近几十年来，随着水体富营养化加剧，蓝藻水华在淡水生态系统中频繁发生，给水生态系统安全和人类健康产生了严重危害，已成为全球关注的重大水环境问题^{[1, 2]}. 微囊藻(Microcystis)是形成蓝藻水华最常见的优势种类，微囊藻水华分布广泛，发生面积大，持续时间长，且能产生多种具有肝毒性效应的微囊藻毒素(microcystin,MC). 因此，加强有毒微囊藻水华毒素检测及其预警具有重要意义.

许多研究表明，微囊藻水华中有毒微囊藻和无毒微囊藻细胞共同存在，有毒微囊藻丰度及其所占比决定了微囊藻水华毒性大小，阐明有毒和无毒微囊藻丰度及其与环境因子之间的关系对于认识微囊藻水华毒性及其防控具有重要意义^{[3, 4]}. 有毒微囊藻和无毒微囊藻细胞形态特征一致，利用显微镜检测无法将两者鉴别开来. 有毒微囊藻基因组DNA中含有微囊藻毒素合成酶基因家族(microcystin synthetase gene,mcy)^[5]，对微囊藻毒素产生进行调控，而无毒微囊藻细胞则不含有mcy基因^[6]. 因此，针对mcy基因，采用荧光定量PCR技术能快速、 准确鉴别有毒和无毒微囊藻细胞，并进行定量化研究^[6].

洪泽湖是中国第四大淡水湖，近20多年来，洪泽湖水质进入富营养化状态，并呈逐渐加重趋势^{[7, 8]}，蓝藻水华在洪泽湖频繁出现，微囊藻是蓝藻水华的优势种群^[9]. 李大命等^[10]采用PCR扩增技术在洪泽湖水体中检测出有毒微囊藻，但没有对其丰度进行定量化研究. 为此，本研究采用荧光定量PCR分析技术，测定洪泽湖有毒和无毒微囊藻丰度及空间分布，并分析与环境因子之间的关系，以期为洪泽湖微囊藻水华危害评价及其防控提供科学依据.

如图 1所示，本研究在洪泽湖设置30个采样点 (H1~H30)，基本覆盖了洪泽湖大部分湖区. 采样时间为2014年8月19-20日，采用有机玻璃采水器采集表层水样(0.5m)，将水样混合均匀，装入塑料桶中，带回实验室进行处理.

图 1

Fig. 1

图 1 采样点在洪泽湖的分布示意 Fig. 1 Distribution of sampling locations in the Lake Hongze

采用YSI 6600原位测定水温(Water temperature,WT). 赛氏透明度盘测定透明度(SD). 水体的总氮(total nitrogen,TN)和总磷(total phosphorus,TP)浓度采用文献^[11]中方法. 溶解性氮磷硝态氮(NO₃^-)、 铵态氮(NH₄⁺)、 亚硝态氮(NO₂^-)和正磷酸盐(PO₄^3-)浓度采用Skalar流动分析仪测定. 叶绿素a(Chl-a)采用90%的乙醇萃取，分光光度法测定. 根据文献^[12]计算Chl-a、 TP、 SD的Carlson富营养化指数(TSI)，分别用TSI(Chl-a)、 TSI(TP)和TSI(SD)表示，取三者平均值表示水体的综合富营养化指数.

采用GF/F滤膜(Whatman)过滤收集水样中的藻细胞，藻类基因DNA的提取方法参照文献^[13]进行. DNA溶于TE溶液，-20℃保存备用.

利用实时荧光定量PCR技术测定有毒微囊藻和总微囊藻丰度. 分别采用mcyD和PC-IGS基因表示有毒微囊藻和总微囊藻. PCR引物如表 1所示. 以室内纯培养的铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa 7806)基因组DNA作为定量PCR反应的标准物，设置6个梯度浓度(8.27×10⁶-8.27×10¹ copies ·μL^-1)，建立基因组拷贝数的对数值与循环阈值之间的标准曲线. 定量PCR反应体系为25 μL，SYBR green Ⅰ作为荧光探针，其中有12.5 μL 2×SYBR Green I 定量PCR混合液(Takara)，0.5 μL正向、 反向引物(10 μmol ·L^-1)，1 μL 标准DNA或2 μL样品DNA，其余体系用超纯水补足. 定量PCR反应在四通道荧光定量PCR仪器(Mastercycler ep realplex4,Eppendorf,Germany)上进行，反应程序与文献^[14]一致. 定量PCR反应结束后进行PCR产物溶解曲线分析，并通过系统自带软件分析获得mcyD和PC-IGS基因定量PCR扩增效率(amplification efficiency,e)和标准曲线方程.

表 1 (Table 1)

表 1 定量PCR反应引物 Table 1Quantitative PCR primers used in this study 基因 引物 序列 mcyD[15] mcyD-F 5′- GGTTCGCCTGGTCAAAGTAA -3′ mcyD-R 5′-CCTCGCTAAAGAAGGGTTGA -3′ PC-IGS[3] 188F 5′-GCTACTTCGACCGCGCC-3′ 254R 5′- TCCTACGGTTTAATTGAGACTAGCC-3′

表 1 定量PCR反应引物 Table 1Quantitative PCR primers used in this study

采用SPSS 16.0软件对变量分布进行正态性检验，对不满足正态分布的变量进行转化. 将总微囊藻、 有毒微囊藻及有毒微囊藻比例与环境因子进行Pearson相关性分析及显著性检验. 采用Origin 8.5软件对数据进行作图.

洪泽湖水体的理化因子如图 2~5所示. 从中可见，采样点叶绿素a浓度范围为3.45~35.71 μg ·L^-1，平均值为13.53 μg ·L^-1； 透明度在20~45 cm之间波动，平均值为30.9 cm； 水温变化幅度较小，平均值为27.4℃； 总氮和总磷浓度范围分别为0.85-3.59mg ·L^-1和0.035-0.27mg ·L^-1，平均值分别为1.63 mg ·L^-1和0.11mg ·L^-1； 铵态氮、 硝态氮、 亚硝态氮和正磷酸盐浓度范围分别为0.016-0.091 1mg ·L^-1、 0.12~1.41mg ·L^-1、 7.10~25.12 μg ·L^-1和1.20-109.75 μg ·L^-1，平均值分别为0.052 mg ·L^-1、 0.74mg ·L^-1、 11.50 μg ·L^-1和43.01 μg ·L^-1； 采样点水体的富营养化指数在58.1-73.6之间波动，平均值为67.3.

图 2

Fig. 2

图 2 洪泽湖水体的叶绿素a浓度、 透明度和水温 Fig. 2 Chlorophylla concentrations,transparency and water temperature of water body of Lake Hongze

图 3

Fig. 3

图 3 洪泽湖水体的总氮和总磷浓度 Fig. 3 Total nitrogen and total phosphorus concentrations in water body of Lake Hongze

图 4

Fig. 4

图 4 洪泽湖水体的溶解性无机氮磷浓度 Fig. 4 Dissolved inorganic nitrogen and phosphorus concentrations in water body of Lake Hongze

图 5

Fig. 5

图 5 洪泽湖水体的富营养化指数 Fig. 5 Trophic state index of water body in Lake Hongze

图 6是铜绿微囊藻PC-IGS和mcyD基因的定量PCR反应标准曲线. 从中可见，基因型丰度的对数值与定量PCR反应循环阈值之间呈显著线性相关，并建立了两者的回归方程. 两标准曲线的决定系数R²都大于0.99，说明标准曲线线性较好，结果可信度较高. 其中PC-IGS基因定量PCR反应的扩增效率(e)为0.92，mcyD基因的扩增效率为0.89，均满足定量PCR反应实验要求. 溶解曲线分析结果显示，PCR产物为目的基因产物，无非特异性产物产生.

图 6

Fig. 6

图 6 PC-IGS和mcyD基因定量PCR反应标准曲线 Fig. 6 Standard curves obtained by the real-time PCR assays of PC-IGS and mcyD genes

如图 7所示，洪泽湖水体中总微囊藻和有毒微囊藻丰度及有毒微囊藻所占比例变化. 从中可见，总微囊藻丰度在1.06×10⁵-1.10×10⁷copies ·mL^-1之间，平均值为 2.55×10⁶copies ·mL^-1； 有毒微囊藻丰度在1.13×10⁴-3.51×10⁶copies ·mL^-1之间，平均值为 7.73×10⁵copies ·mL^-1，总微囊藻和有毒微囊藻丰度呈现出较大的空间变化. 有毒微囊藻所占比例在8.5%-38.5%之间变化，平均值为23.6%.

图 7

Fig. 7

图 7 微囊藻和产毒微囊藻种群丰度及产毒微囊藻所占比例 Fig. 7 Abundance of total and toxic Microcystis populations and the proportion of toxic Microcystis in Lake Hongze water body

表 2所示为总微囊藻和有毒微囊藻丰度与环境因子之间的相关系数及其显著性检验结果. 从中可见，总微囊藻、 有毒微囊藻和有毒微囊藻比例之间呈极显著正相关(P<0.01). 总微囊藻和有毒微囊藻丰度与叶绿素a浓度和TSI呈极显著正相关(P<0.01)，与透明度呈极显著负相关(P<0.01). 有毒微囊藻比例与叶绿素a、 总氮、 总磷和TSI呈极显著正相关(P<0.01)，与TN/TP和SD呈极显著负相关(P<0.01).

表 2 (Table 2)

表 2微囊藻丰度与环境因子之间的相关系数(n=14) Table 2 Correlation coefficients between Microcystis population abundance and environmental factors (n=14) Total M Toxic M Ratio Chl-a TN TP TN/TP NO3- NH4+ NO2- PO43- WT SD TSI Total M 1.00 Toxic M 0.89 ** 1.00 Ratio 0.69 ** 0.74 ** 1.00 Chl-a 0.82 ** 0.82 ** 0.81 ** 1.00 TN 0.17 0.22 0.68 ** 0.23 1.00 TP 0.24 0.30 0.73 ** 0.27 0.94 ** 1.00 TN/TP -0.27 -0.30 -0.61 ** -0.29 -0.47 ** -0.69 ** 1.00 NO3- -0.27 -0.27 0.01 -0.14 0.11 -0.06 0.18 1.00 NH+4 -0.31 -0.29 -0.07 -0.30 0.24 0.23 -0.19 0.15 1.00 NO-2 -0.12 -0.09 -0.22 -0.19 0.00 0.01 0.26 -0.62 ** 0.15 1.00 PO43- -0.40 -0.40 -0.07 -0.31 0.02 0.07 -0.23 0.60 ** 0.31 -0.54 ** 1.00 WT 0.16 0.14 0.21 0.20 0.05 0.10 -0.15 0.05 0.24 0.06 0.05 1.00 SD -0.54 ** -0.57 ** -0.72 ** -0.66 ** -0.26 -0.29 0.30 -0.16 0.14 0.33 -0.10 -0.20 1.00 TSI 0.67 ** 0.69 ** 0.88 ** 0.80 ** 0.65 ** 0.69 ** -0.63 ** 0.06 -0.08 -0.31 0.00 0.20 -0.75 ** 1.00 1)*为P<0.05,**为P<0.01

表 2 微囊藻丰度与环境因子之间的相关系数(n=14) Table 2 Correlation coefficients between Microcystis population abundance and environmental factors (n=14)

湖泊富营养化的评价有多种方法，主要有特征法、 参数法、 生物指数评价法、 磷收支模型法、 营养状态指数法和数学分析法等六大类型^[16]. 其中营养状态指数法是淡水环境质量评价中的主要方法之一，该方法综合多项富营养化指标，包括湖水透明 度、 藻类叶绿素a浓度以及湖水总磷浓度并将其转化为营养状态指数(TSI). 该方法可对湖泊营养状态进行连续的数值化分级，有利于湖泊营养状态化的定量研究提供了坚实的基础. 从本研究结果可以得出，洪泽湖采样点水体的TSI在58.1-73.6之间，平均值为67.3，这表明洪泽湖全湖水质呈富营养化状态. 李为等^[8]采用修正的TSI_m法在2010年对洪泽湖四季的水体营养状况进行了综合评价，结果表明洪泽湖的TSI_m值均大于70，其中夏季的TSI_m值最高，达78.5，该研究结果表明洪泽湖4个季节的水质均呈富营养化状态. 尽管采用了不同的富营养化指数评价方法，但得出的结论是一致的. 一般认为，当水体中TN、 TP含量分别达到0.20 mg ·L^-1和0.02 mg ·L^-1以上时，水体发生富营养化的风险较高. 本研究中洪泽湖水体的TN (1.63mg ·L^-1)、 TP (0.11mg ·L^-1)浓度平均值远高于限制值，均达到富营养化水平. 另外，Chl-a浓度在3.45-35.71 μg ·L^-1之间，平均值为13.53 μg ·L^-1，在部分湖区出现了较大面积的微囊藻水华，均是洪泽湖水质富营养化状态的特征表现.

近年来，实时荧光定量PCR技术被广泛用于有毒蓝藻水华的动态监测，与传统的显微镜检测方法相比，该技术具有灵敏度高、 特异性高、 重复性好、 定量准确等优点^{[17, 18]}. 在实际应用中，荧光定量PCR反应的扩增效率在80%-115%之间、 标准曲线方程的决定系数(R²)大于0.95，才能满足实验要求^[18]. 本研究中建立了基于SYBR Green Ⅰ荧光燃料的PC-IGS和mcyD基因的实时荧光定量PCR检测方法(图 6)，用于测定洪泽湖水体中总微囊藻及有毒囊藻丰度. 从图 6可以得出，PC-IGS (Y=-3.48X+44.11)，式中，X表示基因拷贝数的对数值，Y表示循环阈值，下同)和mcyD (Y=-3.58X+43.01)基因定量PCR反应的扩增效率分别为89%和92%，标准曲线方程的决定系数R²分别为0.994和0.996，溶解曲线分析结果显示PCR产物均为目的基因，表明了荧光定量PCR实验结果具有准确性和可信性.

基于实时荧光定量PCR分析结果得出，所有采样点水体中均检测出微囊藻及有毒微囊藻，其丰度分别在1.06×10⁵-1.10×10⁷copies ·mL^-1和1.13×10⁴-3.51×10⁶copies ·mL^-1之间，这说明微囊藻及有毒微囊藻在洪泽湖有分布广泛，且其丰度在空间分布上有较大的差异性. 相关分析结果表明，微囊藻、 有毒微囊藻和叶绿素a三者之间有显著正相关性，且均与TSI有极显著正相关性(P<0.01)，说明洪泽湖水体中总微囊藻与有毒微囊藻丰度变化趋势一致，两者受相同的环境因子控制. 在美国Erie湖和韩国Daechung水库总微囊藻与有毒微囊藻丰度密切相关，且均与总磷浓度有极显著正相关性(P<0.01)^{[19, 20]}. 在新加坡热带水库Kranji中，总氮和总磷与微囊藻和有毒微囊藻丰度有显著正相关性^[21]. 在本研究中，总微囊藻和有毒微囊藻丰度与总氮和总磷浓度呈正相关性，但均不显著(P>0.05)，这表明洪泽湖水体中氮、 磷不是微囊藻及有毒微囊藻的限制因子. 尽管透明度SD与微囊藻及有毒微囊藻丰度呈极显著负相关性(P<0.01)，这仅反映了微囊藻水华的结果，而非微囊藻水华发生的原因^[20]. 除营养盐因素外，湖泊水文水动力和气象条件也是影响微囊藻生长和丰度的重要因素^[22]. 因此，微囊藻及有毒微囊藻丰度及其分布是多种因素共同作用的结果.

总体来说，自然水体中有毒和无毒微囊藻共存是普遍存在的现象，但是决定其丰度及有毒微囊藻比例的环境因子具有多样性. 研究发现，日本的Mikata湖有毒微囊藻比例与硝态氮浓度有显著正相关性，而与温度和磷酸盐浓度无显著相关性^[23]； 在韩国Daechung水库，总磷是影响总微囊藻和有毒微囊藻丰度最重要的环境因子，但与有毒微囊藻比例无显著相关性，水温是决定有毒微囊藻比例的关键因子^[20]. 在美国Erie湖，相关分析显示总磷浓度与总微囊藻及有毒微囊藻丰度有极显著正相关性，有毒微囊藻比例随富营养化水平升高而增加^[19]. 在太湖，有毒微囊藻比例与总磷和磷酸盐浓度有显著正相关性，与温度有极显著正相关性^[24]. 除理化因子外，一些生物因子(浮游动物、 病毒)也能对有毒微囊藻丰度及其比例产生显著影响^{[25, 26]}. 另外，微囊藻属的不同微囊藻种类，其有毒微囊藻比例也各不相同，比如，铜绿微囊藻种群中的有毒微囊藻比例最高，而惠氏微囊藻则为无毒株^[27]. 因此，水体中微囊藻群落的基因型组成及其丰度动态变化由环境因子和微囊藻群落特征共同决定^[20].

在本研究中，洪泽湖水体中有毒微囊藻占总微囊藻的比例在8.5%~38.5%之间，平均值为23.6%，这表明无毒微囊藻相对有毒微囊藻而言占有优势，与已有报道的结果具有一致性. 例如，日本Mikata湖，有毒微囊藻所占比例在0.5%~3.5%之间^[23]； 德国Wannsee 湖，有毒微囊藻与总微囊藻的比值在1%-38%之间,平均值为11.4%^[3]； 中国太湖，有毒微囊藻比例在4.4%-64.3%之间^[24]； 美国Erie湖，有毒微囊藻比例在0~48%之间^[19]； 韩国Daechung水库，有毒微囊藻比例在7.6%~56.6%之间，平均值为33.0%^[20]； 而新加坡Daechung水库，有毒微囊藻比例平均值为55.92%，在微囊藻群落中占有优势^[21]. 有研究者提出，在正常条件下无毒微囊藻具有某些生态优势，在与有毒微囊藻竞争中占有竞争优势^[20]. 相关分析结果表明，有毒微囊藻比例与总氮、 总磷、 叶绿素a和TSI呈极显著正相关(P<0.01)，而与TN/TP和SD呈极显著负相关(P<0.01)，这说明总氮、 总磷、 叶绿素a浓度及水体富营养化水平对有毒微囊藻和无毒微囊藻竞争有重要影响，随氮、 磷浓度增加，有毒微囊藻竞争优势增强. 室内和野外实验结果表明，随氮磷浓度增加，有毒微囊藻生长速率超过无毒微囊藻，提高了有毒微囊藻对无毒微囊藻的竞争力，有毒微囊藻占总微囊藻的比例也随之增加^{[28, 29]}. 因此，削减洪泽湖氮、 磷浓度一方面有利于降低水体富营养化水平，另一方面有利于降低有毒微囊藻对无毒微囊藻的竞争力，对控制洪泽湖富营养化和降低微囊藻水华毒性具有重要意义.

(1) 基于Chl-a、 TP和SD的洪泽湖Carlson富营养化指数TSI在58.1~73.6之间，平均值为67.3，表明洪泽湖水质处于富营养化状态.

(2) 微囊藻及有毒微囊藻在洪泽湖广泛分布，其丰度分别在1.06×10⁵~1.10×10⁷ copies ·mL^-1和1.13×10⁴~3.51×10⁶ copies ·mL^-1之间. 有毒微囊藻比例在产毒微囊藻种群所占比例在8.5%-38.5%之间，平均值为23.6%，呈现出较大的空间差异性.

(3) 洪泽湖水体中总微囊藻、 有毒微囊藻和叶绿素a有极显著正相关性，且均与TSI呈极显著正相关(P<0.01)，与透明度呈极显著负相关(P<0.01). 总氮和总磷是决定有毒微囊藻比例的关键环境因子，削减氮、 磷对于降低洪泽湖富营养化水平，控制微囊藻水华具有重要作用.