土壤污染是当今世界主要的环境问题之一，土壤中的污染物不仅对土壤生态系统造成危害，而且可以通过植物富集进入食物链，或者通过渗透和流失污染地下水和饮用水源，从而对人类健康造成威胁. 因此，污染土壤修复一直是环境科学和工程领域关注和研究的热点之一. 石油以及多环芳烃(PAH)、 农药、 炸药等持久性有机污染物(POPs)一直是国内外污染土壤修复研究中的重点^{[1, 2, 3, 4]}. 我国的土壤修复研究主要集中于原油及石油烃类污染土壤^{[5, 6, 7]}. 土壤生物原位修复技术具有费用低、 效果好、 无二次污染、 环境影响小等优点，获得广泛的研究和应用. 在生物强化土壤原位修复中，菌株的选择是核心问题之一^[8]，构建并应用基因工程菌株逐渐受到重视和关注^[9,10].

基因工程菌株在土壤中的留存迁移是决定其生物修复效果的主要因素之一. 基因工程菌的留存密度对其在土壤中的生存和建立稳定种群具有重要影响^[11]. 基因工程菌在水力饱和及非饱和的土壤孔隙中迁移过程存在很大差异. 一些研究考察了饱和或非饱和条件下细菌细胞在多孔介质中的迁移情况^{[12, 13, 14, 15]}，认为孔隙结构、 介质粒度、 营养条件、 离子强度等是影响迁移过程的重要因素^{[16, 17, 18]}，但所用多孔介质多为石英砂或其它颗粒填充床，而非实际土壤.

阿特拉津(atrazine)是应用最为广泛的除草剂，在世界各地用量很大，土壤残留严重，是农药污染土壤修复中最受关注的污染物之一. 阿特拉津是POPs物质，也是潜在的内分泌干扰物. 阿特拉津在华北平原耕作土壤中也有施用和残留，是河北省第一次农业污染源普查中关注的主要农药污染物之一. 物理化学^{[19, 20]}及生物修复方法^{[21, 22, 23, 24]}均被应用于阿特拉津污染土壤修复，其中在生物强化修复研究中多采用野生阿特拉津降解菌株，基因工程菌株应用研究不多.

本研究在华北平原饱和耕作土壤中，考察了土壤性质和孔隙水流条件对1株阿特拉津降解基因工程菌留存迁移的影响，以期为实施基因工程菌强化阿特拉津原位土壤生物修复提供参考依据.

本研究使用的基因工程菌受体细胞为大肠杆菌DH5α，质粒载体为pACYC184和pUC18-gfp，分别携带阿特拉津脱氯水解酶基因和绿色荧光蛋白基因，对氯霉素有抗性^[25].

挑单菌落于LB培养基中(含25 μg ·mL^-1氯霉素)，在37℃，120~140 r ·min^-1摇床转速下培养过夜，离心，磷酸缓冲液(pH 7.0)洗涤，收获细胞，制成菌悬液备用.

本研究选取华北平原地区0~20 cm的表层耕作土壤样品(取自河北科技大学新校区附近麦田)作为研究对象，并选取0~20 cm的表层林地土壤样品(取自河北科技大学中校区景观林带)作为对照，土壤样品性质采用标准方法测定^[26]，如表 1所示. 土壤密度为2.65g·cm^-3.

表 1(Table 1)

表 1 土壤样品基本性质 Table 1 Essential properties of soil samples 项目 含水率/% 有机质含量/% pH值 机械组成/% 砂粒 粉粒 黏粒 耕作土壤 9.42 1.03 7.1 21.85 30.02 48.13 林地土壤 3.36 1.77 7.0 41.25 26.25 32.50

表 1 土壤样品基本性质 Table 1 Essential properties of soil samples

将土壤筛分为 < 0.6 mm、 0.6~2 mm和 > 2 mm这3种粒径范围的样品，按照一定的容重填充至土壤微系统的土壤柱中，土壤微系统如图 1所示. 土壤柱内径为2 cm，长度为2、 4、8、12和16 cm. 填充后上下颠倒并强烈振荡柱体，以使不同长度土壤柱内填充程度尽量均匀一致. 土壤柱填充后采用过量的0.01 mol·L^-1的CaCl₂溶液饱和并排出土壤孔隙中的气体.

图 1

Fig. 1

图 1 土壤微系统示意 Fig. 1 Profile of the soil microcosm system

将基因工程菌细胞悬液稀释至10⁸ CFU ·mL^-1，然后通过蠕动泵在一定的入渗流量下注入饱和土壤柱，使菌悬液流过不同长度的土壤柱，在土壤柱末端收集淋出液，并检测淋出液中基因工程菌的细胞密度，以此表征菌悬液流至不同土壤柱高度时，基因工程菌在土壤中的迁移和留存状况.

研究中最小入渗流量为1.25 mL ·min^-1，在此条件下，所有土壤柱的存水量大于土壤柱的孔隙体积，保证土壤柱为饱和流. 根据Darcy定律计算不同条件下土壤柱水力传导率常数，以反映土壤性质差异以及土壤孔隙变化对土壤孔隙水流的影响.

基因工程菌密度利用抗生素抗性(含25 μg ·mL^-1氯霉素)LB培养基平板，采用稀释平板法测定. 采用无菌管收集土壤淋出液，然后稀释至一定的浓度后测定. 每个样品取3个稀释度，每个稀释度取2个平行样，涂布于选择性培养基平板上，37℃培养24 h后计数，菌落数目取平均值. 土壤和淋出液中基因工程菌细胞采用荧光显微镜进行原位观察.

微生物在土壤中的迁移和留存主要受到土壤吸附、 对流弥散过程和过滤过程的影响. 在流量为1.25 mL·min^-1，长度为4 cm的土壤柱中，检测不同时间土壤淋出液中的基因工程菌密度，以考察饱和流条件下迁移的主要机制，结果如图 2所示.

图 2

Fig. 2

图 2 淋出液中基因工程菌密度随时间的变化 Fig. 2 Variation of GEM density in the leachate with time

可以看到，淋出液中基因工程菌密度随时间逐渐降低. 如果土壤吸附起主要作用，淋出液中的基因工程菌密度应随时间逐渐增大. 同时，对实验后的土壤原位观察发现，土壤颗粒表面基因工程菌细胞很少，而在土壤颗粒空隙水中细胞较多. 可见，在饱和流条件下，平流渗透是基因工程菌迁移的主要形式，过滤过程是细胞留存的主要机制，因此，可以采用过滤模型来描述此条件下基因工程菌的迁移过程，如式(1)、 (2)所示.

式中，C是细胞密度，x是土壤柱深度，C₀为x=0时细胞密度，λ是过滤系数.

土壤特性对孔隙结构和孔间水流具有显著影响，是影响基因工程菌的迁移重要因素，因此考察了土壤粒径、 孔隙率和机械组成对基因工程菌迁移的影响.

将 < 0.6 mm、 0.6~2 mm、 > 2 mm这3种粒径范围的耕作土壤，按照容重为1.0 g ·cm^-3(孔隙率为62.3%)填充至土壤柱，菌悬液在1.25 mL·min^-1的入渗流量下通过土壤柱，检测淋出液细胞密度，结果如图 3所示. 可以看到，随着填充土壤粒径的增大，土壤淋出液细胞密度呈现增大的趋势，基因工程菌平流迁移增强，过滤留存作用减小.

图 3

Fig. 3

图 3 不同粒径土壤柱淋出液基因工程菌密度随深度变化 Fig. 3 Variation of GEM density in the leachate with the soil columns depth at different soil particle sizes

用式(2)对图 3数据进行拟合，求得基因工程菌过滤系数，并根据Darcy定律计算土壤柱水力传导率常数，结果如图 4所示. 可以看到，随着粒径增大，土壤对基因工程菌的留存作用降低：粒径 < 0.6 mm时，基因工程菌过滤系数为0.269，而粒径 > 2 mm时，基因工程菌过滤系数仅为0.105.

图 4

Fig. 4

图 4 不同粒径土壤柱水力传导率常数和基因工程菌过滤系数 Fig. 4 Hydraulic conductivity constants and filtration coefficients of GEM in the soil columns at different soil particle sizes

尽管土壤柱的孔隙率相同，但粒径 > 2 mm的土壤柱孔间水流速度较快，水力传导率常数为6.70m·d^-1，明显高于粒径 < 0.6 mm土壤柱的5.38 m·d^-1，从而降低了基因工程菌的过滤留存作用. 此外，不同粒径土壤颗粒的团聚体稳定性也有差异，粒径 > 2 mm土壤颗粒的团聚体水稳性很高，可以达到78.4%，土壤孔隙结构受水流影响较小; 而粒径较小的土壤颗粒团聚体水稳性较差，在饱和流条件下逐渐发生解体，使得土壤孔径减小，进一步增强了基因工程菌的过滤留存作用.

将粒径范围为0.6~2 mm的土壤颗粒，按照容重为0.8、1.0和1.2 g·cm^-3填充至土壤柱，对应土壤柱孔隙率为69.9%、62.3%和54.7%. 菌悬液在1.25 mL ·min^-1的入渗流量下通过土壤柱，检测淋出液细胞密度，结果如图 5所示. 同样，用式(2)对图 5数据进行拟合，求得基因工程菌过滤系数，并计算土壤柱平均水力传导率常数，结果如图 6所示.

图 5

Fig. 5

图 5 不同孔隙率土壤柱淋出液基因工程菌密度随深度变化 Fig. 5 Variation of GEM density in the leachate with the soil columns depth at different soil porosities

图 6

Fig. 6

图 6 不同孔隙率土壤柱水力传导率常数和基因工程菌过滤系数 Fig. 6 Hydraulic conductivity constants and filtration coefficients of GEM in the soil columns at different soil porosities

可以看到，随着土壤孔隙率的减小，水力传导率常数降低，3种孔隙率土壤柱平均水力传导率常数分别为5.73、5.56和5.02m ·d^-1. 同时，淋出液基因工程菌密度亦随着土壤孔隙率的减小而降低，土壤柱对基因工程菌的过滤留存作用增强. 孔隙率为69.9%、62.3%和54.7%时，基因工程菌过滤系数分别为0.156、 0.250和0.274.

机械组成是土壤的重要性质，对土壤的孔隙结构具有显著影响. 如表 1所示，采用林地土壤作为对照，其机械组成与耕作土壤存在明显差异，耕作土壤的黏粒组分大于林地土壤，而砂粒组分小于林地土壤. 将粒径范围为0.6~2 mm的耕作和林地土壤颗粒，按照容重为1.0 g ·cm^-3填充至土壤柱. 菌悬液在1.25 mL ·min^-1的入渗流量下通过土壤柱，检测淋出液细胞密度，结果如图 7所示. 用式(2)对图 7数据进行拟合，求得基因工程菌过滤系数，并计算土壤柱平均水力传导率常数，结果如图 8所示.

图 7

Fig. 7

图 7 不同机械组成土壤柱淋出液基因工程菌密度随深度变化 Fig. 7 Variation of GEM density in the leachate with the soil columns depth at different soil mechanical compositions

图 8

Fig. 8

图 8 不同机械组成土壤柱水力传导率常数和基因工程菌过滤系数 Fig. 8 Hydraulic conductivity constants and filtration coefficients of GEM in the soil columns at different soil mechanical compositions

可以看到，土壤机械组成对孔隙水流和基因工程菌留存作用具有显著影响. 和耕作土壤相比，林地土壤团聚体中大粒径颗粒(砂粒)组分较高，有助于在饱和流条件下维持土壤孔径及其稳定性，因此水力传导率常数可以达到6.64m ·d^-1，高于相同条件下耕作土壤的5.56m ·d^-1. 因此，林地土壤对基因工程菌细胞的过滤留存作用明显小于耕地土壤，过滤系数仅为0.101.

将0.6~2mm粒径范围的耕作土壤颗粒，按照容重为1.0 g ·cm^-3(孔隙率为62.3%)填充至土壤柱，菌悬液在1.25、 2.4和6.0 mL ·min^-1的入渗流量下通过土壤柱，检测淋出液细胞密度，结果如图 9所示. 用式(2)对图 9数据进行拟合，求得基因工程菌过滤系数，并计算土壤柱平均水力传导率常数，结果如图 10所示.

图 9

Fig. 9

图 9 不同注入流量土壤柱淋出液基因工程菌密度随深度变化 Fig. 9 Variation of GEM density in the leachate with the soil columns depth at different input flows

图 10

Fig. 10

图 10 不同注入流量土壤柱水力传导率常数和基因工程菌过滤系数 Fig. 10 Hydraulic conductivity constants and filtration coefficients of GEM in the soil columns at different input flows

可以看到，随着入渗流量的增加，水力传导率常数增大，同时基因工程菌过滤系数减小，过滤留存作用降低. 3种入渗流量下土壤柱平均水力传导率常数分别为5.56、 5.75和6.44m ·d^-1; 基因工程菌过滤系数分别为0.250、 0.234和0.154.

以上研究结果表明，饱和土壤中，土壤性质和入渗流量影响土壤孔隙水流，改变水力传导率常数，进而影响基因工程菌在土壤中的迁移和留存. 不同条件下水力传导率常数和基因工程菌过滤系数的关系如图 11所示. 可以看到，水力传导率常数和基因工程菌过滤系数之间存在明显线性相关关系. 使用SPSS statistics 19软件对二者进行相关性分析，结果显示水力传导率常数和基因工程菌过滤系数之间具有显著负相关性(R=-0.928，P=0.000). 此结果进一步证实平流渗透是饱和土壤中基因工程菌迁移的主要机制.

图 11

Fig. 11

图 11 水力传导率常数和基因工程菌过滤系数关系 Fig. 11 Relationship between hydraulic conductivity constants and filtration coefficients of GEM

(1)在饱和耕作土壤中，平流渗透是基因工程菌迁移的主要机制，其过程可采用过滤模型拟合.

(2)土壤性质对孔隙水流和基因工程菌迁移具有显著影响. 随着土壤粒径、 孔隙率和土壤砂粒组分增加，水力传导率常数增大，过滤系数减小，土壤对基因工程菌过滤留存作用降低.

(3)土壤条件不变时，增加入渗流量也会增大水力传导率常数，减小过滤系数，降低土壤的过滤留存作用.

(4)饱和土壤中，水力传导率常数为5.02~6.70 m ·d^-1时，基因工程菌在土壤中的过滤系数为0.105~0.274，二者存在显著负相关关系.