稻田是甲烷(CH₄)的主要排放源之一. 据估计，全球所有人为活动导致的CH₄排放总量中，从稻田排放的CH₄占15%~20%^[1]. 除此之外，我国每年产生的农作物秸秆高达5.8亿t，占全世界秸秆总产量的20%~30%^[2]. 秸秆还田能够有效提高土壤有机质、 改善土壤团聚体，并可取代秸秆焚烧，避免环境污染，因此秸秆还田得到大力提倡. 秸秆还田包括直接还田或堆腐后再施入土壤，近年来采用直接还田方式较为普遍^[3]. 但是秸秆还田会增加土壤有机质含量，进而促进土壤CH₄排放^[4]，尤其会增加淹水稻田土壤的CH₄排放. 如何降低稻田CH₄排放一直以来都是国内外的研究热点. 合理的水分管理措施包括中期排水、 间歇性淹水、 渗漏控制等能够有效地减少CH₄排放^[5]. 但是这些管理措施需要大量投入劳动力和水资源，而且在稻田淹水时期对减排不起作用.

微生物燃料电池(microbial fuel cells,MFCs)是一种用产电微生物将有机物的化学能直接转化成电能的装置^[6]. 有机底物在厌氧条件下被产电微生物分解并释放出电子，电子直接被阳极捕获或经过电子中介体、 纳米导线等物质间接到达阳极，并经由外电路传递到阴极与电子受体(通常为O₂)结合，从而形成电流^[7]. 土壤中含有丰富的产电微生物，可以采用MFCs装置进行产电^[8]. 近几年的研究发现，采用稻田土壤运行MFCs能够有效减少CH₄排放(图 1)，例如da Rosa^[9]将阳极埋设在种植水稻的淹水稻田土壤中，阴极浸没在淹水层，并采用导线连接阳极和阴极，从而构建MFCs. 该MFCs以土壤有机质和根系分泌物为电子供体，以水中溶解氧为电子受体进行产电. 结果显示运行MFCs之后，稻田土壤的CH₄排放量比对照组减少了50%. Rismani-Yazdi等^[10]将纤维素作为碳源底物置于MFCs中进行产电，发现随着MFCs产电电流的增加，CH₄累计排放量降低. 可能的原因是产电菌和产甲烷菌竞争有机底物，从而减少了CH₄的形成^[11]. 运行MFCs减排土壤CH₄的优势在于不使用化学药剂也不消耗能源，相反还能产生少量电能. 是一项值得深入探索的绿色可持续的减排技术. 但已有的相关研究对于水稻生长期内不同阶段的减排规律缺乏深入探索. 水稻在苗期、 分蘖期、 晒田期、 灌浆期和成熟期运行MFCs是否都有减排效果？在哪个生长期运行MFCs减排最有效？另外，土壤添加稻秆是否会影响MFCs的减排效果？对于上述问题目前尚缺乏研究.

图 1

Fig. 1

图 1 本研究运行的MFCs反应器 Fig. 1 MFCs reactors in the present study

本研究设置向土壤添加稻秆和不添加稻秆两类处理. 种植水稻后，分别比较运行和不运行MFCs对水稻各个生长期内土壤CH₄排放的影响，同时也观察土壤添加稻秆是否会影响MFCs的减排效果. 水稻进入成熟期后结束MFCs运行，分析MFCs运行对土壤理化性质以及对水稻生长情况的影响，从而为MFCs应用于稻田CH₄减排提供可行性依据. 由于运行MFCs不使用化学药剂也不消耗能源，因此本研究为稻田CH₄减排提供了一种潜在的绿色可持续的技术方法.

供试土壤于2013年10月采集自江西省鹰潭市余江县(116.89°E，28.30°N)的一块完成收割并落干的水稻田. 采样地气候条件为亚热带季风气候，年平均降雨量1 785 mm，年平均气温17.8℃. 采样深度0~20 cm. 土壤鲜样采集后经研磨过2 mm筛并充分混匀用于构建MFCs，少量过筛土壤继续风干进行理化分析. 土壤pH按m_土(g) ∶V_水(mL)=1 ∶2.5采用pH计(FE20，Mettler Toledo)测定； 土壤有机碳(SOC)采用硫酸-重铬酸钾氧化法测定； 土壤全氮(TN)测定采用半微量凯氏定氮法测定. 电导率(EC)按m_土(g) ∶V_水(mL)=1 ∶5通过电导率仪(DDSJ-308F，上海雷磁)测定. 土样的理化性质如下：土壤pH，5.54； SOC，12.58 mg ·g^-1； TN，0.93 mg ·g^-1； EC，46.6 μS ·cm^-1.

称取90 kg(干土重)过筛后的土样并分成均等的两份，每份45 kg. 向一份土壤中加入225 g稻秆粉末，并充分混匀，得到0.5%的稻秆添加量. 另一份土壤不添加任何物质. 再分别将每份土壤均分为6份，每份7.5 kg，装入12个PVC材质的圆柱形MFCs反应器( 30 cm×25 cm)中(图 1). 当装入一半土量时，将一块圆形碳毡( 30 cm)作为阳极铺在土壤上，再把剩余的一半土壤覆盖在阳极上. 向反应器中加入自来水至土壤处于淹水状态，水层厚度3 cm. 再将一块环形碳毡(外径30 cm，内径12 cm)作为阴极没入水中轻轻放置于淹水土壤表面. 向每个MFC反应器移栽培育好的水稻秧苗4株. 分别从添加稻秆和不添加稻秆的6个MFCs反应器中随机挑选3个，用钛丝作为导线连接阳极和阴极，并串联1 000 Ω外电阻，形成闭路从而运行MFCs. 其余MFCs反应器不连接导线，作为开路对照. 此时12个MFCs反应器共被分为4个处理，包括0.5%稻秆+闭路(CC-0.5%)，0.5%稻秆+开路(OC-0.5%)，无稻秆+闭路(CC-0)和无稻秆+开路(OC-0)，每个处理3个重复. 所有MFCs反应器放置在温室中运行，采用空调28℃控温. 采用数据采集卡(7660B，北京中泰研创)每隔10 min记录一次闭路MFCs反应器产生的电压数值，至电压稳定后改接10 Ω外阻. 换小电阻目的是提高电流，促进产电反应的进行^[10]. MFCs开始运行的时间记为第0 d，第39~56 d水稻生长处于晒田期，由于土壤干燥，MFCs暂停运行. 第56~88 d为灌浆期，土壤再次淹水，MFCs恢复运行并记录电压. 第88~98 d为水稻成熟期，水分再次蒸发落干，MFCs停止运行. 需要注意的是，在实验前阳极和阴极碳毡都采用打孔器打穿40个直径1 cm的圆孔，以利于土壤产生的气体通过.

本研究中温室气体的采集使用静态箱采集技术^[12]. 从MFCs开始运行后24 h(第1 d)开始采集气体，每周采样一次，采样时间为下午14:00~16:00. 采样时，用50 mL气密性注射器从采气箱( 32 cm×110 cm)中抽取5次气体，间隔10 min，每次抽取25 mL. 同时记录采气箱内温度. 采集的气体注射入采气瓶内，并尽快完成气体浓度测定. 使用配备了FID检测器的气相色谱仪(GC7890B,Agilent Technologies,USA)测定CH₄的浓度. 气相色谱仪基本参数如下：选用2 m的MS 13x(60/80 mesh)作为分离柱； 炉温为80℃，进样口温度为200℃，检测器温度为200℃； 载气为N₂，流速为30 mL ·min^-1； 燃气为H₂和空气，流速分别为40 mL ·min^-1和400 mL ·min^-1； 选用10.1×10^-6 mol ·mol^-1的CH₄气体作为标准样品.

每周于气体采集完毕后测定水稻地上部分株高. 第98 d气体采样结束后，停止MFCs运行. 小心地从MFCs反应器中移出水稻植株，仔细地洗净水稻根上的泥土，在70℃ 的条件下烘干称重，测定水稻植株生物量. 再将籽粒从植株上分离，称重测定产量. 将MFCs反应器放在阴凉处自然风干，风干土壤研磨过2 mm筛并充分混匀后用于测定土壤pH和土壤有机碳(SOC)含量.

本研究数据分析均采用SPSS 19.0软件. 采用T-test分析开路和闭路处理之间的差异显著性，采用最小显著差异法(LSD)分析不同处理间CH₄排放总量、 土壤理化性质(土壤pH、 土壤有机碳含量)和水稻生长状况(株高、 籽粒产量，以及地上和地下部分生物量)的显著性差异，每个MFC反应器中的水稻生长状况取4株水稻的平均值； 采用两因素方差分析(Two-way ANOVA)评价添加稻秆和运行MFCs对上述指标影响的显著性. 所有统计分析的显著性水平均为P<0.05.

MFCs运行过程中的产电电量(Q)采用以下公式计算：

CH₄排放通量采用以下公式计算：

种植水稻后MFCs运行电流变化见图 2. MFCs开始运行时(第0 d)外接电阻为1 000 Ω，第7 d产电电压稳定后，外阻更换为10 Ω. 之后，CC-0.5%处理的电流不断上升，在水稻分蘖期达到约12 mA的峰值后缓慢下降； CC-0处理的电流缓慢升高，至分蘖期结束时达到约5 mA的峰值. 晒田期内由于土壤干燥，电子传递停止，MFCs暂时停止运行. 第56 d晒田结束并重新淹水后，电流一直维持在约2 mA以下直至灌浆期结束，成熟期由于再次落干水分，MFCs停止运行. MFCs全部运行过程中CC-0.5%处理的产电量为10.26 C，显著高于(P<0.05)CC-0处理的产电量(5.36 C).

图 2

Fig. 2

图 2 水稻生长98 d过程中MFCs平均电流曲线 (n=3) Fig. 2 Curve of the average current generated by MFCs during 98 days of rice growth (n=3)

不同稻秆添加量以及开路、 闭路处理条件下，种植水稻98 d过程中土壤CH₄排放通量的变化见图 3. 在98 d的种植期内，水稻经历了苗期、 分蘖期、 晒田期、 灌浆期和成熟期. 不添加稻秆的条件下，CH₄排放通量在晒田期出现峰值，并且分蘖期和晒田期CH₄累积排放量远远高于其他生长期，开路和闭路处理间无显著差异(图 4). 添加0.5%稻秆的条件下，CH₄排放通量的峰值提前至分蘖期，出现了苗期、 分蘖期和晒田期的CH₄累积排放量较高，而灌浆期和成熟期CH₄累积排放量较低的特征. 与OC-0.5%相比，CC-0.5%的CH₄累积排放量在苗期和分蘖期均显著减少(P<0.05)，并且CC-0.5%在98 d的水稻生长期内显著减少了24.45%的CH₄累积排放量(表 1). 两因素方差分析显示添加稻秆以及运行MFCs都对98 d的CH₄累积排放量产生显著影响，而且两个因素存在显著的交互作用(表 2). 添加稻秆显著增加CH₄累积排放量，而运行MFCs只显著降低添加0.5%稻秆处理的CH₄累积排放量.

表 1(Table 1)

表 1 水稻生长98 d过程中CH4累积排放量，以及第98 d土壤理化性质和水稻生长状况 Table 1 Accumulative CH4 emission during the 98 d growing period of rice along with the soil physicochemical properties and the rice growth status on day 98 处理 CH4累积排放量/g ·m-2 土壤pH 土壤有机质/mg ·g-1 水稻株高/cm 地上部分生物量 /g 地下部分生物量/g 籽粒产量/g OC-01) 9.32±0.952) 6.01±0.18 12.87±0.45 107.33±8.08 49.13±8.00 9.84±1.71 22.82±3.33 CC-0 9.40±0.95 5.70±0.14 13.27±0.39 108.33±4.51 48.53±6.51 9.05±1.66 17.54±3.09 OC-0.5% 52.74±1.51 6.27±0.16 13.63±0.25 115.00±4.58 58.81±5.35 12.45±3.05 26.57±2.93 CC-0.5% 39.85±1.12 5.82±0.02 13.38±0.32 115.67±4.93 61.06±5.59 11.63±3.21 27.54±2.82 LSD0.05 2.18 0.27 0.06 11.18 12.14 4.73 5.74 1)OC-0：无稻秆+开路； CC-0：无稻秆+闭路； OC-0.5%：0.5%稻秆+开路； CC-0.5%：0.5%稻秆+闭路； 2)平均值±标准偏差(n=3)，同一列中平均值之间差异大于LSD0.05代表差异显著(P<0.05).

表 1 水稻生长98 d过程中CH4累积排放量，以及第98 d土壤理化性质和水稻生长状况 Table 1 Accumulative CH4 emission during the 98 d growing period of rice along with the soil physicochemical properties and the rice growth status on day 98

图 3

Fig. 3

图 3 水稻生长98 d过程中的CH4排放通量 Fig. 3 CH4 emission flux during 98 days of rice growth

表 2(Table 2)

表 2 添加稻秆和运行MFCs效应的两因素方差分析 1) Table 2 Two-way ANOVA of the effects of straw addition and MFCs operation 因素 DF F值 CH4累积排放量 土壤pH 土壤有机质 水稻株高 地上部分生物量 地下部分生物量 籽粒产量 添加稻秆(S) 1 3 065***1) 21.88** 4.42 4.79 8.89* 3.21 15.04** 运行MFCs (M) 1 92.18*** 5.62* 0.13 0.59 0.05 0.31 1.56 S×M 1 94.68*** 0.71 2.48 0.00 0.15 0.00 3.07 1)*表示P<0.05； **表示P<0.01； ***表示P<0.001

表 2 添加稻秆和运行MFCs效应的两因素方差分析 1) Table 2 Two-way ANOVA of the effects of straw addition and MFCs operation

图 4

Fig. 4

图中柱上星号*表示开路和闭路间存在显著差异(n=3，P<0.05) 图 4 水稻各生长阶段CH4累积排放量 Fig. 4 Accumulative CH4 emission in different growing stages of rice

MFCs运行98 d后，开路和闭路处理之间土壤有机碳含量无显著差异(P>0.05)，但闭路处理土壤pH显著低于(P<0.05)开路处理. 与OC-0相比，CC-0显著降低了0.31单位pH(P<0.05)； 与OC-0.5%相比，CC-0.5%显著降低了0.45单位pH(P<0.05). 在98 d的水稻生长期内，所有处理的水稻株高增加幅度较为一致(图 5). 从第42 d起，添加0.5%稻秆处理(OC-0.5%、 CC-0.5%)的水稻平均株高超过未添加稻秆处理(OC-0、 CC-0). 水稻培养98 d收获后，开路处理(OC-0、 CC-0.5%)的平均株高、 地上和地下部分生物量以及籽粒产量与相同稻秆添加量的闭路处理(CC-0、 CC-0.5%)之间的差异均未达显著水平(P>0.05)(表 1). 两因素方差分析显示，添加稻秆能显著提高(P<0.05)地上部分生物量以及籽粒产量，而运行MFCs仅对土壤pH有显著影响(P<0.05)(表 2).

图 5

Fig. 5

图 5 水稻生长98 d过程中株高变化 Fig. 5 Dynamic variation of the plant height during the 98 d growing period of rice

本研究发现，在混入0.5%稻秆并且种植水稻的土壤中运行MFCs能够显著减少CH₄排放. 以往研究也发现在湖泊底泥^[14]和水稻土^{[9, 15]}中运行MFCs也能够减少CH₄排放. 但本研究的创新之处在于清楚地展示了不同水稻生长期包括苗期、 分蘖期、 晒田期、 灌浆期和成熟期的CH₄排放通量和累积排放量，有利于揭示运行MFCs减少CH₄排放的机制.

添加0.5%稻秆的土壤产电电流上升较快，且电流峰值较高； 而不添加稻秆土壤的产电电流则上升缓慢，且维持在较低的电流水平. 这是因为添加稻秆的土壤含有更多有机质，因而更有利于产电菌生长和产电能力的提升^[16]. 在MFCs运行过程中，产电菌在阳极表面逐渐富集和驯化，产电电流逐步提高，经过一段时间后达到峰值，之后，产电电流有所降低. 这与非连续流MFCs产电特征相似，即产电出现峰值后下降^{[17, 18]}. 主要原因包括可利用有机碳浓度降低，以及MFCs阳极表面的产电菌在产电过程中厌氧分解有机质产生H⁺，导致土壤pH降低，从而抑制产电菌的活性^[19]. 晒田期土壤干燥，MFCs暂停运行. 原因在于阳极附近有机质分解产生的H⁺需要在水溶液中才能向阴极迁移，土壤干燥条件下，H⁺无法迁移^[20]，根据电荷平衡的原理，电子也就不能从阳极流向阴极. 另外，产电菌属于厌氧菌，生长和富集通常需要在淹水的厌氧环境中，而且MFCs闭路运行有利于产电菌在阳极表面的富集和驯化^[21]. 晒田期MFCs停止运行，并且干燥、 好氧的土壤环境不利于产电菌生长，从而产电菌活性会受到抑制^[22]. 进入灌浆期虽然土壤再次淹水，但产电电流仅维持在很低水平，很可能与晒田期产电菌受到胁迫有关.

添加0.5%稻秆的土壤CH₄排放通量较大，且峰值出现在分蘖期，而不添加稻秆处理的峰值则推迟至晒田期的前期. 已有的研究也表明，添加外源有机物质能够加速和提高CH₄排放^[23]. 同时，添加0.5%稻秆的土壤的产电电流从第15 d开始大幅提升，至第29 d回落，与CH₄排放通量峰值时间一致. 已有的研究表明，产电菌通过分解有机底物进行产电，从而会与产甲烷菌争夺土壤有机质，产电菌Geobacter sulfurreducens对有机底物乙酸的亲和系数K_s只有10 μmol ·L^-1，远低于产甲烷菌Methanosaetaceae(160 μmol ·L^-1)和 Methanosarcinaceae(3 mmol ·L^-1)^{[11, 24, 25]}. 本研究添加稻秆同步促进了产电菌活性和产甲烷菌活性，造成产电菌与产甲烷菌的活跃时间重合，从而活跃的产电菌能够有效地抑制CH₄产生. 而对于不添加稻秆的处理，运行MFCs没有显著减少CH₄排放，可能的原因有3点：①由于缺乏有机底物，产电菌活性较低，产电较为微弱，因此与产甲烷菌争夺有机底物的能力稍显不足； ②有机底物较少造成CH₄排放和产电的峰值推迟出现，MFCs产电电流在分蘖期处于上升阶段，而CH₄排放的峰值出现在MFCs运行暂停的晒田期，表明MFCs可能错过了抑制CH₄排放的最佳时机； ③ MFCs运行98 d之后，土壤pH相较于开路处理显著降低. 但不添加稻秆处理的土壤pH下降幅度较小，而添加0.5%稻秆的处理产电较多，pH下降幅度较大. 以往的研究表明，pH降低会抑制产甲烷菌活性^[26]，因而不添加稻秆处理的抑制效果较差.

本研究还从水稻株高、 地上和地下部分生物量，以及籽粒产量这3个方面显示运行MFCs过程对水稻生长无显著影响. 另外，运行MFCs减少稻田CH₄排放的优势还在于该方法不需要使用任何化学药剂，也不需要直接的能源投入，相反MFCs还能产生少量电能. 因此MFCs可以作为一种潜在的绿色可持续的减排方法. 本研究采用的是成本较低的单室无膜构型的MFCs，该构型利用阳极上方覆盖的土壤来阻隔水中溶解氧向阳极的扩散^[27]，作者前期的研究表明，阴极附近水中溶解氧约为7 mg ·L^-1，而当阳极上方的土壤厚度达到5 cm时，阳极表面的溶解氧浓度能降低到0.06 mg ·L^-1以下^[19]. 对比采用双室构型MFCs的研究^[10]，本研究采用的MFCs构型省去了成本较高的阳离子交换膜，同时能够实现良好的产电和减排效果. 鉴于目前采用MFCs进行温室气体减排的研究较少，尚需要更多的研究验证减排效果，以及探索进一步提高减排效果和降低MFCs构建和运行成本^[28].

添加稻秆会促进土壤的CH₄排放，而运行MFCs能够显著降低CH₄排放. 在水稻生长过程中，MFCs产电电流和土壤CH₄排放通量都在分蘖期逐步达到峰值，并且运行MFCs显著降低了苗期和分蘖期CH₄累积排放通量，原因可能与活跃的产电菌和产甲烷菌竞争土壤有机底物有关. MFCs运行98 d后，水稻株高、 地上和地下部分生物量，以及籽粒产量未受显著影响. 加之运行MFCs不使用化学药剂也不消耗能源，因此本研究为稻田CH₄减排提供了一种潜在的绿色可持续的技术方法.