⁺的氧化效率. 五价砷体系中，As⁵⁺被还原到一定程度(73%)，生物氧化锰开始氧化生成的As³⁺[图 2(b)]，而此时并未达到砷还原菌单独还原砷的最大效率(86%)，且反应结束时，砷基本以As⁵⁺的形式存在.结果表明，反应初期，两菌株分别起到了锰氧化和砷还原作用，但最终生物氧化锰对砷的氧化作用相比于砷还原菌的还原作用占优势. 同时也可以看出，不同反应时间，培养基中Mn与As存在的浓度以及价态不同，由此可推出滤池水力停留时间(HRT)的不同会影响出水中锰、 砷的质量浓度/形态，从而影响出水水质. 停留时间短，生物氧化锰未完全氧化As³⁺，没有达到降低水体毒性的目的，并且很多氧化物对As³⁺的吸附效果不如As⁵⁺好^[21]，因此As³⁺的存在不利于对总As的吸附去除. Devi等^[13]在对不同HRT对砷去除效果的研究中也发现，相同条件下，停留10 h对砷的去除效果要优于停留2-8 h.

图 2

Fig. 2

图 2 两株菌共存时Mn2+、 As5+浓度变化 Fig. 2 Concentration changes of Mn2+ and As in the coexistence of two strains

为分析生物氧化锰在对砷价态竞争中占优势的原因，对两菌株的功能基因进行了PCR扩增. 由图 3可以看出，多铜氧化酶cumA(800bp)在两体系中均有表达，而砷还原酶arsC(353bp)只在五价砷体系9h样品中有表达，其余时间样品中均未表达. 由此推测反应过程中cumA基因抑制了arsC基因的表达，使得Brevibacterium sp. LSJ-9菌株的还原性受到抑制. Greene等^[22]在研究反硝化脱硫菌(NR-SOB)和硫酸盐还原菌(SRB)竞争时也得出相似的结论. 从而解释了反应末期，两体系培养基中Mn²⁺最终基本完全被氧化，砷主要以As⁵⁺的形式存在的原因. 也解释了虽然滤池中存在砷还原微生物，并不会导致滤池出水中含有大量As³⁺的原因.

图 3

Fig. 3

1-3分别表示三价砷体系9、 27、 51 h； 4-6分别表示五价砷体系9、 27、 51 h 图 3 功能基因PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图 Fig. 3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of the functional genes cumA and arsC

为进一步研究两菌株生长过程中对空间、 营养物质的竞争关系，对两菌株16S rRNA进行Real-time PCR定量分析. 由图 4(a)、 4(b)可看出，反应初期(9 h)，16S rRNA表达量均达最大值，与图 1结果相符，即空间、 营养物质丰富时，两菌株均可大量生长. 但两体系中Pseudomonas sp. QJX-1菌株与Brevibacterium sp. LSJ-9菌株16S rRNA表达量之比分别为2.63×10²和1.53×10²，表明Pseudomonas sp. QJX-1是优势菌，在同一环境中更快生长. 随着空间、 营养物质的逐渐减少，16S rRNA的表达量均减弱，但比值逐渐增大，27 h菌株的16S rRNA表达量之比分别为2.86×10²和1.76×10²，51 h分别为3.13×10²和4.4×10². 表明空间、 营养物质的改变影响菌体间的相互作用，从而增强菌体间的竞争关系^{[23, 24]}. 分析原因，这与两菌株对空间、 营养物质的不同需求有关，有研究报道锰氧化菌属于贫营养菌^[25]，在贫营养中生长得更好.

为进一步分析功能基因竞争关系，对arsC基因进行了Real-time PCR定量分析[图 4(c)]，结果表明，反应初期，五价砷体系arsC基因量较多，较其余时期高出一个数量级，即As⁵⁺的存在有利于arsC基因的表达. 随着反应的进行，arsC基因量逐渐减少，且Brevibacterium sp. LSJ-9菌株16S rRNA与arsC基因表达量相比始终相差两个数量级以上. 对比图 3、 图 4可以看出，Pseudomonas sp. QJX-1菌株在竞争非生物环境时占优势，但并没有抑制Brevibacterium sp. LSJ-9菌株的生长，但随着反应的进行，cumA基因抑制了arsC基因的表达.

图 4

Fig. 4

图 4 两菌株各阶段16S rRNA表达量及arsC基因表达 Fig. 4 Expression of 16S rRNA and arsC at different growth stages of the two strains

生物处理工艺越来越多地被运用于水厂中，而微生物之间的竞争关系影响到处理工艺的稳定性及效率^{[26, 27]}. 如由于菌体作用机制不同，导致水体中锰、 砷的质量浓度/价态随着反应时间的不同而变化. 由此推测，若滤池进水中以As⁵⁺为主，反应时间短，砷还原菌迅速将As⁵⁺还原，而生成的生物氧化锰未来得及将生成的As³⁺氧化，反而提高了水体中砷的毒性. 进一步验证了HRT短滤池对砷的氧化去除效果差，影响出水水质. 因此研究滤池滤膜表面微生物的竞争，有利于了解滤池的作用机制，以便提高滤池去除Mn、 As等离子的效率，降低出水毒性.

(1)cumA基因抑制arsC基因的表达，从而降低了Brevibacterium sp. LSJ-9菌株对As⁵⁺的还原性，即生物氧化锰对砷的氧化相对于微生物对砷的还原占优势.

(2)Pseudomonas sp. QJX-1菌株16S rRNA基因表达量始终比Brevibacterium sp. LSJ-9菌株高两个数量级，即在对非生物环境(空间、 营养物质)竞争中，Pseudomonas sp. QJX-1菌株始终占优势.

(3)锰氧化菌与砷还原菌的作用机制不同，从而反应时间短，不利于降低水体中砷的毒性. 验证了水厂滤池中HRT时间短，影响出水的水质.