据统计^[1]，我国2013年城市生活垃圾卫生填埋量约10 492.7万t，占生活垃圾总清运量的60.87%，可见填埋仍然是我国垃圾处理的主要方式. 传统卫生填埋因存在垃圾稳定化时间长，渗滤液难处理等难题，相应发展而来了生物反应器填埋技术^{[2, 3, 4, 5, 6]}. 生物反应器填埋场中的序批式生物反应器填埋场通过新老填埋单元间渗滤液的交叉回灌实现了渗滤液的原位反硝化-异位硝化脱氮，并取得了良好的脱氮效果^[7]. 目前关于序批式生物反应器填埋场的研究多集中在垃圾稳定化、 渗滤液脱氮、 填埋气产生方面^{[8, 9, 10, 11]}. 由于能够加速垃圾稳定化和实现渗滤液原位脱氮，序批式生物反应器填埋技术越来越受到重视，在填埋场构造和功能设计，有机物降解以及稳定特性和机制等方面人们做了很多研究. 但是，关于序批式生物反应器填埋场脱氮功能菌群落多样性的研究鲜见报道. 微生物是垃圾稳定化过程的主体，生活垃圾在各种微生物的综合作用下发生降解，垃圾填埋体经过复杂的降解历程和内环境的改变，填埋体内的微生物群落结构也经历同步的变化，至垃圾稳定化后期，垃圾填埋体内的功能微生物群落结构也趋于稳定. 在生物反应器填埋场系统内主要发生的氮循环过程有硝化、 反硝化作用. 氨单加氧酶(AMO)和氧化亚氮还原酶(Nos)分别是公认的微生物硝化、 反硝化过程中重要的功能酶. 因此，编码这两种酶的amoA基因和nosZ基因的序列多态性被广泛用作功能标志基因来研究环境样品中硝化细菌和反硝化细菌的群落多样性^{[12, 13]}. 近年来，分子生物学技术已被广泛应用于各种环境样品微生物的研究中^{[14, 15, 16, 17]}，而利用“PCR-RFLP-高通量测序”技术对序批式生物反应器填埋场脱氮功能菌群落多样性的研究报道较少.

本研究通过建立与脱氮功能微生物紧密相关的功能基因(amoA、 nosZ)克隆文库，分析序批式生物反应器填埋场垃圾稳定化后期的主要脱氮功能微生物的群落结构组成情况，通过深入了解垃圾稳定过程中主要脱氮功能微生物的多样性，探讨反应器可能存在的脱氮途径，以期为序批式生物反应器填埋场的运行提供重要的理论依据.

固体垃圾样品分别取自本课题组前期序批式生物反应器填埋场模拟装置^[18]内填埋垃圾稳定化后期的矿化垃圾(1号)、 新鲜垃圾(2号)，取样时从上、 中、 下这3个取样口各取约3-5 g填埋垃圾混合提取样品基因组. 1号样品基因组用于构建amoA克隆文库； 2号样品基因组用于构建nosZ克隆文库. 1.2 样品总DNA的提取

采用E.Z.N.A.^TM土壤DNA提取试剂盒(OMEGA)的方法，获得纯度和含量较高的DNA模板，可进一步供PCR扩增使用.

对提取的总DNA模板(1号、 2号)分别采用amoA-1F(5′-GGGGTTTCTACTGGTGGT-3′)/amoA-2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTCTTC-3′)^[19]和nosZ-F(5′-CGYTGTTCMTCGACAGCCAG-3′)/nosZ1622R(5′-CGSACCTTSTTGCCSTYGCG-3′)^[20]引物对进行功能基因特异性扩增.

PCR反应采用PCR仪(Blue marlin公司TC-960F型)进行. PCR体系为50 μL，包括：2×Mix(25 μL)、 ddH₂O(19 μL)、 amoA-1F/nosZ-F(2 μL)、 amoA-2R/nosZ1622R(2 μL)、 DNA(2 μL).

amoA基因的PCR程序为：95℃预变性15 min、 94℃变性60 s、 57℃退火45 s、 72℃延伸45 s、 完成36个循环； 72℃延伸10 min； 4℃保存.

nosZ基因的PCR程序为：94℃预变性10 min、 94℃变性45 s、 60℃退火45 s、 72℃延伸90 s、 完成36个循环； 72℃延伸10 min； 4℃保存.

通过低熔点琼脂糖凝胶电泳观察PCR结果，使用E.Z.N.A琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒(OMEGA)进行目的基因的回收、 纯化.

纯化后PCR产物通过T4连接酶克隆试剂盒(Thermo)连接到Ptz57R/T载体，转化入TOP10大肠杆菌感受态细胞. 在涂有X-gal和IPTG的氨苄霉素的LB平板上进行蓝白斑筛选. 随机挑取阳性克隆子，采用菌体直接扩增方式，采用Ptz57R/T Vector通用引物M13/PUC R和M13/PUC F的PCR扩增进行插入片段的筛选，重新获得目标基因. 通过1.0%的琼脂糖凝胶电泳观察PCR结果.

用4碱基限制性核酸内切酶HhaⅠ对各克隆子重组质粒PCR得到的amoA和nosZ基因片段进行酶切反应，经电泳、 凝胶成像得到酶切图谱，并对凝胶电泳图谱进行分析，将每个酶切分型结果作为一个OTU (operational taxonomic unit).

选取PCR-RFLP筛选出的阳性克隆子，送上海桑尼生物科技有限公司进行序列测定. 测序所得序列通过BLAST程序在GenBank数据库中进行相似细菌序列搜索，得到与测序结果亲缘关系最近的菌，并确定其进化地位与所属类别. 用Clustal-X进行序列比对^[21]，利用MEGA程序中的邻位相接法(Neighbor-joining Method)构建系统发育树. 拓扑分析为1 000次重复取样结果，生成的发育树采用Treeview重建.

生活垃圾化学组分复杂，能否成功提取目标DNA片段及提取效率的高低直接影响后续RFLP分析. 从样品中提取的DNA通过琼脂糖凝胶电泳检验，得到的条带亮度和清晰度较好，没有出现拖尾现象，说明所提取的基因组纯度较高，符合高通量测序对样品的要求. 以样品总DNA为模板，分别进行amoA和nosZ基因的特异性扩增. 为减少PCR反应的随机误差，对模板进行平行PCR反应，经PCR反应，获得了样品中amoA和nosZ功能基因目的片段，长度分别约490 bp和470 bp，且亮度和纯度都比较好. amoA基因的扩增未出现非特异性条带，nosZ基因虽有部分非特异性条带，但不影响下一步纯化，且阴性对照均未有产物出现，说明PCR扩增效果良好，可进行下一步纯化步骤. 将所有的扩增产物电泳目的条带全部回收纯化进行下一步研究.

经蓝白斑筛选，amoA及nosZ文库分别得到160个和70个白色克隆子，采用菌体直接扩增的方式进行PCR以验证插入片段的大小，PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳检测(图 1). 从图 1中amoA电泳图可以看出，菌落PCR产物片段长度在600 bp左右，整体来看，电泳图谱条带均一且信号较强，但也有部分菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳条带信号较弱且不均一，同时也存在一些假阳性克隆，对于此类克隆子，应予以舍弃. 经菌落PCR排除后，共得到转化成功的重组克隆子146个，阳性率91.3%. 从图 1中nosZ电泳图可以看出，菌落PCR产物片段长度也在600 bp左右，经菌落PCR排除假阳性克隆后，共得到转化成功的重组克隆子60个，阳性率85.7%.

图 1

Fig. 1

图 1 amoA、 nosZ克隆文库部分菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳图谱 Fig. 1 Agarose gel electrophoresis images for part of PCR products of clone libraries of amoA and nosZ genes

amoA、 nosZ克隆文库部分菌落PCR产物酶切产物琼脂糖凝胶电泳图谱如图 2所示. 从中可以看出，amoA克隆文库经酶切之后，酶切产物凝胶电泳条带较丰富，且位置差异性较大，能够达到区分不同微生物的目的，而nosZ克隆文库经酶切之后(为操作方便，经菌落PCR验证转化失败的重组质粒PCR产物仍进行酶切，只是不进行酶切分型结果统计)，酶切产物凝胶产物电泳图谱条带位置虽不明显，分析可能是由于电泳条件或拍照条件不佳造成，但仍可以区分不同基因型的微生物. 经过酶切RFLP分型后，amoA克隆文库146个克隆子被分为20个OTUs，nosZ克隆文库60个克隆子被分为13个OTUs.

图 2

Fig. 2

图 2 amoA、 nosZ克隆文库部分菌落PCR产物酶切图谱 Fig. 2 Agarose gel electrophoresis of part of the restriction fragment length profiles of PCR products of clone libraries of amoA and nosZ genes

常用的表征微生物多样性的指数有香农多样性指数(Shannon diversity index，H′)、 辛普森指数(Simpson index，D)、 丰富度(species richness，R)和均匀度(species evenness，E)，这些微生物多样性指数均能从不同侧面反映克隆文库微生物多样性^[21](表 1). 此外，覆盖度^[22](coverage value，C)理论上体现样品中微生物的覆盖程度，其数值越大，所构建的克隆文库包含的样品中的微生物种类就越多，因此越能真实地反映该样品中微生物多样性特征.

表 1(Table 1)

表 1 克隆文库多样性指数表 Table 1 Diversity index of the clone library 克隆文库类型 总克隆子数/个 OTUs/个 C/% H′ D E/% R amoA 146 20 95 2.44 0.89 81 3.81 nosZ 60 13 95 1.98 0.78 76 2.93

表 1 克隆文库多样性指数表 Table 1 Diversity index of the clone library

Kemp等^[23]研究发现即使再大的克隆文库都不能囊括环境样品中的所有微生物，理论上来讲，当覆盖度超过80%即可认为该克隆文库具有较高的库容. 从表 1可以看出，两个基因的克隆文库覆盖率都在90%以上，说明构建的基因文库覆盖了研究环境中大部分的微生物，能够较为准确地反映矿化垃圾和新鲜垃圾反应器中微生物的群落结构和多样性特征. 均匀度(species evenness，E)是指生境中全部物种个体数目的分配状况，它反映的是各物种个体数目分配的均匀程度，本研究中amoA与nosZ的均匀度指数分别为81%、 76%，说明矿化垃圾和新鲜垃圾系统内细菌分布相对均匀，优势物种种类和数量不多.

将amoA基因文库经RFLP分析获得的20个OTUs中各选择一个对应的克隆子进行序列测定，采用BLAST软件对所获得克隆子序列与GenBank中的已知序列相似性进行了比对(表 2)，利用Mega 5.05软件构建系统进化树(图 3). 一般来说，当微 生物的16S rDNA同源性达到97%或以上时，可以

表 2(Table 2)

表 2 amoA克隆文库基因测序比对结果 Table 2 Inventory of sequence alignment for clone library of amoA gene OTU编号 GenBank中的相似菌株 分类地位及来源 相似度/% 登录号 克隆子所占百分比/% A1 Uncultured bacterium clone BB-6 Bacteria； environmental samples 98 KF878009.1 0.68 A2 Uncultured bacterium clone DU42 Bacteria； environmental samples 100 KF619241.1 2.74 A3 Uncultured bacterium clone DU1 Bacteria； environmental samples 99 KF619200.1 11.64 A4 Uncultured ammonia-oxidizing bacterium clone LSTE-AOB19 Bacteria； environmental samples 99 KC773946.1 0.68 A5 Uncultured bacterium clone 3b34 Bacteria； environmental samples 99 KJ093879.1 19.18 A6 Uncultured ammonia-oxidizing bacterium clone BXA-107 Bacteria； environmental samples 99 EU624936.1 0.68 A7 Uncultured bacterium clone 5b33 Bacteria； environmental samples 99 KJ093955.1 0.68 A8 Uncultured bacterium clone 3b30 Bacteria； environmental samples 98 KJ093875.1 6.85 A9 Uncultured bacterium clone 3b30 Bacteria； environmental samples 99 KJ093875.1 0.68 A10 Uncultured ammonia-oxidizing bacterium clone L2wAMO34 Bacteria； environmental samples 100 JX157953.1 1.37 A11 Uncultured bacterium clone 3b7 Bacteria； environmental samples 99 KJ093852.1 1.37 A12 Uncultured ammonia-oxidizing bacterium clone NPM-393 Bacteria； environmental samples 99 HQ875323.1 4.79 A13 Uncultured bacterium clone LZBBC-AOB-BC1 Bacteria； environmental samples 99 KF179484.1 2.05 A14 Uncultured bacterium clone BNamo30 Bacteria； environmental samples 99 HQ190104.1 8.90 A15 Uncultured ammonia-oxidizing bacterium clone NPM-454 Bacteria； environmental samples 99 HQ875320.1 15.75 A16 Uncultured bacterium clone SNAD_amoA_9 Bacteria； environmental samples 99 KC569477.1 0.68 A17 Uncultured ammonia-oxidizing bacterium clone J40120839_B1B_22_M13F Bacteria； environmental samples 99 KJ497772.1 12.33 A18 Uncultured ammonia-oxidizing bacterium clone lj-aob14 Bacteria； environmental samples 99 KJ081658.1 6.85 A19 Uncultured Nitrosomonas sp. clone NT5 Bacteria； Proteobacteria； Betaproteobacteria； Nitrosomonadales； Nitrosomonadaceae； Nitrosomonas 98 EU221321.1 1.37 A20 Uncultured ammonia-oxidizingbacterium clone AOB-HM3-83 Bacteria； environmental samples 96 JX140558.1 0.68

表 2 amoA克隆文库基因测序比对结果 Table 2 Inventory of sequence alignment for clone library of amoA gene

图 3

Fig. 3

采用Neighbor-joining法建树，本文中的参照细菌序列引自GenBank数据库，括号中的数字代表提交序列号， 分支节点上的数字表示每1 000次bootstrap分析所支持的次数，线段表示2%序列差异的分支长度 图 3 amoA基因的系统发育树 Fig. 3 Phylogenetic tree of amoA gene

将这些菌划为一个种； 同源性达到94%或以上时，可以将这些菌划为一个属^[24].

根据克隆子数占克隆子总数的比例，可划分菌群的优势种群和次要优势种群. 克隆子百分比大于5%的OTUs为该菌群的优势种群^[25]，对照表 2，含amoA基因的菌群中共有7个优势菌群(A3、 A5、 A8、 A14、 A15、 A17和A18). A8和A9两基因型通过序列比对之后，与Uncultured bacterium clone 3b30在核苷酸水平上的相似度分别为98%和99%，这可能是由于TA克隆无法控制外源片段的插入方向，导致两个重组子的插入序列正好相反，造成酶切条带的不同. 此外，除OTU-A19中的2个克隆子经比对后与Uncultured Nitrosomonas sp. clone NT5的相似度为98%，归属于β-变形菌纲(Proteobacteria)的亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)外，文库中其他OTUs的克隆子在GenBank中未找到与其相似的已知细菌序列，属于未知类群. 说明矿化垃圾中仍有许多未经纯培养得到分离鉴定的物种，因此不能得知这些基因序列所属细菌的具体分类信息. 本研究建立的amoA克隆文库中大部分的克隆子都属于未鉴定的细菌，可能是由于目前对垃圾填埋场内部微生物群落研究较少，也说明垃圾填埋场内部存在大量微生物新类群.

从图 3可知，克隆文库中amoA基因划分为3个簇，第I簇最大，除A10、 A13、 A14、 A16和A19这5个OTUs外，其余的15个OTUs都在第I簇，均为不可培养或未经分离获得的未知氨氧化细菌类群，且彼此间亲缘关系很近，可见它们均在同一分类地位，如A1、 A5、 A2、 A15、 A12细菌从进化树分析，亲缘关系很近，若考虑测序时碱基对误差，它们可能属于同一未知氨氧化细菌. 第Ⅱ簇中的序列都为GenBank中已鉴定出来的氨氧化细菌基因，并没有包括本研究中的OTUs，这说明本研究建立的文库中氨氧化细菌与已鉴定的氨氧化细菌进化关系较远，可以推断出垃圾填埋系统内氨氧化细菌群落可能与其他环境中氨氧化细菌种群略有不同. A10、 A14、 A16和A19

这4个OTUs分布于第Ⅲ簇，其中A19和A16在系统发育树的同一分支上，可以推断出A16和A19可能同属于β-Proteobacteria门下Nitrosomonas属，A10、 A14和Nitrosomonas nitrosa(登录号AF272404)在发育树的同一分支，说明A10和A14可能也归属于Nitrosomonas属. 由此推定本研究克隆得到的氨氧化细菌可能都属于β-Proteobacteria门下的Nitrosomonas属.

环境样品中常见的氨氧化细菌分属于Nitrosomonas和Nitrosospira属^[26]，虽然本研究建立的amoA基因克隆文库序列对比结果显示与amoA最相似的是未鉴定菌种，但从系统发育树可以看出与其最相近的已知菌属为Nitrosomonas，这类微生物主要存在于土壤、 大部分海域、 湖泊、 河流和城市污水处理系统，最适宜生存在富有氨氮或无机盐的环境中. 朱爽^[27]在对填埋场脱氮微生物的

研究中也表明填埋场内的氨氧化菌主要属于β-Proteobacteria门的欧洲亚硝化单胞菌簇，与本研究结果相一致，说明序批式生物反应器填埋场稳定期矿化垃圾单元中氨氧化细菌以Nitrosomonas属为主，由Nitrosomonas属的微生物负责进水渗滤液中氨的氧化. 此外Nitrosomonas sp.在氨氮转化为羟胺的过程中起主导作用，也是造成反应器内亚硝酸盐积累(此时矿化垃圾单元进水渗滤液NO₂^--N小于0.5 mg ·L^-1，出水NO₂^--N约为6.0 mg ·L^-1)，温室气体N₂O排放增加^[28]，影响系统内含氮污染物转化途径的关键菌属.

将nosZ基因文库经RFLP分析获得的13个OTUs中各选择一个对应的克隆子进行序列测定，采用BLAST软件对所获得克隆子序列与GenBank中的已知序列相似性进行了比对(表 3).

表 3(Table 3)

表 3 nosZ克隆文库基因测序比对结果 Table 3 Inventory of sequence alignment for clone library of nosZ gene OTU编号 GenBank中的最相似菌株 分类地位及来源 相似度/% 克隆子所占百分比/% 登录号 N1 Uncultured bacterium isolate DGGE gel band HZ9D Uncultured bacterium； environmental samples 83 6.67 AY577571.1 N2 Uncultured bacterium clone B42_31 Uncultured bacterium； environmental samples 92 16.67 JF310456.1 N3 Uncultured denitrifying bacterium clone 46-nosZ-LZB Uncultured bacterium； Estuarine Sediments 89 3.33 JX465249.1 N4 Uncultured bacterium clone Buji5-1 Uncultured bacterium； landfill leachate treatment plant 90 5.00 GU362753.1 N5 Bacillus thuringiensis chiA gene for exochitinase,strain SBS-BT6 Firmicutes； Bacillaceae； Bacillus 98 3.33 HG792452.1 N6 Thiobacillus denitrificans ATCC 25259 Betaproteobacteria； Hydrogenophilales； Hydrogenophilaceae； 95 6.67 CP000116.1 N7 Bacterium enrichment culture clone En_UW_15 Uncultured bacterium； environmental samples 91 1.67 HQ630167. N8 Bacillus thuringiensis chiA gene for exochitinase,strain SBS-BT6 Firmicutes； Bacillaceae； Bacillus 100 5.00 HG792452.1 N9 Uncultured bacterium clone ISA00218 Uncultured bacterium； paddy soil 89 1.67 FJ209407.1 N10 Uncultured bacterium clone Buji3-5 Uncultured bacterium； Landfill leachate treatment plant 95 1.67 GU362738.1 N11 Thauera phenylacetica strain TN9 Proteobacteria； Rhodocyclales； Betaproteobacteria； 88 3.33 JQ319501.1 N12 Thauera sp. MZ1T Proteobacteria； Rhodocyclales； Betaproteobacteria； 89 3.33 CP001281.2 N13 Uncultured bacterium clone DaS36 Uncultured bacterium； activated sludge 90 41.67 HQ625230.1

表 3 nosZ克隆文库基因测序比对结果 Table 3 Inventory of sequence alignment for clone library of nosZ gene

由表 3可知，反硝化菌的nosZ基因序列与已知序列相似度较低，基本在83%-95%之间. 而朱爽^[27]以nosZ基因作为分子标记研究垃圾填埋场中脱氮微生物群落结构也得出了一样的结论，这说明填埋场中参与氮素循环的微生物群落结构相当复杂. OTU-N13占克隆子总数的41.67%，是文库中最大的优势种群，它与GenBank中Uncultured bacterium clone DaS36的相似度为90%，与数据库中已知菌Thauera sp. MZ1T的同源性为89%，且与Thauera phenylacetica strain TN9的同源性为88%，归属于β-Proteobacteria纲的红环菌科(Rhodocyclales). OTU-N2占克隆子总数的16.67%，与数据库中Uncultured bacterium clone B42_31的相似度为92%，且与数据库中已知菌Bradyrhizobium japonicum USDA和Bradyrhizobium japonicum的同源性为91%，归属于α-Proteobacteria纲的慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae).

可见，nosZ基因多样性较为丰富，包含β-Proteobacteria纲和厚壁菌门(Firmicutes)的细菌序列，属水平的多样性更高，包括β-Proteobacteria纲的陶厄氏菌属(Thauera)和硫杆菌属(Thiobacillus)、 Firmicutes门的芽孢杆菌属(Bacillus). 其在GenBank中的最相似基因来源广泛，OTU-N9来源于水稻田，OTU-N4和OTU-N10来源于渗滤液处理装置，OTU-N13来源于活性污泥，OTU-N3来源于河口沉积物，其他的OTUs均来自于自然环境，由于鉴定技术的限制，大部分的OTUs还没有具体的分类地位. 反硝化细菌在自然界分布广泛，绝大多数的已报道的反硝化细菌分布于Proteobacteria门，除了δ-Proteobacteria纲外，其余的α、 β、 γ和ε这4个纲都含有反硝化菌. 本研究发现的反硝化菌主要分布在β-Proteobacteria的Thauera和Thiobacillus属. Thauera是一类在有机物降解、 脱氮过程中都起重要作用的菌属，在好氧条件下具有反硝化特性，它在多种环境中都能检测到. 此外本次测序得到的归属于Thiobacillus的脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)是一类硫自养反硝化菌. Onay等^[29]发现将硝化渗滤液回灌至填埋场厌氧反应器中，在易降解有机物去除后，自养反硝化菌可以利用氧化态硫为电子供体进行反硝化作用. 可见新鲜垃圾单元垃圾稳定化后期不仅存在异养的好氧反硝化途径，当碳源不足时也存在厌氧的自养反硝化的脱氮途径.

(1)克隆文库分析结果显示，序批式生物反应器填埋场垃圾稳定化后期的矿化垃圾反应器中检测到的氨氧化细菌大部分为未知类群，且均为不可培养菌或未经分离获得的细菌，经系统发育树分析系统内氨氧化细菌可能以β-Proteobacteria门中的Nitrosomonas为主. Nitrosomonas在氨氮转化为羟胺的过程中起主导作用，是造成反应器内亚硝酸盐积累，影响系统内含氮污染物转化途径的关键菌属.

(2)序批式生物反应器填埋场稳定化后期的新鲜垃圾反应器中反硝化细菌种群丰富，主要反硝化菌有β-Proteobacteria纲中的Thauera和Thiobacillus属. Thauera属在好氧条件下具有反硝化特性，Thiobacillus中的脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)是一类硫自养反硝化菌，可见新鲜垃圾单元稳定化后期主要的脱氮途径为好氧反硝化和自养反硝化. 此外文库中存在一部分反硝化细菌可能归属于α-Proteobacteria纲的慢生根瘤菌科(Bradyrhizobiaceae).